專利名稱：冬蟲夏草中國被毛孢合成代謝腺苷酸的酶、基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一個來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與腺嘌呤核苷出發合成代謝腺嘌呤核苷酸的腺苷激酶(adenosine kinase),編碼這個酶的基因及其應用。
背景技術：
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統真菌藥材資源，具有代謝產物和生物活性多樣的特點，在生物醫藥領域展現出巨大的應用和發展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫認為，冬蟲夏草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥。現代藥理學已證實，冬蟲夏 草具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。天然蟲草具有嚴格的寄生性以及特殊的生態環境，故其產量很低，價格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長環境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發酵上。利用液體深層發酵培養冬蟲夏草菌絲體、提取物或發酵液，是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發酵生產蟲草替代品，既可有效保護蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環境和蟲草寄生條件嚴格的限制，適合于工業化大規模生產。生產出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國內外一直致力于蟲草菌絲體的發酵培養。人工發酵培養冬蟲夏草中國被毛孢得到的菌絲，經毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產蟲草制品，以彌補自然資源的短缺，通過對發酵條件的優化，菌絲體生物量和代謝產物的量均有明顯提聞。近年來，隨著天然產物化學和現代色譜技術的飛速發展，在對蟲草產品研發中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉向更深層次的功能性代謝產物研究。國內外已對蟲草代謝產物做了大量的研究，代謝產物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類化合物，其中嘌呤類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。核苷類是蟲草最主要的活性物質之一，其中嘌呤類核苷包括腺苷和鳥苷及它們的前體類物質次黃嘌呤核苷(肌苷)和黃嘌呤核苷等。研究表明腺苷可作為心臟病治療藥物，還可用于診斷冠心病，其類似物具有抗病毒活性和抗腫瘤作用；肌苷可用于心臟病、肝病、白血球減少癥、血小板減少癥、視神經萎縮和中心性視網膜炎等疾病的治療，能預防及解除由血防藥物引起的對心臟或肝臟的副作用；鳥苷則可作為三氮唑核苷、無環鳥苷等許多抗病毒藥物的合成原料。由于嘌呤核苷及其類似物的重要生理作用，國內外有關微生物生產嘌呤類核苷已有很多石開究° Matsui 等(Matsui, Sato et al. Mutation of an inosine-producingstrain of Bacillus subtilis to DL—methionine sulfoxide resistance for guanosineproduction[J]. Applied and Environmental Microbiology,1997, 34(4):337-341.)對肌苷生產菌B. subtilisl411進行誘變處理得到鳥苷高產菌AG169。為了進一步提高生產水平，國內有研究人員對生產菌中嘌呤核苷合成途徑的遺傳背景進行了研究(Qian，Caiet al. Analysis of three nucleotide sequences involved in purine nucleotidesbiosynthesis in inosine and guanosine-producing bacilus subtilis.ActaMicrobiologica Sinica, 2003,43(2) :200-205.)。該研究從分子水平揭示了生產菌的部分遺傳特性，有助于在基因水平理解產物在生產菌中的積累。 目前，所應用的嘌呤類核苷生產菌以枯草芽孢桿菌為主，而作為重要合成代謝嘌呤類核苷的冬蟲夏草菌，還只停留在代謝產物成分分析和功效的研究上，對冬蟲夏草菌嘌呤類核苷合成代謝途徑中相關基因和蛋白的研究還很少見。
發明內容
本發明目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術問題，對“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢合成代謝腺嘌呤核苷酸的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與腺嘌呤核苷出發合成代謝腺嘌呤核苷酸的酶、編碼基因及其應用。本發明采用的技術方案是來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與腺嘌呤核苷出發合成代謝腺嘌呤核苷酸的腺苷激酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示(記為PimB蛋白)；該酶可催化腺嘌呤核苷制備腺嘌呤核苷酸。由腺嘌呤核苷合成代謝獲得腺嘌呤核苷酸的路徑如下所示
權利要求
1.來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與腺嘌呤核苷合成代謝腺嘌呤核苷酸的腺苷激酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.如權利要求I所述的腺苷激酶在生物催化腺嘌呤核苷制備腺嘌呤核苷酸中的應用。
3.編碼權利要求I所述腺苷激酶的基因。
4.如權利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
5.如權利要求3或4所述的基因在構建能夠生物催化腺嘌呤核苷制備腺嘌呤核苷酸的基因工程菌中的應用。
全文摘要
本發明涉及一個來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與腺嘌呤核苷出發合成代謝腺嘌呤核苷酸的酶，編碼這個酶的基因及其應用。所述腺苷激酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼基因對應為SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本發明從原理上對腺嘌呤核苷合成腺嘌呤核苷酸的代謝途徑進行了詳細研究，包含本發明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉導、轉化、結合轉移的方法轉入工程菌中，通過調節腺嘌呤核苷酸生物合成基因的表達，賦予宿主腺嘌呤核苷酸的高表達性，為擴大腺嘌呤核苷酸的產量提供了有效途徑，具有重大應用前景。
文檔編號C12P19/32GK102776162SQ20121017522
公開日2012年11月14日 申請日期2012年5月28日 優先權日2012年5月28日
發明者吳暉, 李邦良, 柳志強, 王鴻艷, 薛亞平, 袁水金, 許峰, 許靜, 鄭裕國, 陳麗芳 申請人:杭州中美華東制藥有限公司, 浙江工業大學