一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉xlc及制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉及制備方法和應用，其步驟：稱取重金屬鎘含量為50mg·Kg-1的用于重金屬修復的盆栽試驗土樣于加有玻璃珠的無菌水中，恒溫搖床振蕩、靜置后，取上清進行稀釋；將不同稀釋倍數的稀釋液涂布在含有鎘的馬丁固體培養基上，倒置于恒溫培養箱中培養。將培養基上生長的微生物進行劃線分離純化，并進行復篩驗證，經分離篩選后，得到對鎘具有穩定抗性能力的絲狀真菌毛霉XLC菌株，在PDA斜面上保存備用。該菌株保藏編號為CCTCCNO：M2012136。該菌株的活性菌體吸附鎘的能力高于死菌體,在電鍍污水處理中具有對鎘的高效移除能力，在實際應用中能修復水體及土壤中的鎘污染。
【專利說明】一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉XLC及制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于水體環境治理領域，具體涉及一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉，同時還涉及一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉的制備方法，還涉及一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉在重金屬鎘污染水體及土壤的生物修復中的應用。
【背景技術】
[0002]土壤與水源都是自然環境的重要組成，也是人類賴以生存的資源，隨著人類活動的加劇，越來越多的重金屬污染物通過大氣沉降、污水灌溉、固體廢棄物排放以及農藥和化肥的施用等途徑進入土壤和水體(李天杰，1995)。有害重金屬積累到一定程度就會對生態系統產生毒害，并可以通過直接接觸、食物鏈等途徑危害人類的健康(陳晶中等，2003)。重金屬作為一類危害很大的污染物，具有移動性小，周期長，易積累，毒性大等特點，目前，受到了廣泛關注。
[0003]鎘是一種稀有分散金屬，在自然界中背景值低，相對其它重金屬，鎘的生物有效性更高，也更容易被生物利用積累(熊愈輝，2007)。鎘金屬因其毒性高、污染面積最大，是最重要、危害最大的重金屬污染物之一，具有長期性、隱蔽性和不可逆性，不僅會直接影響植物的生長發育還會影響土壤和水體的生態結構，降低植物產量和品質，然后通過食物鏈危及動物和人類(Kramer，Clemens，2005)。鎘在人類生活中應用范圍很廣，工業上主要用于電鍍、著色劑、抗腐劑和抗摩擦劑、塑料穩定劑、光敏元件和電池生產等行業(Lin etal.，2002);農業生產上，鎘化合物有時會被添加到殺蟲劑和殺菌劑中，造成對植物和土壤的污染，繼而通過自然界物質循環污染水體環境。因此尋找一種能夠有效治理鎘污染的方法是當前一個重要的課題(Basta et al.，2001)。
[0004]對于重金屬污染，傳統的方法有工程治理措施、物理化學修復、化學修復措施，包括離子交換法、吸附法、 電化學處理法、萃取法和膜分離法等(Wang，Wang, 2009)，但是從實踐角度發現，工程治理措施在花費大量人力金錢的情況仍然只是治標不治本；物理化學修復方法只適合小范圍的污染修復(David et al.，1995);化學修復的作用經過證實具有比較好的作用，通過對重金屬的吸附作用、氧化還原作用、拮抗或沉淀作用產生影響最終降低重金屬污染，并且是現在治理污染應用較多的方法(Naidu et al.，1997)。但是實踐表明，雖然上述的的一些修復方法能夠在一定程度上減少重金屬在環境中的生物有效性，但是都有各自的缺陷和局限性，并且在重金屬濃度較低(<100mg.L-1)的環境中很難發揮作用，花費巨大，效果不佳，很難推廣應用。
[0005]近年來，重金屬污染的生物修復技術正在興起，利用特定的生物(植物、微生物或原生動物)吸收、轉化、清除或降解環境污染物，實現環境凈化、生態效應恢復的生物措施(溫志良等，1999)。生物吸附重金屬是一個新環境友好的、不引入二次污染的污染處理技術，主要優點是能夠高效處理低濃度的重金屬廢水，而且生物吸附劑的來源非常廣泛，有良好的經濟效益(David, Volesky, 1998)。真菌在重金屬凈化應用中表現出的優勢在于大規模工業發酵中常常可以獲得大量廉價的真菌菌體，并且通常這些菌體是需要被廢棄的副產物，真正可以做到廢物的環保利用。真菌菌絲粗大、富集量大、易于與液體分離收集更利于稀有重金屬的回收。釀酒酵母、黑根霉、產黃青霉、金霉素鏈霉菌等一些工業生產應用的菌株都已經被證實具有很強的重金屬富集能力(Waihung et al., 1999;Liu et al.，2001)。一般認為真菌分離溶液中的重金屬離子主要有三種過程:胞外富集與沉積、細胞表面吸附以及胞內富集(Ledin，2005)，根據依賴代謝能量情況又分為主動吸附和被動吸附，一般被動吸附是真菌對重金屬吸附的主要作用(Ayla, Dursun, 2003)。
[0006]隨著科技的快速發展，重金屬污染問題正困擾著人們的生活，給人們的健康帶來潛在威脅，科學研究者正試圖尋找一些高效的修復方法來解決這個問題。生物修復技術由于其特殊的優越性受到重視，而其中微生物修復又因其有痕量性、快速性以及再生性受到關注。本發明利用微生物對重金屬污染具有耐受性，從鎘污染的土壤中分離得到一株具有高濃度鎘抗性的絲狀真菌，進一步探究其對重金屬鎘吸附的能力，從解吸附能力、化學預處理方法對菌體吸附影響以及不同活性狀態菌體對鎘吸附能力影響的角度來探究本發明作為重金屬修復材料的可行性。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是在于提供了一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉XLC (Mucoromycltesp.XLC)，保藏編號:CCTCC NO:M2012136。本發明所提供的絲狀真菌毛霉XLC經實驗驗證對多種重金屬均具有較高耐受性，可以在實際應用中高效去除污染水體中的鎘。
[0008]本發明的另一 個目的是在于提供了一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉XLC的制備方法，該方法能夠較快獲得單一的純菌株，獲得的絲狀真菌具有穩定的重金屬抗性并且具有較高的鎘吸附能力，該方法更具有經濟高效、操作簡單易行的優點。
[0009]本發明的再一個目的是在于提供了一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉XLC在重金屬鎘污染水體及土壤的生物修復中的應用，吸附實驗結果顯示毛霉XLC凍干菌體可以在實驗室條件下顯著吸附重金屬鎘，具有修復鎘污染土壤和水體的能力，并且發現活菌比死菌對鎘具有更高的吸附能力，電鍍廢水中重金屬移除實驗結果證明，絲狀真菌毛霉XLC可以在實際應用中高效去除污染水體中的鎘。
[0010]為了實現以上目的，本發明采取以下技術措施:
[0011]一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉XLC的制備方法，其步驟是:
[0012]A、稱取重金屬鎘含量為50mg *Kg 1的用于重金屬修復的盆栽試驗土樣IOg于90ml帶有5個0.5mm玻璃珠的無菌水中，28°C恒溫搖床150r.mirT1振蕩15min,靜置Imin后，取上清進行10倍系列稀釋。
[0013]B、將100 μ L不同稀釋倍數的稀釋液涂布在含有60mM鎘的馬丁固體培養基上，靜止片刻，倒置于28°C恒溫培養箱中培養5d。
[0014]C、將培養基上生長的微生物進行劃線分離純化，并進行復篩驗證，經10次分離篩選后，保存對鎘具有穩定抗性能力的菌株，在PDA斜面上進行保存，備用。
[0015] 申請人:將分離獲得的絲狀真菌命名為XLC，經形態學特征觀察和分子生物鑒定，確認該菌為毛霉(Mucoromyclte sp.)。該菌株于2012年4月24日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址:中國武漢武漢大學，保藏號:CCTCC NO:M2012136，分類命名:毛霉 XLC Mucoromyclte sp.XLC。[0016]菌株的生物學和形態學鑒定
[0017]①.生物學特征:絲狀真菌，專性需氧，最適生長溫度20°C-28°C，在PDA培養基中產孢量大，菌落較為疏松，呈絨毛狀，菌落與孢子呈白色。
[0018]②.培養條件:
[0019]分離篩選所用培養基為馬丁培養基:葡萄糖IOg.ΙΛ蛋白胨5.0L-1,MgSO40.5g.I71,自然 pH, 121°C高壓蒸汽滅菌 30min ；
[0020]保存活化以及收集該菌孢子所用培養基為PDA培養基:土豆200.0g.L_\葡萄糖20.0g.L'1%瓊脂，自然pH, 121°C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0021]毛霉XLC制備吸附劑時所用的培養基為礦物鹽培養基(麗培養基):葡萄糖20.0g.L-1，(NH4) 2S045.0g.L-1KH2PO415.0g.L' MgSO40.6g.L' CaCl20.6g.I71，FeSO4.7Η205.0mg.L1, CoC122.0mg.L1,調節 pH 至 5.5 后 115°C高壓蒸汽滅菌 15min。
[0022]培養該菌可以以孢子的形式進行接種:以2%體積比的吐溫-80沖洗PDA斜面上的孢子，然后用0.2%體積比吐溫-80稀釋至需要的孢子濃度后接種，28°C，150r.mirT1恒溫培養。一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉在重金屬鎘污染水體及土壤的生物修復中的應用，其應用過程是:
[0023]I)絲狀真菌毛霉XLC對多種重金屬耐受性水平檢測:
[0024]接種孢子至麗液體培養基，搖床培養至菌絲球剛好形成。將含有設定濃度重金屬的礦物鹽固體平板劃分三等分區域，分別在每一區域以點種法接種直徑相同的菌絲球，28°C培養7天。每24小時記錄一次菌絲球直徑，分析不同濃度平板上隨著時間變化菌落大小變化趨勢。使菌落直徑基本無變化的重金屬濃度即為該菌的最低抑菌濃度。
[0025]2)絲狀真菌毛霉XLC對鎘吸附能力實驗:
[0026]①.靜態鎘的吸附:
[0027]制備孢子懸液，接種到礦物鹽液體培養基中培養，過濾收集菌體，進行真空冷凍干燥處理后，將菌體打散至松散狀態，然后進行吸附鎘的實驗。
[0028]凍干菌體加入到含有鎘溶液的離心管中，置于28°C恒溫搖床中、150r.mirT1反應240min，反應過程中分別在0、5、15、30、45、60、120、180和240min取上清，然后用石墨爐原子吸收分光光度計(F-240，VARIAN)測定吸附前后上清液中鎘的含量。
[0029]②.吸附-解吸附實驗:
[0030]用凍干處理后的菌體進行鎘的吸附實驗，具體吸附實驗條件:鎘溶液濃度為500mg.L' pH 4.0、0.1g.l-1凍干菌體充分吸附4h，吸附飽和后上清取樣，用石墨爐原子吸收分光光度計測定吸附前后上清液中鎘的含量，計算吸附到菌體表面的鎘含量。過濾收集吸附后菌體并進行冷凍干燥。分別選取去離子水、硝酸、鹽酸、EDTA、氫氧化鈉作為解吸附劑，確定最適解吸附劑。
[0031]③.菌的活性狀態對鎘的吸附的影響:
[0032]將毛霉XLC在PDA培養基活化4天后產生的孢子收集制成懸液，然后接種到新鮮礦物鹽培養基中培養5d，過濾收集菌體。活菌收集后盡量除去水分,取一小部分80°C烘干至恒重測得菌體含水量。
[0033]死菌收集后進行冷凍干燥一高壓蒸汽滅菌一冷凍干燥一研磨過篩處理制成死菌粉末，兩種狀態的菌對鎘進行吸附實驗，實驗在含有鎘溶液的離心管中進行，吸附體系設定:活菌投加的鎘溶液ρΗ5.0、鎘濃度300mg七1、投加活菌0.5g.L-1 (干重)、吸附120min ；死菌投加的鎘溶液PH5.0、鎘濃度300mg 吸附45min、投加死菌0.Sg-T10完成飽和吸附實驗后，測得兩種狀態菌的吸附能力。
[0034]將吸附飽和的菌體回收，金屬洗脫液去除結合在菌表面的鎘后進行酸消化處理，用石墨爐原子吸收分光光度計測定菌體中鎘的含量。
[0035]3)絲狀真菌毛霉XLC對電鍍廢水中重金屬的移除實驗:
[0036]發明人分別進行了毛霉XLC活菌與死菌對采集的電鍍廢水中鎘去除能力的實驗:將毛霉XLC在PDA培養基活化4天后產生的孢子收集制成懸液，然后按1%的體積比接種到200毫升的新鮮礦物鹽液體培養基中培養5d，過濾收集菌體(培養收集活性狀態菌體的三角瓶為底部帶棱的三角瓶，培養收集死菌的三角瓶為普通三角瓶)。活菌收集后盡量除去水分，取一小部分80°C烘干至恒重測得菌體含水量，死菌收集后進行冷凍干燥一高壓蒸汽滅菌一冷凍干燥一研磨過篩處理制成死菌粉末，兩種菌體均用于移除電鍍廢水中的鎘離子。
[0037]毛霉XLC對電鍍廢水中鎘的實際移除實驗體系為:20mL電鍍廢水(Cd2+: 0.13mg.L-1)、干重0.0lg. 菌體、28°C和150r.mirT1處理2h后過濾收集上清液，按照前述方法測定吸附前后鎘的含量，計算獲得的鎘移除率。另外發明人再次利用毛霉XLC活菌和死菌處理絮凝劑處理過后的污水，以了解毛霉XLC在低濃度重金屬污染廢水中去除鎘的能力。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:
[0038]1.絲狀真菌毛霉XLC菌體易培養獲得，不同生物活性狀態菌體均具有較高吸附重金屬能力，材料成本低廉；
[0039]2.利用絲狀真菌毛霉XLC的凍干菌體作為生物吸附劑，不僅可以高效吸附污染水源中的重金屬離子，同時還具備良好的吸附劑再生能力，具備商業化應用的潛能，解吸附效果好有利于回收貴金屬，實際應用價值高；
[0040]3.絲狀真菌毛霉XLC在電鍍廢水中表現出了低濃度鎘(0.13mg.L-1)的高效移除能力，而傳統重金屬污染廢水處理技術在低濃度重金屬污染水體中無法發揮有效作用，因此絲狀真菌毛霉XLC具有良好的實際應用潛力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041]圖1為一種絲狀真菌毛霉XLC凍干菌體的靜態鎘吸附量測定結果示意圖。
[0042]圖2為一種絲狀真菌毛霉XLC對鋪的解吸附劑的選擇不意圖。
[0043]圖3為一種絲狀真菌毛霉XLC對鎘的解吸附動力學結果示意圖。
[0044]實驗采用最佳解吸附劑0.1mol.L-1鹽酸。
[0045]圖4為一種絲狀真菌毛霉XLC活菌與死菌對電鍍廢水以及絮凝作用后廢水中鎘移除結果不意圖。
具體實施方案
[0046]以下敘述是根據本發明實施方案的實施例。應該說明的是，本發明的實施例對于本發明只有說明作用，而沒有限制作用。有關DNA的標準操作方法和所使用的藥品均參考分子克隆手冊(參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版)所描述的內容。本發明中所涉及的其他各種實驗操作，均為本領域的常規技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。
[0047]實施例1:
[0048]一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉XLC的制備方法，其步驟是:
[0049]A、稱取重金屬鎘含量為50mg *Kg 1的用于重金屬修復的盆栽試驗土樣IOg于90ml帶有5個0.5mm玻璃珠的無菌水中，28°C恒溫搖床150r.mirT1振蕩15min,靜置Imin后，取上清進行10倍系列稀釋。
[0050]B、將100 μ L不同稀釋倍數的稀釋液涂布在含有60mM鎘的馬丁固體培養基上，靜止片刻，倒置于28°C恒溫培養箱中培養5d。
[0051]C、將培養基上生長的微生物進行劃線分離純化，并進行復篩驗證，經10次分離篩選后，保存對鎘具有穩定抗性能力的菌株，在PDA斜面上進行保存，備用。
[0052] 申請人:將分離獲得的絲狀真菌命名為XLC，經形態學特征觀察和分子生物鑒定，確認該菌為毛霉(Mucoromyclte sp.)。該菌株于2012年4月24日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為:CCTCC NO:M2012136。
[0053]菌株的生物學和形態學鑒定
[0054]①.生物學特征:絲狀真菌，專性需氧，最適生長溫度20°C~28°C，在PDA培養基中產孢量大，菌落較為疏松，呈絨毛狀，菌落與孢子呈白色。
[0055]②.培養條件:
[0056]分離篩選所用培養基為馬丁培養基:葡萄糖IOg.ΙΛ蛋白胨5.(.?ΛMgSO40.5g.I71,自然 pH, 121°C高壓蒸汽滅菌 30min ；
[0057]保存活化以及收集該菌孢子所用培養基為PDA培養基:土豆200.0g.L_\葡萄糖20.0g.L'1%瓊脂，自然pH, 121°C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0058]毛霉XLC制備吸附劑時所用的培養基為礦物鹽培養基:葡萄糖20.0g.L_S(NH4) 2S045.0g.I/1, ΚΗ2Ρ0415.0g.I/1, MgSO40.6g.I/1, CaCl20.6g.I/1, FeSO4.7H205.0mg.L1, CoC122.0mg.L1,調節 pH 至 5.5 后 115°C高壓蒸汽滅菌 15min。
[0059]培養該菌可以以孢子的形式進行接種:以2%體積比的吐溫-80沖洗PDA斜面上的孢子，然后用0.2%體積比吐溫-80稀釋至需要的孢子濃度后接種，28°C，150r.mirT1恒溫培養。
[0060]菌株的分子生物學鑒定
[0061]CTAB法抽提絲狀真菌毛霉XLC的總DNA，檢測后以此為模板，利用ITS1-1TS4引物進行此菌株的ITS保守序列16SrDNA的PCR擴增，用于菌株的分子學鑒定。結合形態學特征觀察和分子生物鑒定結果確認該菌為毛霉(Mucoromycote sp.)。
[0062]實施例2:
[0063]一種高吸附鎘的絲狀真菌毛霉在重金屬鎘污染水體及土壤的生物修復中的應用，其步驟是:
[0064]A、絲狀真菌毛霉XLC對多種重金屬耐受性水平檢測
[0065]液體培養條件:接種前向培養基添加一定量過濾滅菌的重金屬母液至設定濃度，按1%體積比接種量接種毛霉XLC孢子懸液，培養7d，觀察菌株生長狀況。
[0066]礦物鹽固體培養條件:接種孢子至礦物鹽液體培養基，搖床培養至菌絲球剛好形成。將含有設定濃度重金屬的礦物鹽固體平板劃分三等分區域，分別在每一區域以點種法接種直徑相同的菌絲球，28°C培養7天。每24小時記錄一次菌絲球直徑，分析不同濃度平板上隨著時間變化菌落大小變化趨勢。使菌落直徑基本無變化的重金屬濃度即為該菌的最低抑菌濃度。
[0067]表I為毛霉XLC對不同重金屬離子的耐受性檢測結果，礦物鹽液體培養基培養條件下不同重金屬對毛霉XLC的最低抑菌濃度分別為:鎘(Cd2+)120mM、鈷(Co2+)4mM、銅(Cu2+)130mM、鋅(Zn2+) 120mM、鉻(Cr3+) 85mM、鉻(Cr6+) ImM、鎳(Ni2+) 22mM ;礦物鹽固體培養基培養條件下則分別為:lOOmM、15mM、40mM、140mM、60mM、ImM、18mM。本實驗證實了本發明所提供的毛霉XLC對多種重金屬的毒害具有較強耐受性。
[0068]
【權利要求】
1.一種絲狀真菌毛霉，其特征在于:毛霉XLC (.Mucoromyclte sp.XLC)，CCTCC NO:M2012136。
2.權利要求1所述的一種絲狀真菌毛霉XLC在重金屬鎘污染水體的生物修復中的應用。
3.權利要求1所述 的一種絲狀真菌毛霉XLC在重金屬鎘污染土壤的生物修復中的應用。
【文檔編號】C12R1/645GK103451104SQ201210180801
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月4日 優先權日:2012年6月4日
【發明者】陳雯莉, 黃巧云, 朱偉, 夏璐, 徐興健, 張哲軼 申請人:華中農業大學