專利名稱：Blad cd18野生型和突變型雙基因型(a/g型)雜合子質粒及其構建方法
技術領域：
本發明涉及質粒的構建方法，特別涉及一種BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒及其構建方法。
背景技術：
奶牛白細胞黏附缺陷癥(bovineleukocyte adhesion deficiency,BLAD)是一種發生于發生于荷斯坦(Holstein)奶牛的常染色體的隱性致死性的遺傳性免疫缺陷疾病，其致病機理和人的白細胞黏附缺陷病(leukocyte adhesion deficiency, LAD)相同，是由白細胞表面的整合素i32(CD18)所編碼區域的基因序列中第383位的堿基A突變為G所引起的，與之對應的天門冬氨酸變為甘氨酸，導致白細胞表面的整合素β 2表達量明顯減少或缺乏，不能與整合素a亞單位(CDll)以非共價鍵相連構成異源二聚體而形成整合素分子，進而在發生炎癥時外周血液中的中性粒細胞無法通過表面的整合素糖蛋白分子與血管內皮黏附分子相互作用而黏附到血管內皮上，進而無法穿過血管壁在基質中向炎性部位趨化，也就無法最終到達病原侵入部位，對病原體直接做出反應。但由于病原不斷的刺激，機體的白細胞不斷增多，久之造成了機體的免疫力低下。BLAD多發生于1-14月齡的荷斯坦牛，雙親均可為攜帶者。臨床表現為嚴重的反復性感染、膿液形成減弱、傷口愈合緩慢和白細胞增多，同時表現為犢牛初生體重低和發育 遲緩等癥狀。出生小牛為致病純合體時，臨床上表現發病，為反復性感染發炎、生長發育受阻、嗜中性粒細胞增多等癥狀，通常很快死亡，所以BLAD常見于不到I歲的荷斯坦牛。BLAD的主要癥狀是食欲不好，鼻鏡腫脹、有脫斑。廣泛的淋巴結增生，頜下淋巴結腫大，為正常的3-5倍，口腔黏膜、齒齦黏膜壞死性潰瘍，齒齦萎縮，病程長者前白齒脫落。上、下頜骨增厚，發生骨質吸收和溶解。輕度腹瀉，胃炎、小腸腸炎，回腸發生潰瘍性腸炎。慢性咳嗽，有的表現為偽膜性鼻炎、壞死性喉炎、卡他性支氣管肺炎，還可觀察多發性肺壞死灶。加耳標簽所造成的損傷可引起耳膿腫變形，滲出物為黃色清水樣。病牛還表現不愛運動，生長緩慢，嚴重者體重僅為正常體重的40%，胸腹側水腫較明顯。患牛需要頻繁或長期的抗生素治療。發病較輕者，采用這種方法可存活一定時間，但不能得到根本上的治療。近30年來，我國從美國、加拿大及澳大利亞等進口大量的活牛，其中大部分為荷斯坦牛，由于BLAD有害基因多以雜合的狀態存在，攜帶者并不發病，加之對此病沒有足夠的認識和重視，不可避免地引入大量潛在的BLAD攜帶者，而攜帶者表現正常，很難發現，一旦被發現時，其已經在畜群中進行了長時期的傳播。BLAD患牛出生后生長發育極差，其中絕大多數在I年內死亡，只有極少數可存活2年左右，而幸存到2年左右的奶牛沒有繁殖和哺育能力，從長期來看，引入有害基因將給中國養牛業和乳制品行業的發展帶來重大的經濟損失。BLAD遺傳缺陷的發現引起了各國奶牛育種協會和育種工作者的重視，美國、日本、丹麥、荷蘭等國已相應建立了種公牛遺傳缺陷基因的分子檢測方法和育種計劃，將BLAD造成的損失降低。我國擁有700萬頭以上的荷斯坦奶牛，由于缺乏簡便有效的BLAD隱性有害基因的檢測方法，無法開展常規檢測和大規模的普查統計，因此對我國牛群中BLAD的發病和攜帶情況尚不十分清楚，也就更談不上從牛群中凈化BLAD。我國急需建立快速、敏感、穩定可靠的BLAD檢測方法，開展積極的BLAD致病基因篩查，從而阻斷BLAD致病基因的下傳。CN 102002527A公開了一種用于檢測牛CD18基因D128G突變的引物和特異性的Taqman MGB探針，利用這些引物和探針，采用實時熒光定量PCR技術，能夠快速靈敏地檢測待測牛CD18基因D128G突變位點基因型，從而準確篩查BLAD遺傳缺陷攜帶者。CN 100419088C公開了一種篩選⑶18基因正常的優良種牛的方法及其專用引物。其引物是由序列表中序列I和序列2的核苷酸序列組成的引物對。該方法是以待測牛的基因組DNA為模板，在由序列表中序列I和序列2的核苷酸序列所組成的引物對的引導下進行PCR擴增，檢測擴增片段自5’端第32位堿基為A、G還是N，擴增片段自5’端第32位堿 基為A的種牛為⑶18基因正常的優良種牛；所述N為A和G的雜合體。CN 10189951IA公開了一種應用AS-PCR檢測牛白細胞黏附缺陷的方法，其通過制備一種用于牛黏附缺陷檢測方法的特異性PCR引物，所述引物包括CD18基因擴增引物突變型擴增引物長度為500bp ;引物I :5’ AAGATGACGAGGAGCAGAA 3’，引物2 :5’ GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3’ ；野生型擴增產物長度為818bp ;引物3 :5 ’ CAAGGGCTACCCCATCGA 3 ’，引物 4 :5 ’ CAGGACTGCGTGGCTAAA 3 ’。該引物可直接應用于在體外開展牛黏附缺陷的致病基因的篩選。上述方法均為檢測BLAD⑶18基因缺陷提供了選擇，但各種方法之間缺乏統一的標準，為大規模的普查統計帶來了難度，不利于開展大型的BLAD致病基因篩查。
發明內容
本發明目的在于，提供一種BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒及其構建方法，以便以該質粒作為標準質粒，在此基礎上，能夠建立起方便、高效且特異的檢測BLAD的方法，進而為測定奶牛群中BLAD發生頻率和BLAD檢測試劑盒的研發奠定基礎，使大規模BLAD致病基因的篩查成為可能，以此不僅可以掌握BLAD基因攜帶和發病情況，還可以排除隱性有害基因的攜帶者，避免和降低種公牛傳播擴散有害基因的風險，最終為有效預防和治療BLAD做出貢獻。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案一、構建BLAD⑶18基因標準野生型(A/A型)質粒采用如下步驟(I)以正常牛基因組DNA為模板，以上游引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3’，下游引物 R :5’ -AGGGGAA GATGGAGTAGCTG-3’ 建立起 50 μ L 的 PCR 反應體系，擴增BLAD⑶18野生基因型(Α/Α)目的片段。在O. 2mL的PCR管中加入2 μ L (50ng)的牛基因組 DNA、5y L 的 10XE*Taq buffer、4y L 的 dNTP (各 I. 5mM)、2y L 濃度為 10 μ M 的上游引物F、2 μ L濃度為10 μ M的下游引物R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應程序為94°C預變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，40個循環。(2)步驟(I)的PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳,經與標準DNA Marker條帶比較，得到大小為1070bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。(3)用OMEGA公司的Gel extraction kit對步驟(I)的PCR產物進行切膠回收，步驟如下①將步驟(I)的PCR產物進行O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳；②在紫外透照臺上將目的片段快速切下，放入已經稱重的兩個I. 5mL離心管中，然后稱重，得出膠塊的重量；③根據膠重按每毫克加一微升的量加入Binding Buffer,放55_60°C金屬浴中加熱直至膠完全溶解，期間每隔2-3min振蕩混合，使之充分融化；④吸取200 μ L Buffer GPS平衡緩沖液至裝有Hibind DNA結合柱的2mL收集管，室溫放置3-5min,室溫下12000xg離心2min,棄掉收集管中濾液,將柱子重新裝回收集管；⑤將溶膠轉入結合柱中，室溫下IOOOOxg離心Imin ；
⑥棄掉濾液，向結合柱加入300 μ L Binding Buffer, IOOOOxg離心Imin ；⑦棄掉濾液，向結合柱中加入700 μ L SPff Wash Buffer(含無水乙醇)，IOOOOxg離心 Imin ；⑧棄掉濾液，重復⑦一次；⑨棄掉濾液，13000xg離心2min,將液體甩干；⑩將結合柱轉移至一新的I. 5ml離心管中，加入30 μ L ddH20或Elution Buffer于結合柱中，室溫靜置2min，13000xg離心lmin，棄掉結合柱，管中為回收的DNA片段，置于-20°C保存。(4)將步驟(3)回收的DNA片段連接T載體從而獲得BLAD⑶18基因標準野生型(A/A型)質粒模板。連接反應體系為10 μ L，由3μ L回收的PCR產物、5μ L的2XRapidLigation Buffer、I μ L 的 PGEM-T Easy vector 和 I μ L 的 T4DNA Ligase 組成。置于 4°C恒溫水浴箱連接過夜。(5)按照如下步驟轉化連接產物①將感受態細胞從_80°C冰箱中取出之后置于冰上融化；②取10 μ L連接產物加入融化后的感受態細胞中，輕輕混勻；③冰浴30min ；④42°C水浴熱激90s，再在冰上冷激3min ；⑤加入400 μ L無抗性的經37 °C預熱的LB液體培養基，37 °C 150rpm震蕩培養90min ；⑥3000rmp離心2min，棄掉部分上清，留下約100 U L液體，然后重懸，加入7 μ LIPTG和40 μ L X-gal，用涂布棒涂布于有氨芐青霉素抗性的LB固體培養基平板上，置于37°C恒溫培養箱中倒置培養12-16小時，然后進行藍白斑鑒定。(6)按照如下步驟篩選與鑒定重組的BLAD⑶18基因標準野生型(A/A型)質粒①挑取白斑于6mL含有氨節青霉素抗性的LB液體培養基,37°C 200rmp振蕩培養12-16個小時；②以培養好的菌液為模板分別進行PCR鑒定；③將PCR測定為陽性的菌液進行保菌，取500 μ L菌液加500 μ L滅菌甘油于I. 5mL尚心管中，混勾并標記后放入_80 C冰箱中保存待用；④將PCR鑒定陽性的菌液進行測序，測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。
(7)按照如下步驟提取重組的BLAD⑶18基因標準野生型(A/A型)質粒將菌液用OMEGA公司的Plasmid mini kit I進行陽性質粒的提取,步驟如下①取保存菌液200 μ L于3mL有氨芐青霉素抗性的LB液體培養基中，37 °C 200rmp振蕩培養12-16個小時；②取2mL菌液于I. 5mL離心管中，室溫下IOOOOxg離心Imin ；③棄掉上層培養液，向細菌沉淀中加入250 μ L Solution I (含RNase A)，進行徹底地渦旋混勻；④加入250 μ L Solution II,上下顛倒4-6次,輕輕混勻，室溫下溫育2min ；⑤加350yL Solution III，輕輕混勻至出現白色絮狀物，然后室溫下13000xg離 心 IOmin ；⑥小心轉移上清液到一個2mL的裝有DNA結合柱的收集管中(DNA結合柱的平衡方法同切膠回收),注意不要吸進沉淀,室溫下IOOOOxg離心Imin ；⑦棄濾液，加500yL Buffer HB, IOOOOxg 離心 lmin,除去蛋白；⑧棄濾液，加700 μ L DNA Wash Buffer (含無水乙醇)，IOOOOxg 離心 Imin ；⑨棄濾液，重復⑧一次；⑩棄濾液，13000xg離心2min,將液體甩干；將結合柱轉移至一新的I. 5mL離心管中，加入30 μ L ddH20或Elution Buffer于結合柱中，室溫靜置2min, 13000xg離心lmin,棄掉結合柱，管中為提取的BLAD CD18基因標準野生型(A/A型)質粒DNA，置于_20°C保存；取2 μ L質粒DNA，微型紫外分光光度計測定質粒濃度為145ng/ μ L，其0D260/0D280比值為
I.844，符合要求。二、構建BLAD⑶18基因標準突變型(A/G型)質粒采用如下步驟(I)以上述步驟一、(3)回收的BLAD⑶18基因標準野生型(Α/Α型)DNA片段為模板，上游引物 CD18Flink :5’ -GCCAAGGGCTACCCCATCGGCCTGTACTACCTGATGGAC-3’ 和下游引物CD18R :5’ -AGGGGAAGATGGAGTAGCTG-3’建立起50 μ L的PCR反應體系，擴增突變型短片段。在0. 2mL的PCR管中加入2μ L (50ng)的步驟一、(3)回收的DNA片段、5 μ L的10XE*Taqbuffer、4y L 的 dNTP (各 2. 5mM)、2y L 濃度為 10 μ M 的上游引物 CD18Flink、2 μ L 濃度為10 μ M的下游引物⑶18R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應程序為94°C預變性5min，94V變性30s、60 V退火30s、72°C延伸60s，40個循環。(2 )反應結束后,產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳,經與標準DNA Marker條帶比較,得到大小為162bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。(3)切膠回收步驟(I)的PCR產物，方法與所述步驟一、(3)相同。(4)以所述步驟一、(3)回收的DNA片段為模板，引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3 ’為上游引物，步驟(2 )獲得的突變型短片段為下游引物，建立起50 μ L的PCR反應體系，進行二次擴增以獲得完整的BLAD CD18突變基因型(G/G)目的片段。在0. 2mL的PCR管中加入 2μ L(50ng)的步驟一、(3)回收的 DNA 片段、5 μ L 的 10XE*Taq buffer、4y L的dNTP (各2. 5mM)、2y L濃度為10 μ M的上游引物eC18F、2y L濃度為10 μ M的下游引物突變型短片段、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應程序為94°C預變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，30個循環。
(5 )反應結束后,產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳,經與標準DNA Marker條帶比較,得到大小為1070bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。(6)按照與所述步驟一、(3)相同的方法回收步驟(4)的PCR產物。(7)將步驟(6)回收的DNA片段連接T載體從而獲得BLAD⑶18基因標準突變型(A/G型)質粒模板，方法與所述步驟一、(4)相同。(8)轉化連接產物，方法與所述步驟一、(5)相同。(9)篩選與鑒定重組的BLAD⑶18基因標準突變型(A/G型)質粒，方法與所述步驟一、(6)相同。(10)提取重組的BLAD⑶18基因標準突變型(A/G型)質粒，方法與所述步驟一、
(7)相同。取2μ L質粒DNA，微型紫外分光光度計測定質粒濃度為156ι^/μ ，其0D260/0D280比值為I. 82，符合要求。三、BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒及其構建一種BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒，其是通過EcoRI酶切產生黏性末端后反向連接BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段和野生基因型片段(Α/Α)的連接產物。優選地，所述BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段和BLAD⑶18野生基因型(Α/Α)片段的比例為1:1。1:1的比例可以避免因為野生基因型和突變基因型濃度測量誤差而導致的基因比例的不確定性，從而能夠精確地模擬雜合子基因組，嚴格實現野生型和突變型比例相等。所述BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒的構建方法，包括如下步驟(I)PCR擴增BLAD⑶18野生基因型(Α/Α)片段并回收，方法如前述步驟一、(I)
一、(3)所述；(2)PCR擴增BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段并回收，方法如前述步驟二、( I)
二、(6)所述；(3)用EcoRI對步驟(I)和步驟(2)的回收產物進行酶切和連接，獲得野生型和突變型串聯的目的片段。其內切酶消化體系為10 μ L，由IyL IOXHotstartTaq Buffer、IuL EcoRIUuL DNA步驟(I)的回收產物、I μ L步驟(2)的回收產物和6 μ L滅菌去離子水組成；反應條件為37°C消化lh，90°C變性15min。(4)將步驟(3)獲得的野生型和突變型串聯的目的片段與T載體進行連接。連接反應體系為10 μ L，由3 μ L的野生型和突變型串聯的目的片段、5 μ L的2XRapid LigationBuffer、I μ L 的 PGEM-T Easy vector 和 I μ L 的 T4DNA Ligase 組成。 (5)轉化連接產物，方法與所述步驟一、(5)相同。(6)篩選與鑒定重組的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒，方法與所述步驟一、(6)相同。(7)提取重組的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒，方法與所述步驟一、(7)相同。取2μ L質粒DNA，微型紫外分光光度計測定質粒濃度為150ng/μ L，其0D260/0D280比值為I. 80，符合要求，完成標準雜合子質粒(A/G型)的構建，質粒全長 1860bp。
上述步驟所表述的三種標準質粒的構建流程如圖I所示。將獲得的三種標準質粒(A/A型，G/G型和A/G型)進行普通測序，結果如圖2所不，從圖中可以看出A為野生型(A/A型)，在CD 18基因的383位喊基為A，測序峰圖中為單峰為突變型(G/G)，CD18基因的383位堿基為G，測序峰圖中為單峰；C為雙基因型雜合子(A/G)，在基因的383位堿基A突變為G，測序峰圖中突變位點為套峰。本發明中所用到的實驗材料如下(I)載體及樣品PGEM-T Easy載體由Promega公司生產，DH5 α購自北京天根生物技術有限公司，EcoRI限制性內切酶購自大連寶生物公司。奶牛血液樣品由中國檢科院提供。
(2)試劑及試劑盒
HotstartTaq酶試劑盒寶生物工程(大連)有限公司
Τ4 DNA ligase.: 丨丨(丨 Promega 公"I Plasmid mini kit I.: [丨、:丨 Omega 公 i (J
GeI extraction kit美國 Omega 公司
Marker DL 2000 maker寶生物工程(大連)有限公司
6xloading Buffer寶生物工程(大連)有限公司
dNTP(各IOmM)美萊博醫學科技有限公司
dNTP(各2.5mM)寶生物工程(大連)有限公司
X-Gal美國AMRESCO公司
IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)美國AMRESCO公司 M 'i>Ampicillin)sigma
SYBR GREEN I北京普博欣生物科技有限公司(3)主要試劑的配制(I) LB液體培養基胰化蛋白胨(Tryptone)IOg酵母提取物(YeastExtract) 5gNaClIOg以上試劑溶于900mL去離子水，用5mol/L氫氧化鈉調ρΗ7· 0，定容到IOOOmL,121°C高壓 20min，4°C保存。⑵Amp (100mg/mL):稱取Ig氨節青霉素,溶于IOmL雙蒸水中，O. 22 μ m濾器過濾，分裝，于-20°C儲存。⑶Amp抗性液體培養基在滅菌的LB液體培養基中加入Amp至終濃度為50 μ g/mL，4°C 保存。⑷Amp抗性固體培養基稱取I. 5g瓊脂粉，溶于IOOmLLB液體培養基中，121°C高壓20min,冷卻至50°C左右,加入Amp至終濃度為50 μ g/mL,燒制平板,無菌檢驗后4°C|C存備用。(5) IPTG(20%，m/V，0. 8mol/L):在8mL蒸餾水中溶解2g IPTG，用蒸餾水定容至IOml, O. 22 μ m濾器過濾，分裝成Iml小份于_20°C冰箱保存備用。(6) X-Gal (20mg/mL):稱取 IgX-Gal 置于 50mL 容量瓶中，加入 40mL DMF (二甲基甲酰胺)，充分混勻溶解后定容至50mL，用O. 22 μ m濾器過濾，分裝成ImL每小份，并用鋁箔紙包裹，然后置于_20°C冰箱保存備用。 (7)電泳緩沖液(50 X TAE貯存液)稱取Tris 242g，冰乙酸57. ImL,加入IOOmLO. 5mol/L EDTA溶液(pH8. O)，定容至1L，用前以蒸餾水稀釋為IX工作液。(8) SYBR Green I染料(電泳級)工作液取TAE電泳工作緩沖液與SYBRGreen I染料以1:3的比例配置。(4)儀器
2720型PCR儀美國ABI公司
微型紫外分光光度計(ND-1000)美國NanoDrop公司 超級恒溫循環器(YT-5B)北京亞泰科技開發中心
電熱恒溫培養箱(DHG-9082) 上海- 恒科學儀器有限公司 電熱恒溫鼓風千燥箱(DHG-9070A)上海一恒科學儀器有限公司 恒溫振蕩器(THZ-C)太倉市實驗設備廠
Iil iVc'f· (AL-104)瑞:I: METTLER TOLEDO 公 ^ d
sigma離心機(2-16P)美國sigma公司
直流電泳儀(DYY-7C)北京六一儀器廠
金屬恒溫儀(CHB-100)杭州博日科技有限公司
紫外凝膠成像系統(DYY-1000B)上海天能科技有限公司 高壓蒸氣滅菌器MLS-3750三洋電機國際貿易有限公司
渦旋儀Vortex其林貝爾
-8(TC冰箱(700Series)美國 Thermo 公司
超純水儀milli-Q美國Milipore與現有技術相比，本發明通過EcoRI酶切產生黏性末端后反向連接BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段和野生基因型片段(A/A)，首次構建出BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒，并且其中突變基因型和野生基因型的比例為1:1，避免了因為突變基因型和野生基因型濃度測量誤差而導致的基因比例的不確定性，嚴格地實現了野生型和突變型的比例相等，因此能夠精確地模擬雜合子基因組。以本發明的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒為基礎，能夠建立起方便、高效且特異的BLAD檢測方法，為BLAD檢測試劑盒及疫苗的研發提供方向，使大規模BLAD致病基因的篩查成為可能，以此不僅可以掌握BLAD基因攜帶和發病情況，還可以排除隱性有害基因的攜帶者，避免和降低種公牛傳播擴散有害基因的風險，最終為防止和阻斷BLAD致病基因的下傳以及有效預防和治療BLAD做出貢獻。
圖I是本發明所述二種標準質粒的構建流程圖。圖2是本發明所述三種標準質粒的測序結果圖。下面結合附圖并通過具體實施方式
來進一步說明本發明的技術方案，但下述的實例僅僅是本發明的簡易例子，并不代表或限制本發明的權利保護范圍，本發明的權利范圍以權利要求書為準。
具體實施例方式為更好地說明本發明，便于理解本發明的技術方案，本發明的典型但非限制性的實施例如下實施例I :BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒，具體的步驟如下(I) PCR擴增BLAD⑶18野生基因型(A/A)片段并回收I)以正常牛基因組DNA為模板，以上游引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3’，下游引物 R :5’ -AGGGGAA GATGGAGTAGCTG-3’ 建立起 50 μ L 的 PCR 反應體系，擴增BLAD⑶18野生基因型(Α/Α)目的片段。在O. 2mL的PCR管中加入2 μ L (50ng)的牛基因組 DNA、5y L 的 10XE*Taq buffer、4y L 的 dNTP (各 I. 5mM)、2y L 濃度為 10 μ M 的上游引物F、2 μ L濃度為10 μ M的下游引物R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應程序為94°C預變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，40個循環。2)步驟I)的PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳,經與標準DNA Marker條帶比較，得到大小為1070bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。3)用OMEGA公司的Gel extraction kit對步驟(I)的PCR產物進行切膠回收,步驟如下①將步驟(I)的PCR產物進行O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳；
②在紫外透照臺上將目的片段快速切下，放入已經稱重的兩個I. 5mL離心管中，然后稱重，得出膠塊的重量；③根據膠重按每毫克加一微升的量加入Binding Buffer,放55_6(TC金屬浴中加熱直至膠完全溶解，期間每隔2-3min振蕩混合，使之充分融化；④吸取200 μ L Buffer GPS平衡緩沖液至裝有Hibind DNA結合柱的2mL收集管，室溫放置3-5min,室溫下12000xg離心2min,棄掉收集管中濾液,將柱子重新裝回收集管；⑤將溶膠轉入結合柱中，室溫下IOOOOxg離心Imin ；⑥棄掉濾液，向結合柱加入300 μ L Binding Buffer, IOOOOxg離心lmin ;⑦棄掉濾液，向結合柱中加入700 μ L SPff Wash Buffer(含無水乙醇)，IOOOOxg離心 Imin ；⑧棄掉濾液，重復⑦一次；⑨棄掉濾液，13000xg離心2min,將液體甩干；⑩將結合柱轉移至一新的I. 5ml離心管中，加入30 μ L ddH20或Elution Buffer于結合柱中，室溫靜置2min，13000xg離心lmin，棄掉結合柱，管中為回收的DNA片段，置于-20°C保存。(2) PCR擴增BLAD CD18突變基因型(G/G)片段并回收I)以上述步驟(I)回收的BLAD⑶18基因標準野生型(A/A型)DNA片段為模板，上游引物 CD18Flink :5’ -GCCAAGGGCTACCCCATCGGCCTGTACTACCTGATGGAC-3’ 和下游引物CD18R :5’ -AGGGGAAGATGGAGTAGCTG-3’建立起50 μ L的PCR反應體系，擴增突變型短片段。在0. 2mL的PCR管中加入2μ L (50ng)的步驟(I)回收的DNA片段、5 μ L的10XE*Taqbuffer、4y L 的 dNTP (各 2. 5mM)、2y L 濃度為 10 μ M 的上游引物 CD18Flink、2 μ L 濃度為10 μ M的下游引物⑶18R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應程序為94°C預變性 5min，94°C變性 30s、60°C退火 30s、72°C延伸 60s，40 個循環。2)反應結束后，產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳，經與標準DNA Marker條帶比較，得到大小為162bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。3)切膠回收步驟I)的PCR產物，方法與所述步驟(I) 3)相同。4)以所述步驟(I)回收的DNA片段為模板，引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3’為上游引物，步驟2)獲得的突變型短片段為下游引物，建立起50μ L的PCR反應體系，進行二次擴增以獲得完整的BLAD⑶18突變基因型(G/G)目的片段。在0. 2mL的PCR管中加入2yL (50ng)的步驟一、(3)回收的DNA片段、5yL的10XE*Taq buffer、4yL的dNTP (各2. 5mM)、2y L濃度為10 μ M的上游引物eC18F、2y L濃度為10 μ M的下游引物突變型短片段、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應程序為94°C預變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，30個循環。5)反應結束后,產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳,經與標準DNA Marker條帶比較,得到大小為1070bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。6)按照與所述步驟(1)3)相同的方法回收步驟4)的PCR產物。(3)用EcoRI對步驟(I)和步驟(2)的回收產物進行酶切和連接，獲得野生型和突變型串聯的目的片段。其內切酶消化體系為10 μ L，由IyL IOXHotstartTaq Buffer、IuL EcoRIUuL DNA步驟(I)的回收產物、I μ L步驟(2)的回收產物和6 μ L滅菌去離子水組成；反應條件為37°C消化lh，90°C變性15min。(4)將步驟(3)獲得的野生型和突變型串聯的目的片段與T載體進行連接。連接反應體系為10 μ L，由3 μ L的野生型和突變型串聯的目的片段、5 μ L的2XRapid LigationBuffer、I μ L 的 PGEM-T Easy vector 和 I μ L 的 T4DNA Ligase 組成。(5)轉化連接產物，具體的步驟如下①將感受態細胞從_80°C冰箱中取出之后置于冰上融化；②取10 μ L連接產物加入融化后的感受態細胞中，輕輕混勻；③冰浴30min;④42°C水浴熱激90s，再在冰上冷激3min ；
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⑤加入400 μ L無抗性的經37 °C預熱的LB液體培養基，37 °C 150rpm震蕩培養·90min ；⑥3000rmp離心2min，棄掉部分上清，留下約100 μ L液體，然后重懸，加入7 μ LIPTG和40 μ L X-gal，用涂布棒涂布于有氨芐青霉素抗性的LB固體培養基平板上，置于37°C恒溫培養箱中倒置培養12-16小時，然后進行藍白斑鑒定。(6)篩選與鑒定重組的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒，具體的步驟如下①挑取白斑于6mL含有氨節青霉素抗性的LB液體培養基,37°C 200rmp振蕩培養12-16個小時；②以培養好的菌液為模板分別進行PCR鑒定；③將PCR測定為陽性的菌液進行保菌，取500 μ L菌液加500 μ L滅菌甘油于I. 5mL尚心管中，混勾并標記后放入_80 C冰箱中保存待用；④將PCR鑒定陽性的菌液進行測序，測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。(7)用OMEGA公司的Plasmid mini kit I從菌液中提取重組的BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒，具體的步驟如下①取保存菌液200 μ L于3mL有氨芐青霉素抗性的LB液體培養基中，37 °C 200rmp振蕩培養12-16個小時；②取2mL菌液于I. 5mL離心管中，室溫下IOOOOxg離心Imin ；③棄掉上層培養液，向細菌沉淀中加入250 μ L Solution I (含RNase A)，進行徹底地渦旋混勻；④加入250 μ L Solution II,上下顛倒4-6次,輕輕混勻，室溫下溫育2min ；⑤加350yL Solution III，輕輕混勻至出現白色絮狀物，然后室溫下13000xg離心 IOmin ；⑥小心轉移上清液到一個2mL的裝有DNA結合柱的收集管中(DNA結合柱的平衡方法同切膠回收),注意不要吸進沉淀,室溫下IOOOOxg離心Imin ；⑦棄濾液，加500yL Buffer HB, IOOOOxg 離心 lmin,除去蛋白；⑧棄濾液，加700μ DNA Wash Buffer (含無水乙醇)，IOOOOxg 離心 lmin ;⑨棄濾液，重復⑧一次；⑩棄濾液，13000xg離心2min,將液體甩干；將結合柱轉移至一新的I. 5mL離心管中，加入30 μ L ddH20或Elution Buffer于結合柱中，室溫靜置2min, 13000xg離心lmin,棄掉結合柱，管中為提取的BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒DNA,置于-20°C保存；取2 μ L質粒DNA，微型紫外分光光度計測定質粒濃度為150ng/ μ L，其0D260/0D280比值為I. 80，符合要求，完成標準雜合子質粒(A/G型)的構建，質粒全長1860bp。
申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的原料配比及制備步驟，但本發明并不局限于上述配比及制備步驟，即不意味著本發明必須依賴上述制備步驟才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
權利要求
1.一種BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒，其特征在于，其是通過EcoRI酶切產生黏性末端后反向連接BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段和野生基因型片段(A/A)的連接產物。
2.根據權利要求I所述的BLADCD 18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒，其特征在于，所述BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段和BLAD⑶18野生基因型(A/A)片段的比例為1:1。
3.根據權利要求I或2所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)PCR擴增BLAD⑶18野生基因型(A/A)片段并回收； (2)PCR擴增BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段并回收； (3)用EcoRI對步驟(I)和步驟(2)的回收產物進行酶切和連接，獲得野生型和突變型串聯的目的片段； (4)將步驟(3)獲得的野生型和突變型串聯的目的片段與T載體進行連接； (5)轉化連接產物； (6)篩選與鑒定重組的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒； (7)提取重組的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒，獲得全長為1860bp的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒。
4.根據權利要求3所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中擴增上游引物序列F為5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTITT-3’，擴增下游引物序列 R 為 5’ -AGGGGAAGATGGAGTAGCTG-3’。
5.根據權利要求3或4所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中PCR反應體系為50μ L，由2μ L (50ng)的牛基因組DNA、5y L 的 10XE*Taq buffer、4 μ L 的 dNTP (各 2. 5mM)、2 μ L 濃度為 10 μ M 的上游引物F、2 μ L濃度為10 μ M的下游引物R、0. 5 μ L Taq E和35 μ L的滅菌去離子水組成；PCR反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s ；40個循環。
6.根據權利要求3-5之一所述的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)先以步驟(I)的回收產物為模板，采用 CD18F :5’-GCCAAGGGCTACCCCATCGGCCTGTACTACCTGATGGAC-3’ 和 CD18R :5’ -AGGGGAAGATGGAGTAGCTG-3’引物進行擴增，得突變型短片段；再以步驟(I)的回收產物為模板，以引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3’作為上游引物、突變型短片段作為下游引物，進行二次擴增獲得完整的BLAD⑶18突變基因型(G/G)的DNA片段。
7.根據權利要求3-6之一所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)先以步驟(I)的回收產物為模板，采用CD18F和⑶18R引物進行擴增，獲得突變型短片段，其PCR反應體系為50yL，由2yL (50ng)的步驟(I)回收的 DNA 片段、5μ L 的 10XE*Taq buffer、4 μ L 的 dNTP (各 2. 5mM)、2 μ L 濃度為10 μ M的上游引物CD18Flink、2 μ L濃度為10 μ M的下游引物CD18R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水組成，反應程序為94°C預變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，40個循環。
8.根據權利要求3-7之一所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)再以步驟(I)的回收產物為模板，以eCD18F作為上游引物、突變型短片段作為下游引物，進行二次擴增獲得完整的BLAD CD18突變基因型(G/G)的DNA片段，其PCR反應體系為50 μ L，由2 μ L (50ng)的步驟(I)回收的DNA片段、5yL 的 10XE*Taq buff er、4 μ L 的 dNTP(各 2. 5mM)、2yL 濃度為 10 μ M 的上游引物 eC18F、2μ L濃度為10 μ M的下游引物突變型短片段、O. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水組成，反應程序為94°C預變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，30個循環。
9.根據權利要求3-8任一項所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)的EcoRI內切酶消化體系為10yL，由IyLIOXHotstart Taq BufferU μ L EcoRI、I μ L 步驟(I)的回收產物、I μ L 步驟(2)的回收產物和6μ L滅菌去離子水組成；反應條件為37°C消化lh，90°C變性15min。
10.根據權利要求3-9任一項所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)的連接，連接反應體系為10μ L，由3μ L的野生型和突變型串聯的目的片段、5μ L的2XRapidLigation Buffer、I μ L的PGEM-T Easyvector 和 I μ L 的 T4 DNA Ligase 組成。
全文摘要
本發明涉及BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質粒及其構建方法，其是通過EcoRI酶切產生黏性末端后反向連接BLAD CD18突變基因型(G/G)片段和野生基因型片段(A/A)的連接產物，所述BLAD CD18突變基因型(G/G)片段和BLAD CD18野生基因型(A/A)片段的比例為1:1。構建方法主要是根據GenBank中BLAD CD18序列設計引物，進行PCR擴增后純化產物。本發明提供的標準質粒，為建立起方便、高效且特異的檢測BLAD的方法以及為測定奶牛群中BLAD發生頻率和BLAD檢測試劑盒的研發奠定了基礎，使大規模BLAD致病基因的篩查成為可能，以此不僅可以掌握BLAD基因攜帶和發病情況，還可以排除隱性有害基因的攜帶者，避免和降低種公牛傳播擴散有害基因的風險，最終為有效預防和治療BLAD做出貢獻。
文檔編號C12N15/66GK102888421SQ20121017909
公開日2013年1月23日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者賈廣樂, 周莉, 廖娟紅, 林祥梅 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院