專利名稱：一種水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)細(xì)菌耐藥性高通量檢測(cè)方法?？赏ㄟ^抗性藥物的不同選取，擴(kuò)展到其他細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)。
背景技術(shù)：
抗生素是用于治療各種細(xì)菌感染或抑制致病微生物感染的藥物。長(zhǎng)期以來，抗生素在人類生活與生產(chǎn)中，都起到了至關(guān)重要的作用，但重復(fù)使用一種抗生素可能會(huì)使致病菌產(chǎn)生耐藥性。我國(guó)是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，但近年來由于水產(chǎn)養(yǎng)殖污染加劇，造成養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量不斷惡化，病原生物種類增多和傳播速度加快，養(yǎng)殖病害日趨嚴(yán)重，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病害問題特別是細(xì)菌性病害在密集型養(yǎng)殖系統(tǒng)中發(fā)生頻繁且影響嚴(yán)重，這極大地限制了我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前病害防治的主要方法是使用抗生素類藥物，抗生素作為飼料添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中使用非常普遍。隨著抗生素類藥物不斷的大量使用，許多細(xì)菌都有了耐藥性，且情況日益嚴(yán)重，使得細(xì)菌性病害在水產(chǎn)養(yǎng)殖中更為嚴(yán)重，極大地限制了我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素這一現(xiàn)狀，建立水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌對(duì)抗生素藥物敏感性的檢測(cè)方法，揭示耐藥性細(xì)菌在漁業(yè)環(huán)境中的擴(kuò)散和傳播規(guī)律，對(duì)于評(píng)價(jià)細(xì)菌耐藥性的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)十分必要。有助于幫助人們正確使用抗生素，減少抗生素抗性基因的傳播，并對(duì)新抗生藥物的研發(fā)有一定的指導(dǎo)意義，從而確保我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，對(duì)于我國(guó)的生態(tài)安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。傳統(tǒng)的方法是利用抗性平板法篩選出抗性細(xì)菌，平板配置量大，還需測(cè)量抑菌圈大小。因此，以傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的方法評(píng)價(jià)抗性耗材、耗時(shí)、耗人力。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種快速、有效的檢測(cè)水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌耐藥性的方法，即水產(chǎn)細(xì)菌耐藥性高通量檢測(cè)方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)方法，包括如下步驟
(1)抗菌藥物貯備液的制備；
(2)菌液制備；
(3)以步驟(I)所得的抗菌藥物貯備液，制備抗生素工作溶液；
(4)將96孔微量滴定板放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；
(5)通過酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中，步驟(I)抗菌藥物貯備液的制備優(yōu)選如下操作方法
(1)稱取一定量的抗菌藥物； (2)加入MHB培養(yǎng)基稀釋藥物，使藥液終濃度為1024u g/ml ；(3)將抗菌藥物貯備液分裝于無菌小瓶中，最好置-80°C以下保存，有效期為半年。注意不能反復(fù)凍融。步驟(2)菌液的制備優(yōu)選如下操作方法
(1)將分離純化好的細(xì)菌，接種于MHB培養(yǎng)基中，28-37°C震蕩過夜培養(yǎng)；
(2)用MNB培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度，使其0D600值為0.4 (約為5X 108CFU/ml)，并稀釋到lX106CFU/ml。步驟(3)抗生素工作溶液的制備優(yōu)選如下操作方法
(1)在無菌96孔微量滴定板的每排第2孔中加入200ill終濃度為1024 ii g/ml的藥
液；
(2)在第3孔到第11孔中加入100u IMHB培養(yǎng)基；
(3)利用兩倍稀釋法，在每排中，用IOOiU移液器從每排第2孔中移出IOOiU液體加入到各自排的第3孔中進(jìn)行稀釋混勻，然后向后依次進(jìn)行稀釋混勻，直到每排的第11孔，每稀釋混勻一孔，換一次槍頭；
(4)在每排第I孔中加入200u IMHB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照；
(5)在每排第12孔中加入100u IMHB培養(yǎng)基和100 u I稀釋好的菌液作為正常生長(zhǎng)對(duì)照孔。(6)再在每排第2孔到第11孔中每孔加入IOOiU調(diào)好的稀釋菌液。這樣每排第
2孔到第 11 孔中藥液濃度分別為512 V- g/ml、256 u g/ml、128 u g/ml>64 u g/ml、32 u g/ml、16 u g/ml>8 u g/ml>4 u g/ml>2 u g/ml>I u g/ml。步驟(4)培養(yǎng)溫度在28-37°C，孵育16_24h。步驟(5)優(yōu)選如下操作方法
(1)通過酶標(biāo)儀設(shè)定0D600，讀取數(shù)據(jù)；
(2)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理用第2個(gè)孔到第12個(gè)孔的數(shù)值減去第I個(gè)孔(陰性對(duì)照)的數(shù)值；
(3)繪制折線 (4)確定最小抑制濃度拐點(diǎn)值即為最小抑制濃度；
(5)將最小抑制濃度與抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)進(jìn)行比較，從而確定敏感(S)、中度敏感(I)或耐藥(R)；
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的方法針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)均有效，也可擴(kuò)展到其他細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)。本發(fā)明結(jié)合96孔板(8X12)的規(guī)格，以及CLSI藥物濃度的范圍，選取了 8種抗生素藥物，10個(gè)濃度梯度進(jìn)行檢測(cè)。本方法對(duì)細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)無需使用平板，免去了大量配置培養(yǎng)基，制作藥敏紙片，測(cè)量抑菌圈等步驟，培養(yǎng)液用量小，實(shí)用性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，重復(fù)性好，靈敏度高，具有十分廣闊的應(yīng)用前景，可運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌耐藥性檢測(cè)和耐藥菌株的篩選及相關(guān)分析，具有很高的理論研究意義和實(shí)用價(jià)值。
圖I根據(jù)第11到第2個(gè)孔的OD值，繪制的折線圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I弗氏朽1檬酸桿菌Citrobacter freundii藥敏試驗(yàn)
稱取氯霉素(chloramphenicol)、甲氧節(jié)唳(Trimethoprim)、硫酸慶大霉素(gentamyciusulfate)、氟苯尼考(Florfenicol )、橫胺甲惡唑(sulfamethoxazole)> 橫胺11密唳(sulfadiazine)、四環(huán)素(Tetracycline)、卡那霉素(Kanamycin sulfate)8 種抗生素藥物，加入MHB培養(yǎng)基稀釋藥物，使藥液終濃度為1024 u g/ml，藥液經(jīng)過濾膜過濾，分裝于無菌小瓶中_80°C保存。將分離純化好的弗氏朽1檬酸桿菌，接種于MHB培養(yǎng)基中，30°C振蕩過夜培養(yǎng)。用MNB培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度，使終濃度為I X 106CFU/ml。在無菌96孔微量滴定板的第一排第2孔中加入200 ill終濃度為1024 y g/ml的氯霉素藥液；在第3孔到第11孔中加入IOOii I MHB培養(yǎng)基；利用兩倍稀釋法,用IOOii I移液器從第2孔中移出IOOiU液體加入到第3孔中進(jìn)行稀釋混勻，然后向后依次進(jìn)行稀釋混勻，直到第11孔，每稀釋混勻一孔，換一次槍頭；在第I孔中加入200iaMHB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照；在第12孔中加入IOOiUMHB培養(yǎng)基和100 ill稀釋好的弗氏檸檬酸桿菌菌液作為正常生長(zhǎng)對(duì)照孔；再在第2孔到第11孔中每孔加入IOOiU稀釋好的弗氏檸檬酸桿菌菌液。這樣第2孔到第11孔中藥液濃度分別為512 ii g/ml、256 ii g/ml、128 ii g/ml、64 ii g/ml>32 u g/ml、16 y g/ml>8 u g/ml>4 u g/ml>2 u g/ml> I u g/ml。按上述方法，在第二排到第八排，依次加入甲氧芐啶、硫酸慶大霉素、氟苯尼考、磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶、四環(huán)素、卡那霉素這7種抗生素藥物。將96孔板放在培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)18h。培養(yǎng)后的裝有菌液的96孔板，通過酶標(biāo)儀設(shè)定0D600，讀取數(shù)據(jù)(見表I);并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(見表2)，繪制折線圖(見圖I);確定最小抑制濃度，將最小抑制濃度與抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)進(jìn)行比較，從而確定敏感(S)、中度敏感(I)或耐藥(R)(見表3)。表I.酶標(biāo)儀設(shè)定0D600時(shí)，讀取的數(shù)據(jù)，其中I為陰性對(duì)照的OD值，2_11為不同抗生素藥物濃度下，的OD值，12為陽性對(duì)照的OD值。表2.數(shù)據(jù)處理用第2個(gè)孔到第11個(gè)孔的數(shù)值減去第I個(gè)孔(陰性對(duì)照)的數(shù)值，并得出的結(jié)果。表3.最小抑菌濃度與ESLI的比較結(jié)果。
權(quán)利要求
1.ー種水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)方法，其特征在于步驟如下 (1)抗菌藥物貯備液的制備； (2)菌液制備； (3)以步驟(I)所得的抗菌藥物貯備液，制備抗生素工作溶液； (4)將96孔微量滴定板放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育； (5)通過酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(I)所述抗菌藥物貯備液的制備包括如下步驟 (1)稱取抗菌藥物； (2)加入MHB培養(yǎng)基稀釋藥物，使藥液終濃度為1024μ g/ml ； (3 )將抗菌藥物貯備液分裝于無菌小瓶中，置-80°C以下保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)所述的菌液制備包括如下步驟 (1)將分離純化好的細(xì)菌，接種于MHB培養(yǎng)基中，28-37°C震蕩過夜培養(yǎng)； (2)用MNB培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度，使其0D600值為O.4，并稀釋到l*106CFU/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)所述抗生素工作溶液的制備包括如下步驟 Cl)在無菌96孔微量滴定板的每排第2孔中加入200 μ I終濃度為1024 μ g/ml的藥液； (2)在第3孔到第11孔中加入100μ I MHB培養(yǎng)基； (3)利用兩倍稀釋法，在每排中，用100μ I移液器從每排第2孔中移出ΙΟΟμΙ液體加入到各自排的第3孔中進(jìn)行稀釋混勻，然后向后依次進(jìn)行稀釋混勻，直到每排的第11孔，每稀釋混勻一孔，換一次槍頭； (4)在每排第I孔中加入200μ I MHB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照； (5)在每排第12孔中加入100μ I MHB培養(yǎng)基和100 μ I稀釋好的菌液作為正常生長(zhǎng)對(duì)照孔； (6)再在每排第2孔到第11孔中每孔加入100μ I調(diào)好的稀釋菌液；這樣每排第2孔到第 11 孔中藥液濃度分別為512 μ g/ml、256 μ g/ml、128 μ g/ml、64 μ g/ml、32 μ g/ml、16 μ g/ml>8 μ g/ml>4 μ g/ml>2 μ g/ml、I μ g/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)所述培養(yǎng)溫度為28-37°C，孵育 16-24h。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(5)如下步驟 (1)通過酶標(biāo)儀設(shè)定OD值為600，讀取數(shù)據(jù)； (2)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理用第2個(gè)孔到第12個(gè)孔的數(shù)值減去第I個(gè)孔(陰性對(duì)照)的數(shù)值； (3)繪制折線圖； (4)確定最小抑制濃度拐點(diǎn)值即為最小抑制濃度； (5)將最小抑制濃度與抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)進(jìn)行比較，從而確定敏感(S)、中度敏感(I)或耐藥(R)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)方法。包括(1)抗菌藥物貯備液的制備；(2)菌液制備；(3)以步驟(1)所得的抗菌藥物貯備液，制備抗生素工作溶液；(4)將96孔微量滴定板放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；(5)通過酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明的方法針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)均有效，也可擴(kuò)展到其他細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)。本發(fā)明結(jié)合96孔板(8×12)的規(guī)格，以及CLSI藥物濃度的范圍，選取了8種抗生素藥物，10個(gè)濃度梯度進(jìn)行檢測(cè)。本方法對(duì)細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)無需使用平板，免去了大量配置培養(yǎng)基，制作藥敏紙片，測(cè)量抑菌圈等步驟，培養(yǎng)液用量小，實(shí)用性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，重復(fù)性好，靈敏度高。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102676629SQ20121018241
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者何建國(guó), 袁永青, 陳旭凌, 黃志堅(jiān) 申請(qǐng)人:中山大學(xué), 廣州力必拓生物科技有限公司