專利名稱：基于凝膠的多聚酶鏈式反應試劑保存方法及反應試劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于生化試劑組合物的保存方法技術領域，具體涉及ー種基于凝膠的多聚酶鏈反應試劑保存方法及反應試劑。
背景技術：
在過去的20年里，以多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)為代表的核酸擴增技術得到了迅猛的發展和應用。由于PCR技術方便快捷、可在短時間內大量擴增目標核酸片段，所以該技術在基因克隆與重組表達、生物物種鑒別與分類、物種起源與進化、流行病病原檢測和法醫鑒定等領域得到了廣泛的應用。雖然PCR技木本身優勢明顯，但基于該技術的產品在大規模應用過程中卻面臨ー些問題的困擾，其中最為突出的是產品需要低溫冷凍保存和運輸。作為核酸擴增技術的ー種，PCR擴增需要由具有生物活性的酶的參與，而酶生物活性的長期保持需要低溫冷凍條件，同時PCR反應所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)和反應緩沖液等均需在冷凍條件下貯存，并且反復凍融會使這些成份失效，所以基于PCR擴增技術的產品要求在低溫冷凍條件進行運輸和保存，這ー方面增加了運輸成本，另ー方面也限制了這些產品在不具備低溫保存條件的環境或地區的應用。對于大規模生產、商品化的基于PCR擴增技術的產品，為了保證產品的一致性、穩定性和可靠性，也要求盡可能把各種反應試劑一次性添加和分裝，并使產品在貯存和運輸過程中具備盡可能長的保質期限。因此，發明一種能夠方便有效保存PCR反應試劑混合物的方法具有重要的價值。發明專利“聚合酶鏈式反應混合物的保存方法(ZL 0011250. 4)”公開了ー種利用核酸真空濃縮儀在低溫條件下干燥PCR反應試劑混合物來實現PCR反應試劑混合物長期保存的方法，但這種方法需要專門的核酸真空濃縮儀或真空冷凍干燥儀等復雜的設備，還需要消耗大量的能源，并不是ー種十分經濟的方法。發明專利“含高濃度甘油的PCR和RT-PCR全預混試劑(ZL 03117011. O)”公開了ー種利用添加30-65% (v/v)甘油實現PCR試劑低溫長期保存的方法，但該方法無法用于PCR試劑的常溫長期保存。因此有必要提供一種能使PCR試劑在常溫下長期保存的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種基于凝膠的多聚酶鏈反應試劑保存方法及反應試劑，以彌補現有技術的不足。本發明的ー個方面是提供一種在多聚酶鏈反應試劑中添加能形成凝膠的物質并形成凝膠從而使PCR反應試劑混合物在常溫或室溫長期保存的方法。本發明的另ー個方面是提供一種采用上述方法制作的PCR反應試劑，以及包含有該反應試劑的試劑盒。本發明的基于凝膠的多聚酶鏈反應試劑保存方法，是將ー種或幾種多聚酶鏈反應液的組分包埋在凝膠內進行保存。上述的凝膠，其熔點低于用于多聚酶鏈反應的聚合酶的滅活溫度。
上述的凝膠，還包括有熔點高于用于多聚酶鏈反應的聚合酶的滅活溫度的凝膠，這種高熔點的凝膠必須與熔點低于用于多聚酶鏈反應的聚合酶的滅活溫度的凝膠同時添カロ，添加比例不高于熔點低于用于多聚酶鏈反應的聚合酶的滅活溫度的凝膠質量的10%。上述的多聚酶鏈反應液的組分為用于多聚酶鏈反應的聚合酶。上述的多聚酶鏈反應液的組分還包括有引物、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、多聚酶鏈反應聚合酶的反應緩沖液中的任ー種或幾種。上述的用于多聚酶鏈反應的聚合酶為DNA聚合酶。上述的DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶。本發明的保存方法，ー種操作步驟如下首先將可形成凝膠的物質添加到多聚酶 鏈反應液的組分中，然后在低于多聚酶鏈反應的聚合酶的滅活溫度下將凝膠熔解，最后冷卻凝固凝膠進行保存。本發明的保存方法，另ー種操作步驟如下首先將可形成凝膠的物質與水或含水的溶劑加熱使之溶解配成濃縮的母液，然后將濃縮的母液加入到多聚酶鏈反應液的組分中，最后讓溫度下降使混合物由液態凝固為固態或半固態的凝膠進行保存。上述的可形成凝膠的物質在多聚酶鏈反應液的組分中的添加濃度質量體積百分比 g/ml 為 O. 01% 30%。上述的可形成凝膠的物質為能形成凝膠的多糖類物質和/或明膠類物質。上述能形成凝膠的多糖類物質和/或明膠類物質為淀粉、糊精、凝結多糖(又稱凝結膠、凝膠多糖、熱凝膠、可得然膠、卡德蘭)、結冷膠、黃原膠、槐豆膠、亞麻籽膠、魔芋膠、殼聚糖、瓊脂、瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、超低熔點瓊脂糖、紅藻膠、海藻酸(又稱藻酸、褐藻酸、海藻素)、海藻酸鹽(如海藻酸鈉，又被稱為海藻膠、褐藻膠或藻膠)、卡拉膠、果膠、低甲氧基果膠、明膠和阿拉伯膠中的任ー種或幾種。上述的可以形成凝膠的物質為能形成凝膠的人工聚合物。上述能形成凝膠的人工聚合物為甲基纖維素、羧甲基纖維素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任ー種或幾種。上述的凝結多糖在多聚酶鏈反應液的組分中的添加濃度質量體積百分比g/ml為O. 2% 3%，優選為 O. 5% 2. 5%ο上述的瓊脂糖在多聚酶鏈反應液的組分中的添加濃度質量體積百分比g/ml為
O.3% 3. 5%，優選為 O. 5% 3%。本發明還涉及ー種可在常溫下長期保存的多聚酶鏈反應試劑，該反應試劑是將除核酸模板外的ー種或幾種多聚酶鏈反應液的組分包埋在凝膠內制備的。本發明還包括一種可以在常溫保存和運輸的多聚酶鏈反應試劑盒，該試劑盒包括有可在常溫下長期保存的多聚酶鏈反應試劑，以及其它分子實驗需要的組分。采用本發明方法處理后的多聚酶鏈反應試劑，可常溫貯存和運輸，使用時無需特殊處理，直接使用即可。由于處理后的多聚酶鏈擴增反應試劑混合物呈固態狀，可以很方便的進行航空運輸，克服了此前反應試劑混合物呈液態較難利用航空方式進行長距離運輸的難題。同時本發明的方法和試劑盒具有エ藝簡單、成本低廉的特點，采用本發明方法處理后的多聚酶鏈反應試劑混合物及試劑盒在便利的貯存條件下(常溫或室溫等溫度條件)具有活性穩定持久的優點，這在大大降低多聚酶鏈反應試劑的貯運成本的同時，還為多聚酶鏈反應的實際操作帶來極大的便利。該發明必將有力促進多聚酶鏈反應技術的在科研、醫療、檢驗和檢疫等領域的運用和基于多聚酶鏈反應技術的診斷或檢測試劑產品的大規模推廣應用。
具體實施例方式在目前的分子實驗、檢測操作中，若是直接將PCR反應試劑(即多聚酶鏈反應液的組分)如引物、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶、DNA聚合酶的反應緩沖液(不同類型的PCR反應需要不同的反應試劑)等的混合物保存在常溫或者室溫條件下，通常情況下f 2天后這些反應試劑混合物就失去了對目的核酸的擴增能力。研究發現，在常溫或室溫的條件下，PCR反應試劑混合物中最容易失去反應活性的是DNA聚合酶，而這些聚合酶喪失活性的主要原因是由于長時間保存或溫度過高或溫度變化導致聚合酶活性中心維持高級結
構的氫鍵、離子鍵、ニ硫鍵等分子作用力受到破壞所致；在常溫或室溫條件下，多聚酶鏈反應液(即PCR反應試劑混合物)中的寡聚核苷酸引物、dNTP也會很快降解，無法參與基因擴增。申請人在長期的研究中發現，在PCR反應試劑混合物中添加O. 019T30%(W/V，即重量體積比)可以形成凝膠的物質，加熱至合適的溫度使凝膠分子熔解(或熔解)，然后使反應試劑混合物溫度下降，混合物可由液態變為固態(或半固態)的凝膠，聚合酶分子就會被凝膠分子形成的三維網狀結構所固定，聚合酶分子的空間結構(三維結構或高級結構)得以長期維持，聚合酶的活性即可長期保持。而且凝膠也會將PCR反應試劑混合物中的引物、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)以及聚合酶反應緩沖液中的各種成分固定，使其包埋在凝膠分子形成的微孔內，彼此間形成物理性的隔斷，同時也隔絕空氣，從而使PCR反應試劑混合物的各種成分得以長期穩定保存。本發明是通過在PCR反應試劑混合物中添加可以形成凝膠的物質并使反應試劑混合物形成凝膠，將反應試劑的成分包埋在凝膠內部的微孔內，使諸成分被固定、形成物理性的隔斷來實現PCR反應試劑混合物的常溫長期保存的。當需要使用添加了凝膠的PCR反應試劑混合物時，可在其中加入核酸模板按照PCR程序進行溫度循環，當加熱到一定溫度時凝膠完全熔化成液態，PCR反應即可順利進行。在較便利的貯存條件下(如常溫或室溫)和一定的貯存期內，上述添加凝膠后的PCR反應試劑混合物進行PCR反應所得的結果與用新鮮配制的PCR反應混合物所得到的結果完全相同。因不同類型的PCR所需的最適反應溫度不同，所以不同類型的PCR反應試劑混合物需要添加不同種類、不同熔點的凝膠或其不同比例的混合物來實現基于凝膠固定的常溫長期保存。實際使用中，應根據PCR所需要的最適溫度選擇在該溫度下能夠完全或部分熔解的凝膠以取得較佳保護及擴增效果；通常情況下，所選用的凝膠的熔點應低于用于多聚酶鏈反應的聚合酶的滅活溫度，有時為了提高凝膠的強度，可以添加部分熔點高于用于多聚酶鏈反應的聚合酶的滅活溫度的凝膠，但這種高熔點的凝膠必須與熔點低于用于多聚酶鏈反應的聚合酶的滅活溫度的凝膠同時添加，且添加比例不高于熔點低于用于多聚酶鏈反應的聚合酶的滅活溫度的凝膠的10%，如可利用“10%明膠+0. 1%結冷膠”的方式提高明膠的強度，或可利用“2. 0%瓊脂糖+0. 2%聚丙烯酰胺”的方式提高瓊脂糖凝膠的強度(上述百分比表示凝膠在多聚酶鏈反應液的組分中的添加濃度，為質量體積百分比g/ml)。上述凝膠是指溶液中的膠體粒子或高分子在一定條件下互相連接或自身分子吸水膨脹，形成空間網狀結構，結構空隙中充滿了作為分散介質的液體的ー種特殊的分散體
系O通常選用的可以形成凝膠的物質的是指各種能形成凝膠的多糖類物質、明膠類物質，如淀粉、糊精、凝結多糖(又稱凝結膠、凝膠多糖、熱凝膠、可得然膠、卡德蘭)、結冷膠、黃原膠、槐豆膠、亞麻籽膠、魔芋膠、殼聚糖、瓊脂、瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、紅藻膠、海藻酸(又稱藻酸、褐藻酸、海藻素)、海藻酸鹽(如海藻酸鈉，又被稱為海藻膠、褐藻膠或藻膠；又如海藻酸等)、卡拉膠、果膠、低甲氧基果膠、明膠和阿拉伯膠等；也可選用其他能形成凝膠的物質，如甲基纖維素、羧甲基纖維素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺等。實際使用中，應以熱可逆的凝膠為主，非熱可逆的凝膠可少量添加以提高凝膠的熔點、增強凝膠的強度。將PCR反應試劑混合物保存于常溫或者室溫，Γ2天后這些反應試劑混合物對目的核酸的擴增能力就基本完全喪失了。實驗結果表明，采用本發明的方法處理后的PCR反應試劑的混合物可以在常溫或室溫條件下存放2個月或以上而不會失去正常反應活性，在較低的溫度條件下(如4°C或以下)存放6個月仍具有正常的反應活性。
以下通過實施例對本發明作進ー步說明。實施例I :PCR反應試劑混合物添加凝膠后的保存效果分析I. PCR反應試劑混合物添加不同濃度和不同種類凝膠進行保存將除核酸模板以外的各種PCR反應試劑的混合物6048 μ L(包括PCR引物F和引物R 各 O. 4 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM, KCl 50mM, Tris/HCl (pH 9. 0) IOmM, MgCl2
I.5mM, l%Triton X-100，Taq DNA 聚合酶 630U)按每管 432 μ L 分裝于 14 個 I. 5mL 的離心管中，按表I第I列(共14行)所示的濃度和種類向每個I. 5mL的離心管中加入可形成凝膠的物質并混勻，然后將I. 5mL的離心管置于金屬浴上，按照不同凝膠的溶解溫度于5(T65°C保溫5分鐘(低于Taq DNA聚合酶的滅活溫度100°C )，使凝膠充分溶解，再將每個I. 5mL離心管中的混合物按24 μ L的量分裝于18個O. 2mL的離心管中，然后將每組18個裝有混合物的O. 2mL的離心管分別置于4°C、20°C (常溫)、37°C條件下保存(每個溫度條件下保存6個裝有混合物的O. 2mL的離心管，分3個保存時間段進行抽檢，每個時間段每次抽檢2個裝有混合物的O. 2mL的離心管作為重復)。2. PCR反應試劑混合物添加兩種及兩種以上凝膠進行保存將除核酸模板以外的各種PCR反應試劑的混合物6048 μ L (包括PCR引物F和引物 R 各 O. 4 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM, KCl 50mM, Tris/HCl (pH 9. 0) IOmM,MgCl2L 5mM, l%Triton X-100, Taq DNA 聚合酶 630U)按每管 432 μ L 分裝于 14 個 I. 5mL 的離心管中，按表2第I列(共14行)所示的濃度和種類向每個I. 5mL的離心管中加入凝膠并混勻，然后將I. 5mL的離心管置于金屬浴上，按照不同凝膠的溶解溫度于5(T63°C保溫5分鐘，使凝膠充分溶解，再將每個I. 5mL離心管中的混合物按24 μ L的量分裝于18個O. 2mL的離心管中，然后將每組18個裝有混合物的O. 2mL的離心管分別置于4°C、20°C和37°C條件下保存(每個溫度條件下保存6個裝有混合物的O. 2mL的離心管，分3個保存時間段進行抽檢，每個時間段每次抽檢2個裝有混合物的O. 2mL的離心管作為重復)。3. PCR反應試劑混合物的保存和有效性檢驗保存于4°C裝有反應試劑混合物的O. 2mL的離心管分別在貯存期滿2個月、4個月和6個月時進行抽樣檢驗，保存于20°C的裝有反應試劑混合物的O. 2mL的離心管分別在貯存期滿I個月、2個月和3個月時進行抽樣檢驗，保存于37°C的裝有反應試劑混合物的
O.2mL的離心管分別在貯存期滿10天、20天和30天時進行抽樣檢驗。檢驗方法如下I)依據上述9個貯存時間段，共需進行9批次、每批次56個的PCR反應試劑混合物的有效性檢測，每次檢測的時候需將變性后的對蝦白班綜合征病毒(White spot syndromevirus, WSSV)的核酸(30ng/ μ L) 56 μ L等量分裝于56個裝有混合有凝膠的PCR反應試劑混合物的O. 2mL的離心管中。同時，按照本實施例步驟I中的試劑比例配制新鮮的PCR反應液24μ L，添加變性后的WSSV核酸(30ng/l·! L) I μ L，作為陽性對照。2)將上述離心管于放入PCR儀中進行PCR反應95°C保溫5min，I個循環；95°C保溫30sec，63°C保溫30sec，72°C保溫lmin，共35個循環；72°C保溫5min，I個循環。PCR反應終止后，將上述部分陽性對照、對照和添加凝膠的反應體系擴增后的產物進行電泳檢測，結果顯示陽性對照有目的條帶出現，實驗設置的對照組(PCR反應試劑的混合物中不添加 任何凝膠直接在4° C、20°C和37° C條件下保存)均無擴增產物，添加不同濃度、不同種類凝膠的PCR反應試劑混合物的保存效果的檢測結果見表I和表2。添加不同濃度、不同種類凝膠的PCR反應試劑混合物保存后的檢測結果(見表I和
2)表明保存時間為I個月、2個月時，在4°C和20°C條件下貯存的混合物絕大部分都具有正常的反應活性；保存時間為10天和20天時，在37°C條件下貯存的混合物絕大部分都具有正常的反應活性。表I.不同濃度、不同種類凝膠對PCR反應試劑混合物的保護效果
權利要求
1.一種基于凝膠的多聚酶鏈反應試劑保存方法，其特征在干，是將ー種或幾種多聚酶鏈式反應液的組分包埋在凝膠內進行保存。
2.如權利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的凝膠，其熔點低于用于多聚酶鏈式反應的聚合酶的滅活溫度。
3.如權利要求2所述的保存方法，其特征在于所述的凝膠，還包括有熔點高于多聚酶鏈式反應的聚合酶的滅活溫度的凝膠，且添加比例不高于熔點低于用于聚酶鏈式反應的聚合酶的滅活溫度的凝膠質量的10%。
4.如權利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的多聚酶鏈式反應液的組分為用于多聚酶鏈式反應的聚合酶。
5.如權利要求4所述的保存方法，其特征在于所述的多聚酶鏈式反應液的組分還包括有引物、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、多聚酶鏈式反應聚合酶反應緩沖液中的任ー種或幾種。
6.如權利要求2-5任一項所述的保存方法，其特征在于所述的用于多聚酶鏈式反應的聚合酶為DNA聚合酶。
7.如權利要求6所述的保存方法，其特征在于所述的DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶。
8.如權利要求I所述的保存方法，其特征在于，操作步驟如下首先將可形成凝膠的物質添加到多聚酶鏈式反應液的組分中，然后在低于多聚酶鏈反應的聚合酶的滅活溫度下將凝膠熔解，最后冷卻凝固凝膠進行保存。
9.如權利要求I所述的保存方法，其特征在于操作步驟如下首先將可形成凝膠的物質與含水的溶劑加熱使之溶解配成濃縮的母液，然后將濃縮的母液加入到多聚酶鏈式反應液的組分中，最后讓溫度下降使混合物由液態凝固為固態或半固態的凝膠進行保存。
10.如權利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝膠的物質在多聚酶鏈式反應液的組分中的添加濃度質量體積百分比g/ml為O. 01°/Γ30%。
11.如權利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝膠的物質為能形成凝膠的多糖類物質和/或明膠類物質。
12.如權利要求11所述的保存方法，其特征在于所述的多糖類物質和/或明膠類物質為淀粉、糊精、凝結多糖、結冷膠、黃原膠、槐豆膠、亞麻籽膠、魔芋膠、殼聚糖、瓊脂、瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、超低熔點瓊脂糖、紅藻膠、海藻酸、海藻酸鹽、卡拉膠、果膠、低甲氧基果膠、明膠、阿拉伯膠中的任ー種或幾種。
13.如權利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝膠的物質為能形成凝膠的人工聚合物。
14.如權利要求13所述的保存方法，其特征在于所述的人工聚合物為甲基纖維素、羧甲基纖維素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任ー種或幾種。
15.如權利要求12所述的保存方法，其特征在于所述的凝結多糖在多聚酶鏈式反應液的組分中的添加濃度質量體積百分比g/ml為O. 2°/Γ3%。
16.如權利要求12所述的保存方法，其特征在于所述的超低熔點瓊脂糖在多聚酶鏈式反應液的組分中的添加濃度質量體積百分比g/ml為O. 39Γ3. 5%。
17.一種多聚酶鏈反應試劑，其特征在于，所述的反應試劑是將除核酸模板外的ー種或幾種多聚酶鏈式反應液的組分包埋在凝膠內制備的。
18.如權利要求17所述的反應試劑，其特征在于所述的多聚酶鏈式反應液為多聚酶鏈反應聚合酶、引物、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、多聚酶鏈反應聚合酶反應緩沖液中的任ー種或幾種。
19.ー種多聚酶鏈反應試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含有權利要求17所述的多聚酶鏈反應試劑。
全文摘要
本發明涉及一種基于凝膠的多聚酶鏈反應試劑保存方法及反應試劑，是將一種或幾種多聚酶鏈式反應液的組分包埋在凝膠內進行保存，其中凝膠的熔點低于用于多聚酶鏈反應擴增的聚合酶的滅活溫度。另外本發明還包括可以常溫保存和運輸的反應試劑和試劑盒，采用本發明方法處理后的多聚酶鏈反應試劑，可常溫貯存和運輸，使用時無需特殊處理，直接使用即可。由于處理后的多聚酶鏈擴增反應試劑混合物呈固態狀，可以很方便的進行航空運輸，克服了此前反應試劑混合物呈液態較難利用航空方式進行長距離運輸的難題。
文檔編號C12N15/10GK102703428SQ201210178919
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者劉慶慧, 劉莉, 宋曉玲, 張慶利, 楊冰, 黃倢 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所