tRNA組合物和其用途的制作方法

專利名稱：tRNA組合物和其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及翻譯生物化學領域。本發明涉及制造tRNA的方法和tRNA組合物以及其用途。本發明還涉及使用所述tRNA和相關組合物在細胞中制造蛋白質的方法。
背景技術：
從細菌到人類，每一種已知有機體的遺傳密碼都編碼相同的二十種常見氨基酸。這二十種相同天然氨基酸的不同組合形成進行幾乎所有生命復雜過程(從光合作用到信號轉導和免疫反應)的蛋白質。為研究和改變蛋白質結構和功能，科學家們已嘗試操縱蛋白質的遺傳密碼和氨基酸序列。然而，難以去除由遺傳密碼所強加的將蛋白質局限于二十種遺傳編碼的標準結構單元(building block)(其中極少見的特例為，硒代半胱氨酸(selenocysteine)(例如參看 A. Bock 等人，(1991), Molecular Microbiology5:515-20)和卩比咯賴氨酸(pyrrolysine)(例如參看 G. Srinivasan 等人，(2002), Science296:1459-62))的約束。已取得一些進展來去除這些約束，但這一進展受到限制并且合理地控制蛋白質結構和功能的能力仍不成熟。舉例來說，化學家們已開發出合成并且操縱小分子結構的方法和策略(例如參看 E. J. Corey, & X. -M. Cheng, The Logic of Chemical Synthesis(Wiley-Inter science, New York, 1995))。全合成(例如參看 B. Merri fie Id, (1986), Science232:341-7 (1986))和半合成方法(例如參看 D. Y. Jackson 等人,(1994) Science266:243-7 ； 和 P.E. Dawson, & S. B. Kent, (2000), Annual Review of Biochemistry69:923-60)使得合成肽和小蛋白質成為可能，但這些方法限制了 10千道爾頓(kiloDalton, kDa)以上蛋白質的效用。誘變方法盡管有效，但也局限于有限數量的結構改變。在多種情況中，在整個蛋白質中競爭性并入常見氨基酸的結構極其接近的類似物已成為可能。例如參看 R. Furter, (1998), Protein Science 7:419-26 ;K. Kirshenbaum 等人,(2002). ChemBioChem3:235-7 ；和 V. Poring 等人,(2001). Science 292:501-4。化學肽連接和天然化學連接描述于美國專利第6，184，344號、美國專利公開案第2004/0138412號、美國專利公開案第2003/0208046號、WO 02/098902和WO 03/04223中，這些專利都是以引用的方式并入本文中。Lu等人于Mol Cell. 2001 Oct;8 (4) :759-69中描述一種以化學方式將蛋白質與含有非天然氨基酸的合成肽連接的方法(稱為蛋白質連接)。早期的工作證實，大腸桿菌(E. coli)的翻譯機器將容納結構與常見二十種氨基酸類似的氨基酸。參看 Hortin, G.和 Boime, I. (1983) Methods Enzymol. 96:777-784。通過放寬內源性大腸桿菌合成酶的特異性從而使其活化非天然氨基酸以及其同類天然氨基酸，使這項工作得以進一步擴充。此外，經證實，也可以使用編輯域的突變來擴充內源性合成酶的底物范圍。參看Doring，V.等人，(2001) Science 292:501-504。然而，這些策略局限于重新編碼遺傳密碼而非擴展遺傳密碼，并且產生非天然氨基酸對常見二十種氨基酸中的一種的不同程度的取代。隨后證實，可通過將以化學方式氨酰基化的正交琥珀抑制性tRNA加到活體外轉錄/翻譯反應中而在活體外將非天然氨基酸位點特異性地并入蛋白質中。例如參看 Noren，C.J.等人(1989) Science 244:182-188 ；Bain, J. D.等人,(1989) T. Am.Chem.Soc. 111:8013-8014 ;Dougherty,D.A. (2000)Curr.Opin. Chem. Biol. 4, 645-652 ；Cornish, V. ff.等人(1995) Angew. Chem. Int. Ed. 34 : 621-633 I. A. Ellman 等人，(1992). Science255:197-200 和 D. Mendel 等人，(1995). Annual Review ofBiophysics and Biomolecular Structure 24:435-462。這些研究表明，核糖體和翻譯因子可與大量非天然氨基酸、甚至具有不常見結構的氨基酸相容。不幸的是，tRNA的化學氨 酰基化很難，并且這種方法的化學計量特性極大限制了能夠產生的蛋白質的量。已將非天然氨基酸顯微注射到細胞中。舉例來說，通過顯微注射以化學方式錯酸基化的嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila) tRNA (例如，M. E. Saks 等人(1996), Anengineered Tetrahymena tRNA Gln for in vivo incorporation of unnatural aminoacids into proteins by nonsense suppression, J. Biol. Chem. 271:23169-23175)和相關mRNA而將非天然氨基酸引入爪蟾卵母細胞(Xenopus oocyte)中的煙堿型乙酰膽堿受體中(例如，M. ff. Nowak 等人(1998), In vivo incorporation of unnatural amino acids intoion channels in Xenopus oocyte expression system，Method EnzymoI. 293:504-529)。還參看 D. A. Dougherty (2000), Unnatural amino acids as probes of proteinstructure and function, Curr. Opin. Chem. Biol. 4:645-652 和 M. ff. Nowak, P. C. Kearney,J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, ff. G. Zhong, J. Thorson, J.N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty 和 H. A. Lester, Science, 268:439 (I995)。將爪蟾卵母細胞與活體外制得的以下兩種RNA物質共注射編碼在所關注的氨基酸位置處具有UAG終止密碼子的靶蛋白的mRNA，和經所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制性tRNA。隨后所述卵母細胞的翻譯機器將非天然氨基酸插入UAG指定的位置處。不幸的是，這種方法局限于細胞中可進行顯微注射的蛋白質，并且由于相關tRNA是在活體外以化學方式酰基化并且無法再酰基化，故蛋白質的產率極低。為克服這些缺點，將新穎組件(例如，正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和正交tRNA/正交氨酰基tRNA合成酶對)加到原核生物大腸桿菌(Escherichia coli，E. coli)(例如參看 L. Wang 等人，(2001)，Science 292:498-500)和真核生物釀酒酵母(Sacchromycescerevisia, S. cerevisiae)(例如 J. Chin 等人，Science 301:964-7 (2003))的蛋白質生物合成機器中，所述蛋白質生物合成機器能夠在活體內將非遺傳編碼的氨基酸并入蛋白質中。已使用這種方法響應(例如)琥珀密碼子(TAG)以高保真度將多種具有新穎化學、物理或生物特性的新穎氨基酸有效地并入大腸桿菌和酵母中的蛋白質中，所述新穎氨基酸包括光親和標記和光致異構化氨基酸、光交聯氨基酸(例如參看Chin，J.W.等人(2002)Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 99:11020-11024 ；和 Chin, J. W.等人，(2002) T. Am. Chem.Soc. 124:9026-9027)、酮某氡某酸(例如參看 Wang, L.等人，(2003)Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 100:56-61 和 Zhang, Z.等人，Biochem. 42 (22) : 6735-6746 (2003))、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸。例如參看J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem3(11) : 1135-1137 和 L. Wang, & P. G. Schultz, (2002)，Chem. Comm. . 1:1—11。已報導若干其它正交對。已針對大腸桿菌中非天然氨基酸并入的可能性描述自釀酒酵母tRNA和合成酶獲得的谷氨酰胺酰基(例如參看Liu，D. R.和Schultz，P. G. (1999)Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 96:4780-4785)、天冬氨酸基(例如參看 Pastrnak, M.等人，(2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286)和酪氨酰基(例如參看 Ohno, S.等人，(1998)I. Biochem. (Tokyo, Tpn. ) 124:1065-1068 ；和 Kowal，A. K.等人(2001)Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 98:2268-2273)系統。也已描述自大腸桿菌谷氨酰胺酰基(例如參看Kowal，A.K.等人，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. .98:2268-227)和酪氨酰基(例如參看Edwards, H.和 Schimmel, P. (1990)Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641)合成酶獲得的系統以用于釀酒酵母中。已使用大腸桿菌酪氨酰基系統在活體內將3-碘-L-酪氨酸并入哺乳動物細胞中。參看 Sakamoto, K.等人，(2002)Nucleic Acids Res. 30:4692-4699。通常,這些系統都利用琥珀終止密碼子。為進一步擴展遺傳密碼，需要開發生物合成機器(例如，tRNA)的經改進和/或額外組件。如在評估以下揭示內容后將顯而易見，本發明滿足這些要求和其它要求。

發明內容
為擴展遺傳密碼，本發明提供制造正交tRNA的組合物和方法。氨酰基tRNA合成酶利用非天然編碼的氨基酸使本發明的tRNA氨酰基化。可使用這些翻譯組件響應tRNA所識別的選擇性密碼子將所選氨基酸并入正在生長的多肽鏈(在核酸翻譯的過程中)的特定位置中。在細胞中制造在特定位置處具有所選氨基酸的蛋白質的方法也為本發明的特征。舉例來說，一種方法包括在適當的培養基中使細胞生長，其中所述細胞包含包括至少一個選擇性密碼子并且編碼蛋白質的核酸；和提供所選氨基酸。所述細胞另外包含正交tRNA(0-tRNA)，其在細胞中起作用并且識別選擇性密碼子；和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)，其優先利用所選氨基酸使0-tRNA氨酰基化。通常，0-tRNA在存在同類合成酶的情況下包含抑制活性。由本方法制造的蛋白質也為本發明的特征。


圖I一繪示具有TVC莖干突變位點的J17 tRNA的三葉草結構；圖2-繪示使用J17或J17突變體(F12、F13、F14)進行的人生長激素中琥珀突變的抑制。通過SDS PAGE分析各樣本的全細胞溶解產物；圖3-繪示在不同細胞系中使用F13進行的人生長激素中琥珀突變的抑制。
具體實施方式
定義
在詳細描述本發明之前，應了解，本發明不限于特定生物系統，其當然可以變化。還應了解，本文所使用的術語只是出于描述特定實施例的目的，并且不打算限制僅受隨附權利要求限制的本發明的范圍。除非另作明確指示，否則如本文和隨附權利要求中所使用，單數形式“一”和“所述”包括多個參考物。因此，例如提及“一細胞”包括兩個或兩個以上細胞的組合并且包括所屬領域技術人員已知的其等效物等。對“細菌”的提及包括細菌的混合物等。除非本文和下文說明書的剩余部分中另作定義，否則本文所使用的所有科技術語都具有與本發明所屬領域技術人員通常所了解相同的含義。本文所提及的所有公開案和專利都是以引用的方式并入本文中以達到描述和揭示(例如)所述公開案中所述的可能與當前所述的發明結合使用的構筑體和方法的目的。僅提供本文所討論的公開案在本申請案申請日期之前的揭示內容。本文在任何方面都不應解釋為承認本發明者無權由于現有發明或任何其它原因使所述揭示案的日期提前。MM :當蛋白質和/或蛋白質序列是天然或以人工方式從共同的祖先蛋白質或蛋 白質序列得到時，其為“同源”的。類似地，當核酸和/或核酸序列是天然或以人工方式從共同的祖先核酸或核酸序列得到時，其為“同源”的。舉例來說，可通過任何可用的誘變方法來修飾任何天然存在的核酸以使其包括一個或一個以上選擇性密碼子。當表達時，這一經誘變核酸將編碼包含一個或一個以上所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。當然，突變方法可另外改變一個或一個以上標準密碼子，借此也使所得突變蛋白質中的一個或一個以上標準氨基酸改變。可將所述一個或一個以上標準氨基酸變為非天然氨基酸或天然氨基酸。同源性一般是從兩種或兩種以上核酸或蛋白質(或其序列)之間的序列相似性推斷得出。可用于確定同源性的序列之間相似性的確切百分比隨所討論的核酸和蛋白質而變化，但通常使用僅25%的序列相似性確定同源性。較高的序列相似性水平(例如，30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%，或99%以上)也可用于確定同源性。測定序列相似性百分比的方法(例如，使用默認參數的BLASTP和BLASTN)在本文中加以描述并且一般可用。正交如本文所使用，術語“正交”是指以降低的效率被所關注的系統(例如，翻譯系統，例如細胞)使用的分子(例如，正交tRNA (0-tRNA)和/或正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)).正交是指正交tRNA和/或正交RS無法在所關注的翻譯系統中起作用或以降低的效率(例如，低于20%的效率、低于10%的效率、低于5%的效率或例如低于1%的效率)在所關注的翻譯系統中起作用。舉例來說，當與通過內源性RS使內源性tRNA氨酰基化相比較時，所關注的翻譯系統中的任何內源性RS以降低的效率或甚至為零的效率使所關注的翻譯系統中的正交tRNA氨酰基化。在另一個實例中，當與通過內源性RS使內源性tRNA氨酰基化相比較時，正交RS以降低的效率或甚至為零的效率使所關注的翻譯系統中的任何內源性tRNA氨酰基化。可將第二正交分子引入細胞中從而與第一正交分子一起作用。舉例來說，正交tRNA/RS對包括所引入的在細胞中相對于相應內源性tRNA/RS對以一定效率(例如，約50%效率、約60%效率、約70%效率、約75%效率、約80%效率、約85%效率、約90%效率、約95%效率或約99%或更高效率)一起作用的互補組件。“正交性的改進”是指與原材料或天然存在的tRNA或RS相比正交性增強。同類物:術語“同類物”是指一起作用的組件，例如tRNA和氨酰基tRNA合成酶。所述組件也可稱為互補體。優先氨酰基化:術語“優先氨酰基化”是指與O-RS使天然存在的tRNA或用于產生0-tRNA的原材料氨酰基化相比，O-RS利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使0-tRNA氨酰基化的效率，例如約70%效率、約75%效率、約80%效率、約85%效率、約90%效率、約95%效率或約99%或更高效率。隨后將非天然氨基酸以高保真度(例如)以對指定選擇性密碼子大于約70%的效率、對指定選擇性密碼子大于約75%的效率、對指定選擇性密碼子大于約80%的效率、對指定選擇性密碼子大于約85%的效率、對指定選擇性密碼子大于約90%的效率、對指定選擇性密碼子大于約95%的效率或對指定選擇性密碼子大于約99%的效率并入正在生長的多肽鏈中。詵擇件密碼子:術語“選擇性密碼子”是指在翻譯過程中由0-tRNA識別且不被內源性tRNA識別的密碼子。0-tRNA反密碼子環識別mRNA上的選擇性密碼子并且在多肽中的這一位點并入其氨基酸，例如所選氨基酸，諸如非天然氨基酸。選擇性密碼子可例如包括 (但不限于)無義密碼子，諸如終止密碼子，包括(但不限于)琥珀密碼子、赭石密碼子和蛋白石密碼子；四個或四個以上堿基密碼子；稀有密碼子；自天然或非天然堿基對獲得的密碼子等。對于指定系統來說，選擇性密碼子也可以包括天然的三堿基密碼子中的一種，其中內源性系統不使用(或極少使用)所述天然的三堿基密碼子。舉例來說，這包括缺乏識別天然的三堿基密碼子的tRNA的系統，和/或天然的三堿基密碼子為稀有密碼子的系統。抑制件tRNA :抑制性tRNA是(例如)通過提供響應選擇性密碼子將氨基酸并入多肽鏈的機制來改變指定翻譯系統中信使RNA(mRNA)的閱讀的tRNA。舉例來說，抑制性tRNA可通讀包括(但不限于)終止密碼子、四堿基密碼子或稀有密碼子的密碼子。抑制活件:術語“抑制活性”是指tRNA (例如，抑制性tRNA)通讀選擇性密碼子的能力。活性可以當與對照(例如缺乏同類合成酶)相比時所觀察到的活性百分比表示。翻譯系統:術語“翻譯系統”是指將天然存在的氨基酸并入正在生長的多肽鏈(蛋白質)所需的組件。翻譯系統的組件可包括(例如)核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。本發明的組件可加到活體外或活體內翻譯系統中。翻譯系統的實例包括(但不限于)非真核細胞，例如細菌(諸如，大腸桿菌)；真核細胞，例如酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆蟲細胞；無細胞翻譯系統，例如細胞溶解產物等。翻譯系統可為細胞翻譯系統或無細胞翻譯系統，且可為原核細胞或真核細胞翻譯系統。細胞翻譯系統包括(但不限于)所需核酸序列可轉錄成mRNA且所述mRNA可經翻譯的全細胞制劑，諸如透性化細胞或細胞培養物。無細胞翻譯系統可為市售，且眾所周知許多不同的類型和系統。無細胞系統的實例包括(但不限于)原核生物溶解產物(諸如大腸桿菌溶解產物)和真核生物溶解產物(諸如麥芽提取物)、昆蟲細胞溶解產物、兔網織紅細胞溶解產物、兔卵母細胞溶解產物和人類細胞溶解產物。當所得蛋白質經糖基化、磷酸化或另外經修飾時，由于許多所述修飾僅可能在真核生物系統中，故可優選真核生物提取物或溶解產物。這些提取物和溶解產物中的一些可為市售(Promega ;Madison, Wis. ；Stratagene ；LaJolla, Calif. ;Amersham ;Arlington Heights, 111. ；GIBC0/BRL ；Grand Island, N. Y. X 可用于翻譯分泌型蛋白質的膜提取物(諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物)也可用。也可使用重建的翻譯系統。也已成功地使用純翻譯因子的混合物將mRNA翻譯成蛋白質以及溶解產物或補充有純翻譯因子的溶解產物的組合，所述純翻譯因子諸如起始因子-I (IF-l)、IF-2、IF-3 (a或￠)、延長因子T (EF-Tu)或終止因子。還可使無細胞系統與轉錄 / 翻譯系統偶聯，其中如 Current Protocols in Molecular BiologyCF. M. Ausubel等人編，Wiley Interscience, 1993)(其是以引用的方式清楚地并入本文)中所述,將DNA弓I入所述系統中，轉錄成mRNA且翻譯所述mRNA。在真核轉錄系統中轉錄的RNA可為異核RNA ChnRNA)或5’端帽子(7-甲基鳥苷)和3’端聚A尾成熟mRNA的形式，此可為某些翻譯系統的優勢。舉例來說，在網織紅細胞溶解系統中以高效率翻譯經封端mRNA。所選氨基酸:術語“所選氨基酸”是指任何所需的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。如本文所使用，術語“非天然氨基酸”或“非天然編碼的氨基酸”是指不為20種常見的天然存在的氨基酸中的一種或硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸的任何氨基酸、經修飾氨基酸和/或氨基酸類似物。可以與術語“非天然編碼的氨基酸”和“非天然氨基酸(unnatural aminoacid)”以相同意義使用的其它術語為“非天然氨基酸(“non-natural amino acid”)”、“非天然存在的氨基酸”和其各種以連字符連接和不以連字符連接的型式。術語“非天然編碼的氨基酸”還包括(但不限于)通過對天然編碼的氨基酸(包括但不限于，20種常見氨基酸或吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸)進行修飾(例如，翻譯后修飾)而產生但其本身未通過翻譯復 合物天然并入到正在生長的多肽鏈中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的實例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-蘇氨酸和0-磷酸酪氨酸。自……獲得:如本文所使用，術語“自……獲得”是指從特定分子或有機體分離或使用來自特定分子或有機體的信息制得的組件。陽性選擇或篩選標記如本文所使用，術語“陽性選擇或篩選標記”是指當存在(例如，經表達、經活化等)時導致鑒別具有陽性選擇標記的細胞與不具有陽性選擇標記的細胞的標記。陰性選擇或篩選標記:如本文所使用，術語“陰性選擇或篩選標記”是指當存在(例如，經表達、經活化等)時允許鑒別不具有所需特性(例如，當與具有所需特性的細胞相比較時)的細胞的標記。報告基因如本文所使用，術語“報告基因”是指可用于選擇所關注的系統中的革巴組件的組件。舉例來說，報告基因可包括蛋白質，例如賦予抗生素抗性或敏感性的酶(包括但不限于，￠-內酰胺酶、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)等)、熒光篩選標記(包括但不限于，綠色熒光蛋白質(例如GFP)、YFP、EGFP, RFP)、發光標記(包括但不限于，螢火蟲熒光素酶蛋白)、基于親和力的篩選標記或陽性或陰性選擇標記基因(諸如lacZ、^ -gal/lacZ ( ^ -半乳糖苷酶)、ADH (醇脫氫酶)、his3、ura3、leu2、lys2 等)。直孩生鹽如本文所使用，術語“真核生物”是指屬于系統發育真核生物領域的有機體，諸如動物(包括但不限于，哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包括但不限于，單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、小孢子蟲、原生生物等。非真核生物如本文所使用，術語“非真核生物”是指非真核有機體。舉例來說，非真核有機體可屬于系統發育真細菌領域(包括但不限于，大腸桿菌、極端嗜熱細菌(Thermus thermophilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等)或系統發育古細菌領域(例如詹氏甲燒球菌(Methanococcusjannaschii);嗜熱自養甲燒桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum);嗜鹽古菌(Halobacterium),諸如沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferax volcanii)和嗜鹽古菌NRC-1(Halobacterium species NRC-1);閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus);強烈火球菌(Pyrococcus furiosus);掘越氏熱球菌(Pyrococcus horikoshii);嗜熱泉生古細菌(Aeuropyrum pernix)等)。保守變異體:術語“保守變異體”是指在功能上與得到保守變異體的組件(例如0-tRNA或0-RS)類似但序列變異的翻譯組件，例如保守變異體0-tRNA或保守變異體0-RS。舉例來說，O-RS將利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使互補0-tRNA或保守變異體0-tRNA氨酰基化，但所述0-tRNA和所述保守變異體0-tRN A不具有相同序列。類似地，可通過互補O-RS或保守變異體O-RS利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使tRNA氨酰基化，但所述O-RS和所述保守變異體O-RS不具有相同序列。保守變異體的序列可具有(例如)一處變異、兩處變異、三處變異、四處變異或五處或五處以上變異，只要保守變異體與相應0-tRNA或O-RS互補即可。選擇或篩選劑:如本文所使用，術語“選擇或篩選劑”是指當存在時允許從群體中選擇/篩選某些組件的試劑。舉例來說，選擇或篩選劑例如包括(但不限于)養分、抗生素、光波長、抗體、經表達聚核苷酸等。選擇劑的(例如)濃度、強度等可變化。術語“未有效識別”是指來自一種有機體的RS使0-tRNA氨酰基化的效率(例如)小于約10%、小于約5%或小于約1%。適于制造包括一個或一個以上所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的蛋白質的翻譯系統已描述于名稱為 “METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL tRNA SYNTHETASE PAIRS” 的美國專利申請案 10/126，931 和名稱為 “INVIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS. ”的 10/126, 927 中。此外，參看名稱為“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”的USSN 10/825，867。這些申請案的每一個都是以全文引用的方式并入本文。所述翻譯系統一般包含包括正交tRNA(0-tRNA)、正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)和所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的細胞，其中O-RS利用所選氨基酸使0-tRNA氨酰基化。本發明的正交對由0-tRNA (例如，抑制性tRNA、移碼tRNA等)和O-RS構成。0-tRNA識別第一選擇性密碼子并且在存在同類合成酶的情況下響應選擇性密碼子而具有抑制活性。細胞使用所述組件將所選氨基酸并入正在生長的多肽鏈中。舉例來說，也可存在包含編碼所關注的多肽的聚核苷酸的核酸，其中所述聚核苷酸包含由0-tRNA識別的選擇性密碼子。翻譯系統也可以是活體外系統。本發明的tRNA分子可用于任何翻譯系統中，包括在翻譯中利用核糖體的系統。翻譯系統也可為無細胞(活體外)翻譯系統。在可包括mRNA作為模板(活體外翻譯)或DNA作為模板(活體外轉錄與翻譯的組合)的這些系統中，活體外合成是由核糖體指導。已將相當多的努力用于開發無細胞蛋白質表達系統中。例如參看Kim, D. M. 和 J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering,74:309-316 (2001)；Kim, D. M.和 J. R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542，(2000) ；Kim, D.M.和 J. R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390，(2000) ；Kim, D. M.和J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering,66,180-188, (1999)；和 Patnaik, R.和 J. R. Swartz, Biotechniques 24，862-868，(1998);美國專利第 6，337，191 號；美國專利公開案第2002/008 1660號；W000/55353 ;W0 90/05785，所述專利文獻都是以引用的方式并入本文。可應用的另一種方法包括mRNA-肽融合技術。例如參看R. Roberts和 J.Szostak,Proc. Natl Acad.Sci. (USA)94:12297-12302 (1997) ；A.Frankel 等人，Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003)。以本方法，在核糖體上將與嘌呤霉素連接的mRNA模板翻譯成肽。如果已對一個或一個以上tRNA分子進行修飾，那么也可將非天然氨基酸并入肽中。閱讀最后一個mRNA密碼子后，嘌呤霉素將俘獲肽的C端。如果在活體外檢定中發現所得mRNA-肽連結物具有引人關注的特性，那么可輕易地從mRNA序列揭示其身份。以此方式，可篩選包含一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的多肽的文庫以鑒別具有所需特性的多肽。目前，據報導，以純組件進行的活體外核糖體翻譯將允許合成經非天然編碼的氨基酸取代的妝。例如參看A. Forster 等人，Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003)。在某些實施例中，包含本發明的tRNA的大腸桿菌細胞包括所述翻譯系統。舉例來說，本發明的大腸桿菌細胞包括正交tRNA(0-tRNA)，其中所述0-tRNA在存在同類合成酶的 情況下響應選擇性密碼子而包含抑制活性；正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS);所選氨基酸；和核酸，其包含編碼所關注的多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含由0-tRNA識別的選擇性密碼子。本發明還在細胞中提供多個0-tRNA/0-RS對，其允許并入一個以上所選氨基酸。在某些實施例中，細胞可另外包括另一不同的0-tRNA/0-RS對和第二所選氨基酸，其中所述0-tRNA識別第二選擇性密碼子并且所述O-RS優先利用第二所選氨基酸使0-tRNA氨酰基化。舉例來說，細胞可另外包含(例如)自詹氏甲烷球菌的酪氨酰基tRNA合成酶獲得的琥珀抑制性tRNA-氨酰基tRNA合成酶對。0-tRNA和/或O-RS可天然存在或者可通過來自多種有機體的天然存在的tRNA和/或RS的突變(例如，其產生tRNA文庫和/或RS文庫)得到。舉例來說，制造正交tRNA/氨酰基tRNA合成酶對的一種策略涉及將來自(例如)除宿主細胞外的其它來源或多種來源的異源tRNA/合成酶對輸入宿主細胞中。異源合成酶候選物的特性包括(例如)其不負載任何宿主細胞tRNA，并且異源tRNA候選物的特性包括(例如)其不經任何宿主合成酶氨酰基化。此外，異源tRNA與所有宿主細胞合成酶正交。產生正交對的另一種策略涉及產生突變體文庫以篩選和/或選擇0-tRNA或O-RS。這些策略也可以組合。在各種實施例中，0-tRNA和O-RS是自至少一種有機體獲得。在另一個實施例中，0-tRNA是自第一有機體的天然存在或突變的天然存在的tRNA獲得，并且O-RS是自第二有機體的天然存在或突變的天然存在的RS獲得。在一個實施例中，第一有機體與第二有機體不同。舉例來說，正交對可包括自嗜熱自養甲烷桿菌獲得的tRNA合成酶和自古細菌tRNA(例如，自嗜鹽古菌NRC-I)獲得的tRNA。或者，第一有機體與第二有機體相同。參看本文中標題為“來源和宿主有機體”的章節以得到額外信息。在本發明的某些實施例中，本發明的0-tRNA包含如SEQ ID NO. :1、2或3中所述的聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列或其保守變異體，或由所述聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列或其保守變異體編碼。也參看本文中標題為“核酸和多肽序列和變異體”的早下。tRNA (0-tRNA)正交tRNA (0-tRNA)介導(例如)活體內或活體外將所選氨基酸并入由包含經0-tRNA識別的選擇性密碼子的聚核苷酸編碼的蛋白質。可通過任何方法或技術(包括但不限于，化學或酶促氨酰基化方法)利用所需氨基酸使本發明的0-tRNA氨酰基化。本發明的氨酰基化0-tRNA可直接加到翻譯系統中。可在活體外或活體內利用所選氨基酸通過RS使本發明的0-tRNA氨酰基化。此外，RS可為O-RS。可將本發明的0-tRNA直接提供到翻譯系統(例如，活體外翻譯組件，或細胞)中，或通過提供編碼0-tRNA或其部分的聚核苷酸將其提供到翻譯系統中。舉例來說，0-tRNA或其部分是由如SEQ IDN0. : 1、2、3中所述的聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列或其保守變異體編碼。本發明的0-tRNA在存在同類合成酶的情況下響應選擇性密碼子而包含抑制活性。抑制活性可通過所屬領域中已知的多種檢定中的任一種來測定。舉例來說，可使用
半乳糖苷酶報告基因檢定。使用在啟動子控制下表達IacZ基因的質粒的衍生物，例如，其中IacZ的肽VVLQRRDWEN中的Leu_25經選擇性密碼子(例如，TAG、TGA、AGGA等密碼子，或酪氨酸、絲氨酸、亮氨酸等的有義密碼子(作為對照))置換。將衍生化的IacZ質粒以及包含本發明的0-tRNA的質粒引入來自適當有機體(例如，可使用正交組件的有機體)的細胞 中。還可引入同類合成酶(當表達時作為編碼同類合成酶的多肽或聚核苷酸)。使細胞在培養基中生長到所需密度(例如，達到約0. 5的0D_)，并且例如使用BetaFluor ^ -半乳糖苷酶檢定試劑盒(Novagen)進行P _半乳糖苷酶檢定。以樣本相對于可比較對照(例如，由衍生化IacZ構筑體觀察得到的值)的活性百分比計算抑制百分比，其中所述構筑體在所需位置處具有相應的有義密碼子而非選擇性密碼子。在tRNA分子中，胸腺嘧啶(T)經尿嘧啶(U)置換。此外，可存在對堿基的其它修飾。本發明還包括0-tRNA的保守變異體。舉例來說，0-tRNA的保守變異體包括與0-tRNA功能類似并且保持tRNA的L形結構但不具有相同序列的分子(且為除野生型tRNA分子之外的分子)。也參看本文中標題為“核酸和多肽序列以及變異體”的章節。包含0-tRNA的組合物可另外包括正交氨酰基tRNA合成酶(0-RS)，其中所述O-RS優先利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使0-tRNA氨酰基化。在某些實施例中，包括0-tRNA的組合物可另外包括翻譯系統(例如，活體外或活體內翻譯系統)。細胞或其它翻譯系統中也可存在包含編碼所關注的多肽的聚核苷酸的核酸，其中所述聚核苷酸包含一個或一個以上由0-tRNA識別的選擇性密碼子，或一個或一個以上所述密碼子的組合。也參看本文中標題為“正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS) ”的章節。制造正交tRNA (0-tRNA)(例如，0-tRNA)的方法也為本發明的特征。由所述方法制造的tRNA (例如，0-tRNA)也為本發明的特征。制造正交tRNA的方法包括使tRNA池中的每一 tRNA的反密碼子環突變以允許識別選擇性密碼子(例如，琥珀密碼子、蛋白石密碼子、四堿基密碼子等)，借此提供多個潛在的0-tRNA ;并且分析所述多個潛在0-tRNA的成員的二級結構以鑒別二級結構中的非規范堿基對；且視情況使所述非規范堿基對突變(例如，使非規范堿基對突變為規范堿基對)。非規范堿基對可位于二級結構的莖干區中。0-tRNA可具有一種或一種以上特征或活性的改進(諸如與原材料(例如，多個tRNA序列)相比對于所需有機體的正交性的改進)，而同時保持其對所需RS的親和力。或者，可通過使已知tRNA突變以調節其與一個或一個以上影響翻譯或作為翻譯機器組件的分子的相互作用或與所述分子的結合親和力來產生0-tRNA。所述組件包括(但不限于)延長因子。細菌延長因子EF-Tu對于蛋白質合成中的延長步驟起到關鍵作用。在tRNA合成酶使tRNA氨酰基化后，EF-Tu結合氨酰基化的tRNA并且將其帶到核糖體的A位點。帶電氨基酸與tRNA之間的酯鍵因EF-Tu與氨酰基化tRNA之間的結合而避免發生自發水解。Stortchevoi等人已對大腸桿菌起始tRNAfMet的T VC莖干中的U50:G64擺動堿基對的突變體進行研究，這是因為已發現這一堿基對是在延長過程中阻斷tRNA活性的二級負決定因子(secondary negative determinant),推測這是由EF_Tu. GTP與氨酸基化tRNA之間減弱的相互作用引起(JBC 2003 278(20) : 17672-17679)。同樣，LaRiviere等人于Science, 2001年10月5日;294 (5540) : 165-8中描述氨基酸和tRNA主體對與EF-Tu的總結合親和力的熱動力學貢獻。其表明，tRNA主體和氨基酸的貢獻彼此無關，并且當tRNA經正確酰基化時，所述tRNA主體與所述氨基酸彼此補償。EF-Tu. GTP與經非天然氨基酸氨酰基化的tRNA之間相互作用的改變可能影響將tRNA負載到核糖體A位點的效率。也可以通過分析tRNA與翻譯機器其它組件(諸如EF-Tu)的復合物的晶體結構來發現潛在的突變位點。舉例來說，Nissen等人已指出，EF-Tu. GTP與酵母苯丙氨酰基轉移RNA (Phe-tRNA)的T VC 莖干的磷酸主鏈直接結合(Science 1995270 (5241) : 1464-1472)。所述方法視情況包括分析tRNA和/或氨酰基tRNA合成酶的序列的同源性以確定 似乎對于特定有機體正交的0-tRNA、0-RS和/或0-tRNA/0-RS對的潛在候選物。所屬領域中已知并且本文描述的計算機程序可用于所述分析。在一個實例中，為選擇用于原核有機體中的潛在正交翻譯組件，選擇不顯示與原核有機體的異常同源性的合成酶和/或tRNA。還可以通過一致性策略制造tRNA池。舉例來說，通過比對多個tRNA序列；確定一致序列；并且使用所述一致序列的至少一部分、大部分或全部產生tRNA文庫來制造tRNA池。舉例來說，可用計算機程序(例如，GCG程序pileup)來編譯一致序列。視情況，將由所述程序所測定的簡并位置變為所述位置處的最常見堿基。文庫是通過所屬領域中已知的技術使用一致序列合成。舉例來說，可使用寡核苷酸的重疊延伸提供基于一致序列的文庫，其中tRNA基因的各個位點可合成為90%—致序列與10%其它三堿基混合物的摻雜混合物。也可以使用其它混合物，例如75% —致序列和25%其它三堿基混合物；80% —致序列和20%其它三堿基混合物；95%—致序列和5%其它三堿基混合物等。突變體tRNA文庫可使用所屬領域中已知的各種誘變技術產生。舉例來說，可通過位點特異性突變、隨機點突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸式誘變方法、嵌合構建或其任何組合產生突變體tRNA。可將其它突變引入tRNA的所需環或區域(例如，反密碼子環、受體莖干、D臂或環、可變環、TurC臂或環、tRNA分子的其它區域或其組合)中的特定位置(例如，非保守性位置或保守性位置、隨機位置或其組合)處。突變可包括在莖干區中相配的堿基對。通常，通過使第一物種的細胞群體經歷陰性選擇來獲得0-tRNA，其中所述細胞包含多個潛在0-tRNA中的成員。陰性選擇將除去包含經細胞內源性氨酰基tRNA合成酶(RS)氨酰基化的多個潛在0-tRNA的成員的細胞。這提供與第一物種的細胞正交的tRNA池。在陰性選擇的某些實施例中，將選擇性密碼子弓I入編碼陰性選擇標記(例如，賦予抗生素抗性的酶，例如￠-內酰胺酶；賦予可檢測的產物的酶，例如￠-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶(CAT);例如在非必需位置處的有毒產物，諸如barnase等)的聚核苷酸中。篩選/選擇可通過使細胞群體在存在選擇劑(例如，抗生素，諸如氨比西林(ampicillin))的情況下生長來進行。在一個實施例中，選擇劑的濃度可變化。舉例來說，為測量抑制性tRNA的活性，使用基于選擇性密碼子的活體內抑制(例如，引入編碼陰性選擇標記(例如，￠-內酰胺酶的基因(bla))的聚核苷酸中的無義或移碼突變)的選擇系統。舉例來說，構建在一定位置(即某一位置)處具有(例如)TAG、AGGA和TGA的聚核苷酸變異體，例如bla變異體。用這些聚核苷酸轉化細胞(例如，細菌)。在無法被內源大腸桿菌合成酶有效負載的正交tRNA的情況中，抗生素抗性(例如，氨比西林抗性)應與不經質粒轉化的細菌的抗性類似或比不經質粒轉化的細菌的抗性低。如果tRNA不為正交tRNA，或者如果在所述系統中共表達能夠負載tRNA的異源合成酶，那么將觀察到較高水平的抗生素(例如，氨比西林)抗性。選擇在與不經質粒轉化的細胞大致相同的抗生素濃度下無法在LB瓊脂平板上生長的細胞，例如細菌。在有毒產物(例如，核糖核酸酶barnase)的情況中，當通過內源宿主(例如,大腸桿菌)合成酶(即，其不與宿主正交，例如大腸桿菌合成酶)使多個潛在tRNA中的成員氨酰基化時，選擇性密碼子受抑制并且所產生的有毒的聚核苷酸產物導致細胞死亡。具有正交tRNA或非功能性tRNA的細胞存活。 在一個實施例中，隨后使與所需有機體正交的tRNA池經歷陽性選擇，其中選擇性密碼子放入(例如)由藥物抗性基因(諸如￠-內酰胺酶基因)編碼的陽性選擇標記中。陽性選擇是對包含編碼或包含tRNA池的成員的聚核苷酸、編碼陽性選擇標記的聚核苷酸和編碼同類RS的聚核苷酸的細胞進行。這些聚核苷酸都在所述細胞中表達，并且所述細胞是在存在選擇劑(例如，氨比西林)的情況下生長。隨后，針對tRNA經共表達的同類合成酶氨酰基化并且響應此選擇性密碼子插入氨基酸的能力來選擇tRNA。通常，與具有非功能性tRNA或無法被所關注的合成酶有效識別的tRNA的細胞相比，這些細胞展現出抑制效率的增強。具有非功能性tRNA或不被所關注的合成酶有效識別的tRNA的細胞對抗生素敏感。因此，以下tRNA在兩種選擇下都存活(i)不為內源宿主(諸如，大腸桿菌)合成酶的底物的tRNA ；
(ii)可經所關注的合成酶氨酰基化的tRNA jP(iii)在翻譯過程中起作用的tRNA。在上述方法中，選擇(例如，陽性選擇、陰性選擇或陽性選擇與陰性選擇)的嚴格度視情況可變化。舉例來說，由于barnase為劇毒蛋白質，故陰性選擇的嚴格度可通過將不同數量的選擇性密碼子引入barnase基因中和/或通過使用可誘導啟動子來控制。在另一個實例中，選擇劑或篩選劑(例如氨比西林)的濃度可變化。一方面，由于在早期回合中所需活性較低，故嚴格度是變化的。因此，在早期回合中應用較低嚴格度的選擇標準并且在隨后的選擇回合中應用較高嚴格度的標準。在某些實施例中，陰性選擇、陽性選擇或陰性選擇和陽性選擇可重復多次。可使用多種不同的陰性選擇標記、陽性選擇標記或陰性選擇和陽性選擇標記。在某些實施例中，陽性選擇標記與陰性選擇標記可相同。可將其它類型的選擇/篩選用于本發明中以制造正交翻譯組件，例如0-tRNA、O-RS和0-tRNA/0-RS對。舉例來說，陰性選擇標記、陽性選擇標記或陽性選擇標記和陰性選擇標記可包括發熒光或在存在適當反應物的情況下催化發光反應的標記。在另一實施例中，標記的產物是通過熒光活化細胞揀選(FACS)或通過發光來檢測。視情況，標記包括基于親和力的篩選標記。參看Francisco, J. A.等人，(1993)Production andfluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functionalantibodyfragment on the external surface.Proc Natl Acad Sci USA. 90:10444-8。
制造重組正交tRNA的其它方法可見于(例如)名稱為“Methods and Compositionsfor the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs，， 的美國專利申請案 10/126，93 和名稱為 “In vivo Incorporation of Unnatural AminoAcids” 的 10/126，127 以及名稱為 “EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE. ”的 USSN10/825，867 中。也參看 Forster 等人，(2003) Programming peptidomimetic synthetasesby translating genetic codes designed de novo. PNAS 100(11):6353-6357 ;和 Feng等人，(2003)，Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single aminoacid change, PNAS 100 (10):5676-5681。可通過任何方法或技術(包括但不限于，化學 或酶促氨酰基化方法)利用所需氨基酸使本發明的tRNA氨酰基化。氨酰基化可通過氨酰基tRNA合成酶或其它酶分子(包括但不限于，核糖酶)實現。術語“核糖酶”可與“催化性RNA”互換使用。Cech和同事(Cech, 1987，Science, 236:1532-1539 ;McCorkle等人，1987, Concepts Biochem. 64:221-226)證實可充當催化劑的天然存在的RNA (核糖酶)的存在。然而，盡管僅已證實這些天然RNA催化劑對裂解和剪接的核糖核酸底物起作用，但近期有關人工核糖酶進展的研究已擴展對各種化學反應的催化作用的型式。相關研究已鑒別出可催化自身(2’)3’末端的氨酰基RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995 Science 267:643-647)和可將氨基酸從一個RNA分子轉移到另一 RNA分子的RNA 分子(Lohse 等人，1996, Nature 381:442-444)。美國專利申請公開案2003/0228593 (其是以引用的方式并入本文)描述構建核糖酶的方法和其對于用天然編碼的氨基酸和非天然編碼的氨基酸氨酰基化tRNA的用途。可使tRNA氨酰基化的基質固定形式的酶分子(包括但不限于，核糖酶)能夠有效地親和純化氨酰基化產物。適當基質的實例包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠。供氨酰基化作用的基質固定形式的核糖酶的制造和用途已描述于Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084和美國專利申請公開案2003/0228593中，所述專利文獻是以引用的方式并入本文。化學氨酰基化方法包括(但不限于)由Hecht和同事(Hecht, S. M. Ace.Chem. Res. 1992, 25, 545 ;Heckler, T. G. ; Roesser, J. R. ; Xu, C; Chang, P. ; Hecht, S.M. Biochemistry 1988, 27, 7254 ；Hecht, S. M. ; Alford, B. L. ; Kuroda, Y. ; Kitano, S. J. Biol.Chem.1978，253，4517)和 Schultz, Chamberlin, Dougherty 等(Cornish, V. W. ; Mendel,D.;Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621 ；Robertson, S. A. ; Ellman, J.A. ; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722 ；Noren, C. J. ; Anthony-Cahi 11, S. J.;Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989，244，182 ；Bain, J. D. ; Glabe, C. G. ; Dix, T. A.;Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013 ；Bain, J. D.等人 Nature 1992, 356, 537 ；Gallivan, J. P. ; Lester, H. A. ;Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740 ；Turcatti 等人J. Biol. Chem. 1996，271，19991 ；Nowak, M. ff.等人 Science, 1995，268，439 ；Saks, M. E.等人J. Biol. Chem. 1996，271，23169 ；Hohsaka, T.等人 J. Am. Chem. Soc. 1999，121，34)提出的方法以避免在氨酰基化過程中使用合成酶。所述方法或其它化學氨酰基化方法可用于使本發明的tRNA分子氨酰基化。已使用利用以化學方式修飾的氨酰基tRNA的生物合成方法將數個生物物理探針并入活體外合成的蛋白質中。參看本文所引用的以下公開案和參考文獻Brunner，J. NewPhotolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem,62:483-514(1993);和Krieg，U. C. , Walter, P. , Hohnson, A. E. Photocrosslinldng of the signal sequence ofnascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognitionparticle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83 (22) : 8604-8608 (1986)。先前已證實，可通過將經化學方法氨酰基化的抑制性tRNA加入經含有所需琥珀無義突變的基因程式設計的蛋白質合成反應中，在活體外將非天然氨基酸位點特異性地并入蛋白質中。使用這些方法，使用特定氨基酸的營養缺陷型菌株，可以結構類似的同源物取代20種常見氨基酸中的多種氨基酸，例如以氟代苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如參看 Noren, C. J. , Anthony-Cahillj Griffith, M. C. , Schultz, P. G. A general method forsite-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science,244:182-188 (1989) ；M. ff. Nowak 等人,Science 268:439-42(1995) ；Bain, J. D. , Glabe, C.G. , Dix, T. A. , Chamberlin, A. R. , Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporationof a non-natural amino acid into a polypeptide, I. Am Chem Soc,111:8013—8014(1989) ;N. Budisa 等人，FASEB T. 13:41-51 (1999) Ellman. T. A. . Mendel. D. . Anthony-Cahill, S. , Noren, C. J. , Schultz,P.G.Biosynthetic method for introducingunnatural amino acids site-specifically into proteins. Methods in Enz., 第202 卷，301-336(1992)；和 Mendel，D.，Cornish, V. ff. &Schultz, P. G. Site-DirectedMutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24,435-62(1995)。舉例來說，制備識別終止密碼子UAG的抑制性tRNA，并且用非天然氨基酸以化學方法使其氨酰基化。使用常規定點誘變將終止密碼子TAG引入蛋白質基因中的所需位點處。例如參看 Sayers, J. R.，Schmidt, W. Eckstein, F. 5’_3’ Exoniicleases inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutaRensis, Nucleic AcidsRes, 16 (3) : 791-802 (1988)。當將酰基化抑制性tRNA和突變體基因組合于活體外轉錄/翻譯系統中時，響應UAG密碼子而并入非天然氨基酸，此提供在特定位置處含有所述氨基酸的蛋白質。使用[3H]-Phe進行的實驗和以a羥基酸進行的實驗證實，僅所需氨基酸被并入UAG密碼子指定的位置處，且并未將這一氨基酸并入蛋白質中的任何其它位點。例如參看Noren等人，同上文；Kobayashi 等人，(2003)Nature Structural BiologylO (6) :425-432 ;和 Ellman,J.A.，Mendel, D.，Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novelbackbone structures into proteins, Science,255 (5041):197-200 (1992)。產生催化性RNA的方法可涉及產生單獨隨機核糖酶序列池；對所述池進行定向進化；針對所需氨酰基化活性篩選所述池；和選擇那些展現所需氨酰基化活性的核糖酶的序列。核糖酶可包含有利于酰基化活性的基序和/或區域，諸如GGU基序和富集U的區域。舉例來說，據報導，富集U的區域可有利于識別氨基酸底物，且GGU基序可與tRNA 3’末端形成堿基對。總的說來，GGU和基序以及富集U的區域有利于同時識別氨基酸與tRNA，且由此有利于使tRNA 3’末端氨酰基化。 可通過使用與tRNAAsn CCCG連結的部分隨機化r24mini進行活體外選擇，隨后系統性工程設計見于活性克隆中的一致序列來產生核糖酶。由本方法獲得的例示性核糖酶稱為“Fx3核糖酶”且描述于美國公開申請案第2003/0228593號中，所述專利的內容是以引用的方式并入本文，所述核糖酶充當合成載有同類非天然氨基酸的各種氨酰基tRNA的通用催化劑。可使用在基質上固定以能夠有效親和純化氨酰基化tRNA。適當基質的實例包括(但不限于)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠。可利用RNA的化學結構將核糖酶固定于樹脂上，諸如，可以高碘酸鹽氧化RNA的核糖上的3’-順-二醇以得到相應二醛以有利于將RNA固定于樹脂上。可使用各類樹脂，包括廉價酰肼樹脂，其中還原氨化使得樹脂與核糖酶之間以不可逆連接相互作用。可通過柱上氨酰基化技術顯著有利于氨酰基tRNA的合成。Kourouklis等人Methods 2005;36:239-4描述基于柱的氨酰基化系統。可以多種方式實現氨酰基化tRNA的分離。一種適當方法為用緩沖液從柱中洗提出氨酰基化tRNA，所述緩沖液諸如含有IOmM EDTA的乙酸鈉溶液；含有50mM N_(2_羥乙基)哌嗪-N，-(3-丙烷磺酸)、12. 5mM KCl (pH 7. O)、IOmM EDTA的緩沖液；或簡單地為經EDTA 緩沖的水(pH 7.0)。
可將本發明的氨酰基化tRNA加入翻譯反應中以便將使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻譯反應所制造的多肽中選擇的位置中。可使用本發明的氨酰基化tRNA的翻譯系統的實例包括(但不限于)細胞溶解產物。細胞溶解產物提供從輸入的mRNA活體外翻譯多肽必需的反應組件。所述反應組件的實例包括(但不限于)核糖體蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始因子和延長因子以及與翻譯有關的其它因子。此外，翻譯系統可為批量翻譯或區域化翻譯。批量翻譯系統將反應組件組合于單一隔室中，而區域化翻譯系統使翻譯反應組件與可抑制翻譯效率的反應產物分離。所述翻譯系統均有市售。另外，可使用偶聯轉錄/翻譯系統。偶聯轉錄/翻譯系統允許將輸入DNA轉錄成對應的mRNA，其接著經反應組件翻譯。市售偶聯轉錄/翻譯的實例為快速翻譯系統(RapidTranslation System) (RTS, Roche Inc.)。所述系統包括含有提供翻譯組件(諸如核糖體和翻譯因子)的大腸桿菌溶解產物的混合物。此外，還包括RNA聚合酶以將輸入DNA轉錄成供翻譯使用的mRNA模板。RTS可使用借助插入到反應隔室(包括供應/廢物隔室和轉錄/翻譯隔室)之間的膜區域化反應組件。tRNA的氨酰基化可以其它試劑進行，所述試劑包括(但不限于)轉移酶、聚合酶、催化抗體、多功能蛋白等。iH交氨釀基tRNA合成酶(O-RS)O-RS優先利用所選氨基酸在活體外或活體內使本發明的0-tRNA氨酰基化。可通過包括O-RS的多肽和/或通過編碼O-RS或其部分的聚核苷酸將本發明的O-RS提供到翻譯系統(例如，活體外翻譯組件，或細胞)中。O-RS或其部分是由聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列或其保守變異體編碼。可通過多種不同的O-RS分子(包括但不限于，本文所述的分子)將本發明的0-tRNA氨酰基化。鑒別與0-tRNA (例如，0-tRNA) 一起使用的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)(例如，0-RS)的方法也為本發明的特征。舉例來說，方法包括使第一物種的細胞群體經歷陽性選擇，其中所述細胞各自包含1)多種氨酰基tRNA合成酶(RS)的成員，其中所述多種RS包含突變體RS、從除第一物種以外的物種得到的RS或突變體RS和從除第一物種以外的物種得到的RS ;2)來自第二物種的正交tRNA (0-tRNA);和3)編碼陽性選擇標記并且包含至少一個選擇性密碼子的聚核苷酸。選擇或篩選細胞中與缺乏多種RS中的成員或具有減少量的多種RS中的成員的細胞相比展示增強的抑制效率的細胞。抑制效率增強的細胞包含使O-tRNA氨酰基化的活性RS。將活性RS使來自第一物種的第一組tRNA氨酰基化的水平(活體外或活體內)與活性RS使來自第二物種的第二組tRNA氨酰基化的水平(活體外或活體內)相比較。氨酰基化水平可通過可檢測物質(例如，經標記氨基酸或非天然氨基酸)測定。選擇與第一組tRNA相比使第二組tRNA更有效氨酰基化的活性RS，借此提供與O-tRNA一起使用的正交氨酰基tRNA合成酶。由所述方法鑒別的O-RS (例如，0-RS)也為本發明的特征。可使用多種檢定中的任一種測定氨酰基化。這些檢定可在活體外或活體內進行。舉例來說，活體外氨酰基化檢定描述于例如Hoben, P.和Soil, D. (1985)MethodsEnzymoI. 113:55-59以及美國專利申請公開案第2003/0228593號中。也可通過使用報告基因和正交翻譯組件，并且檢測表達包含至少一個選擇性密碼子且編碼蛋白質的聚核苷酸的 細胞中的報告基因來測定氨酰基化。也參看名稱為“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURALAMINO ACIDS” 的美國專利申請案 10/126,927 ;和名稱為 “EXPANDING THE EUKARYOTICGENETIC CODE” 的 USSN 10/825,867。可進一步對經鑒別的O-RS進行操縱以改變合成酶的底物特異性，從而僅所需非天然氨基酸而非常見20種氨基酸中的任一種載到O-tRNA上。產生對非天然氨基酸具有底物特異性的正交氨酰基tRNA合成酶的方法包括使合成酶(例如)在合成酶的活性位點處、合成酶的編輯機制位點處、通過組合合成酶不同域得到的不同位點處等突變，和應用選擇方法。使用基于陽性選擇隨后陰性選擇的組合的策略。在陽性選擇中，對陽性標記的非必需位置處引入的選擇性密碼子的抑制使細胞在陽性選擇壓力下存活。因此，在存在天然和非天然氨基酸的情況下，存活者編碼使正交抑制性tRNA載上天然或非天然氨基酸的活性合成酶。在陰性選擇中，對陰性標記的非必需位置處引入的選擇性密碼子的抑制將去除具有天然氨基酸特異性的合成酶。陰性選擇和陽性選擇的存活者編碼僅利用非天然氨基酸使正交抑制性tRNA氨酰基化(裝載)的合成酶。隨后，可使這些合成酶經歷進一步的誘變，例如DNA改組或其它遞歸式誘變方法。可使用所屬領域中已知的各種誘變技術產生突變體O-RS文庫。舉例來說，可通過位點特異性突變、隨機點突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸式誘變方法、嵌合構建或其任何組合產生突變體RS。舉例來說，可由兩種或兩種以上其它(例如)較小、較少不同的“子文庫”來產生突變體RS文庫。RS的嵌合文庫也包括在本發明中。應注意，視情況構建來自各種有機體(例如，微生物，諸如真細菌或古細菌)的tRNA合成酶文庫，諸如，包含天然多樣性的文庫(例如參看Short等人的美國專利第6，238，884號；Schallenberger等人的美國專利第5，756，316號；Petersen等人的美國專利第5，783，431號！Thompson等人的美國專利第5，824，485號；Short等人的美國專利第5，958，672號)；并且篩選正交對。使合成酶經歷陽性和陰性選擇/篩選策略后，隨后可使這些合成酶經歷進一步誘變。舉例來說,可分離編碼O-RS的核酸；可由所述核酸產生(例如，通過隨機誘變、位點特異性誘變、重組或其任何組合)一組編碼突變O-RS的聚核苷酸；并且可重復這些個別步驟或這些步驟的組合直到獲得優先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰基化的突變0-RS。在本發明一個方面中，進行所述步驟多次，例如至少2次。
還可將不同程度的選擇/篩選嚴格度用于本發明的方法中，以用于產生O-tRNA、O-RS或0-tRNA/0-RS對。所述方法的一個或兩個步驟的選擇或篩選嚴格度可變化以產生O-RS0這可包括(例如)改變所使用的選擇劑/篩選劑的量等。也可進行其它回合的陽性選擇和/或陰性選擇。選擇或篩選也可包含一次或一次以上陽性或陰性選擇或篩選，所述選擇或篩選包括(例如)氨基酸滲透性的改變、翻譯效率的改變、翻譯保真度的改變等。通常，一種或一種以上改變是基于使用正交tRNA-tRNA合成酶對制造蛋白質的有機體中一個或一個以上基因的突變。可將針對(例如)O-RS、O-tRNA和0-tRNA/0-RS對的其它類選擇用于本發明中。陽性選擇標記可為多種分子中的任一種，包括(但不限于)提供營養補充以供生長的產物，并且在缺乏營養補充的培養基上進行選擇。編碼陽性選擇標記的聚核苷酸的實例包括(但不限于)例如基于補充細胞的氨基酸營養缺陷型的報告基因、his3基因(例如，其中his3基因編碼通過提供3-氨基三唑(3-AT)檢測的咪唑甘油磷酸脫氫酶)、ura3基因、leu2基因、lys2 基因、IacZ基因、adh基因等。例如參看G. M. Kishore, & D. M. Shah, (1988), Amino acidbiosynthesis inhibitors as herbicides, Annual Review of Biochemistry57:627—663。 在一個實施例中，IacZ的產生是通過鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)水解檢測。例如參看 I. G. Serebriiskii, & E. A. Golemis, (2000), Uses of IacZ to studygene function: evaluation of beta-galactosidase assays employed in the yeasttwo-hybrid system, Analytical Biochemistry 285:1-15。其它陽性選擇標記包括(例如)熒光素酶、綠色熒光蛋白質(GFP)、YFP、EGFP, RFP、抗生素抗性基因的產物(例如，氯霉素乙酰轉移酶(CAT))、轉錄調節蛋白(例如，GAL4)等。視情況，編碼陽性選擇標記的聚核苷酸包含選擇性密碼子。可將編碼陽性選擇標記的聚核苷酸可操作地連接到反應元件。還可存在編碼調節反應元件轉錄的轉錄調節蛋白且包含至少一個選擇性密碼子的額外聚核苷酸。通過經非天然氨基酸氨酰基化的O-tRNA將非天然氨基酸并入轉錄調節蛋白中將引起編碼陽性選擇標記的聚核苷酸(例如，報告基因)的轉錄。視情況，選擇性密碼子位于編碼轉錄調節蛋白的DNA結合域的一部分聚核苷酸中或實質上臨近編碼轉錄調節蛋白的DNA結合域的一部分聚核苷酸。也可將編碼陰性選擇標記的聚核苷酸可操作地連接到轉錄調節蛋白介導轉錄的反應元件。例如參看 A. J. DeMaggio 等人，(2000)，The yeast split-hybridsystem, Method Enzymol. 328:128-137 ；H. M. Shih 等人，(1996)，A positive geneticselection for disrupting protein-protein interactions:identification ofCREB mutations that prevent association with the coactivator CBP, Proc. Natl.Acad.Sci.U. S. A. 93:13896-13901 ；M. Vidal 等人，(1996)，Genetic characterizationof a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reversetwo-hybrid system, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 10321-10326 ；和 M. Vidal 等人,(1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociationof protein-protein and DNA-protein interactions (Proc.Natl.Acad. Sci.U. S. A. 93:10315-10320)。通過經天然氨基酸氨酰基化的O-tRNA將天然氨基酸并入轉錄調節蛋白中將引起陰性選擇標記的轉錄。視情況，陰性選擇標記包含選擇性密碼子。本發明的陽性選擇標記和/或陰性選擇標記可包含至少兩個選擇性密碼子，所述標記各自或都可包含至少兩個不同的選擇性密碼子或至少兩個相同的選擇性密碼子。轉錄調節蛋白為與核酸序列(例如，反應元件)(直接或間接)結合并且調節可操作地連接到反應元件的序列的轉錄的分子。轉錄調節蛋白可為轉錄活化蛋白(例如，GAL4、核激素受體、APU CREB, LEF/tcf家族成員、SMAD, VP16、SPl等)、轉錄阻遏蛋白(例如，核激素受體、Groucho/tle家族、Engrailed家族等)或可視環境而具有兩種活性的蛋白質(例如，LEF/tcf、同源盒蛋白等)。反應元件通常為由轉錄調節蛋白識別的核酸序列或與轉錄調節蛋白協同作用的額外試劑。轉錄調節蛋白的另ー實例為轉錄活化蛋白GAL4。例如參看A. Laughon等人,(1984), Identification of two proteins encoded by the Saccharomycescerevisiae GAL4 gene, Molecular & Cellular Biology 4:268-275 ；A. Laughonj &R. F.Gestelandj (1984)，Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae GAL4gene,Molecular & Cellular Biology4:260-267 ;L Keegan 等人，(1986)，Separation of DNA binding from the transcription-activating function of a eukaryoticregulatory protein, Science 231:699-704 ；和 Μ· Ptashne，(1988), How eukaryotictranscriptional activators work, Nature 335:683-689。這ー具有 881 個氨基酸的蛋白質的N末端147個氨基酸形成特異性結合DNA序列的DNA結合域(DBD)。例如參看M. Carey 等人，(1989)，An amino-terminal fragment of GAL4binds DNA as a dimer, J.Mol. Biol. 209:423-432 ;和 E. Giniger 等人，(1985)，Specific DNAbinding of GAL4, apositive regulatory protein of yeast, Cell 40:767-774。DBD 是通過插入的蛋白質序列連接到當與DNA結合時可活化轉錄的C末端113個氨基酸活化域(AD)。例如參看J. Maj & M. Ptashnej (1987)，Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptionalactivating segments,Cell 48:847-853;和 J. Ma，& M. Ptashne, (1987),Thecarboxy-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognized by GAL80,Cell50:137-142。通過將琥珀密碼子朝向(例如)含有GAL4的N末端DBD和其C末端AD的單一聚核苷酸的N末端DBD放置，可將0-tRNA/0-RS對的琥珀抑制連接到GAL4進行的轉錄活化。可使用GAL4活化的報告基因進行利用所述基因進行的陽性選擇和陰性選擇。用于陰性選擇的培養基可包含轉化成通過陰性選擇標記可檢測的物質的選擇劑或篩選劑。在本發明ー個方面中，可檢測物質為有毒物質。編碼陰性選擇標記的聚核苷酸可為(例如)ura3基因。舉例來說，可將URA3報告基因放在含有GAL4 DNA結合位點的啟動子的控制下。當例如通過翻譯具有選擇性密碼子的編碼GAL4的聚核苷酸來制造陰性選擇標記時，GAL4將活化URA3的轉錄。陰性選擇是在包含5-氟乳清酸(5-F0A)的培養基上實現，所述5-F0A轉化成通過ura3基因的基因產物可檢測的物質(例如，殺死細胞的有毒物質) 例如參看 J. D. Boeke 等人，(1984)，Apositive selection for mutantslacking orotidine—5 -phosphate decarboxylase activity in yeast:5-fluorooroticacid resistance,Molecular & General Genetics 197:345-346) ；M.Vidal 等人，、1996)，Genetic characterization of a mammalian protein-proteininteraction domain by using a yeast reverse two-hybrid system. , Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 93:10321—10326 ;和 M. Vidal 等人，(1996), Reverse two-hybrid andone-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-proteininteractions.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10315-10320。如同陽性選擇標記一祥，陰性選擇標記也可為多種分子中的任ー種。陽性選擇標記和/或陰性選擇標記可為發熒光或在存在適當反應物的情況下催化發光反應的多肽。舉例來說，陰性選擇標記包括(但不限于)例如熒光素酶、綠色熒光蛋白質(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因的產物(例如，氯霉素こ酰轉移酶(CAT))、IacZ基因的產物、轉錄調節蛋白等。陽性選擇標記和/或陰性選擇標記可通過熒光活化細胞揀選(FACS)或通過發光來檢測。陽性選擇標記和/或陰性選擇標記可包含基于親 和力的篩選標記。同一聚核苷酸可編碼陽性選擇標記和陰性選擇標記。舉例來說，陽性選擇步驟、陰性選擇步驟或陽性選擇和陰性選擇步驟可包括使用報告基因，其中所述報告基因是通過熒光活化細胞揀選(FACS)檢測。舉例來說，陽性選擇可首先用陽性選擇標記(例如，氯霉素こ酰轉移酶(CAT)基因)進行，其中所述CAT基因在所述CAT基因中包含選擇性密碼子(例如，琥珀終止密碼子)；隨后進行陰性選擇篩選，其是基于無法抑制陰性選擇標記(例如，T7RNA聚合酶基因)內各位置處的(例如，兩個或兩個以上)選擇性密碼子。陽性選擇標記和陰性選擇標記可見于同一載體(例如質粒)上。陰性標記的表達將驅動報告基因(例如，綠色熒光蛋白質(GFP))的表達。選擇和篩選的嚴格度可變化，例如使報告基因發熒光所需的光強度可變化。陽性選擇可利用通過FACS篩選隨后陰性選擇篩選的報告基因作為陽性選擇標記進行，所述陰性選擇篩選是基于無法抑制陰性標記(例如，barnase基因)內各位置處的(例如，兩個或兩個以上)選擇性密碼子。視情況，報告基因是在細胞表面(例如，噬菌體呈現等)上呈現。細胞表面呈現(例如，基于OmpA的細胞表面呈現系統)取決于大腸桿菌細胞表面上特定抗原決定基(例如，融合到外膜孔蛋白OmpA的脊髄灰質炎病毒C3肽)的表達。所述抗原決定基僅在翻譯期間抑制蛋白質信使中的選擇性密碼子時呈現于細胞表面上。隨后所呈現的肽含有由文庫中的一個突變體氨酰基tRNA合成酶所識別的氨基酸，并且含有相應合成酶基因的細胞可利用針對含有特定非天然氨基酸的肽所產生的抗體分離。基于OmpA的細胞表面呈現系統經Georgiou等人研發并且優化以作為曬菌體呈現的替代選擇。參看Francisco, J.A.，Campbell, R.，丄verson，B. L. & beorgoiu, G. Production ana fluorescence-activatedcell sorting oi Escherichia coli expressing a functional antibody fragment onthe external surface. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10444-8(1993)。本發明的其它實施例包括在活體外執行ー個或ー個以上選擇步驟。隨后可將所選組件(例如，合成酶和/或tRNA)引入細胞中以用于活體內并入非天然氨基酸。制造O-RS并且改變合成酶的底物特異性的其它細節可見于名稱為“Methods andCompositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA SynthetasePairs” 的美國專利申請案 10/126，931 和名稱為 “EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETICCODE”的USSN 10/825,867中，所述文獻都是以引用的方式并入本文中。制造O-RS的其它細節可見于 Hamano-Takaku 等人，(2000) A mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNASyntnetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficientlythan Tyrosine,Journal of Biological Chemistry，275(51):40324-40328 ;Kiga 等人(2002)，An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specificincorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotictranslation and its application in a wheat germ cell-free system,PNAS99(15) :9715-9723 ;和 Francklyn 等人，(2002)，Aminoacyl-tRNA synthetases: Versatileplayers in the changing theater of translation;RNA，8:1363-1372 中，各文獻都是以引用的方式并入本文中。來源和宿主有機體本發明的翻譯組件通常是從非真核有機體得到。舉例來說，正交Ο-tRNA可從非真核有機體得到，例如古細菌，諸如詹氏甲烷球菌、嗜熱自養甲烷桿菌、嗜鹽古菌(諸如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-I )、閃爍古生球菌、強烈火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱泉生古細菌等；或真細菌，諸如大腸桿菌、極端嗜熱細菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，而正交O-RS可從非真核有機體得到，例如嗜熱自養甲烷桿菌、嗜鹽古菌(諸如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-1)、閃爍古生球菌、強烈火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱泉生古細菌等；或真細菌，諸如大腸桿菌、極端嗜熱細菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等。在一個實施例中，也可使用真核來源，包括(但不限干)植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動物(例如，哺乳動物、昆蟲、節肢動物等)等。0-tRNA/0-RS對的個別組件可從相同有機體或不同有機體得到。在一個實施例中，0-tRNA/0-RS對是來自相同有機體。或者，0-tRNA/0-RS對中的Ο-tRNA和O-RS是來自不同有機體。舉例來說，Ο-tRNA可從(例如)嗜鹽古菌NRC-I得到，并且O-RS可從(例如)嗜熱自養甲烷桿菌得到。可在活體內或活體外選擇或篩選0-tRNA、O-RS或0-tRNA/0-RS對和/或將其用于細胞(例如，非真核細胞(諸如大腸桿菌細胞)或真核細胞)中以產生具有所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。非真核細胞可來自各種來源，諸如古細菌系統發育領域，包括(但不限干)詹氏甲烷球菌、嗜熱自養甲烷桿菌、嗜鹽古菌(諸如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-1)、閃爍古生球菌、強烈火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱泉生古細菌等；或可屬于真細菌系統發育領域(包括但不限于，大腸桿菌、極端嗜熱細菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌等)等。真核細胞可來自各種來源，包括(但不限干)植物(例如，復雜植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌、酵母(包括但不限干，釀酒酵母)、動物(包括但不限于，哺乳動物、昆蟲、節肢動物等)等。具有本發明的翻譯組件的細胞組合物也為本發明的特征。有關篩選一種物種中的Ο-tRNA和/或O-RS供另一物種使用，也參看名稱為“Expanding the Eukaryotic Genetic Code” 的 USSN 10/825,867。 為了在宿主細胞中表達具有所選氨基酸的所關注的多肽，可將編碼所關注的多肽的聚核苷酸亞克隆到表達載體中，所述表達載體含有用于指導轉錄的啟動子、轉錄/翻譯終止子，且如果針對編碼蛋白質的核酸，那么還含有用于翻譯起始的核糖體結合位點。適當的細菌啟動子已為所屬領域眾所周知并且描述于(例如)Sambrook等人和Ausubel等人中。表達所關注的多肽的細菌表達系統可用于(包括但不限干)大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillus sp.)、突光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和沙門氏菌(Salmonella)中(Palva 等人，Gene 22:229-235(1983) ;Mosbach 等人，Nature 302:543-545 (1983))。所述表達系統的試劑盒在市面有售。哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統已為所屬領域技術人員眾所周知且也在市面有售。可將本發明的tRNA和/或RS和/或所關注的多肽用于多種適當的表達系統(例如包括，酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和細菌沖和/或在所述系統中表達。有關例示性表達系統的描述將于下文中提供。璧里如本文所使用，術語“酵母”包括能夠表達所關注的多肽的多種酵母中的任ー種。所述酵母包括(但不限于)產子囊(ascosporogenous)酵母(內孢霉目(Endomycetales ))λ產擔抱子(basidiosporogenous)酵母和屬于半知菌類(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。產子囊酵母分為兩個家族，即蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae )。酵母科是由四個亞家族構成，即裂埴酵母亞科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂通酵母屬(genus Schizosaccharomyces))Λ拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)和酵母菌亞科(Saccharomycoideae)(例如，畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和酵母菌屬(Saccharomyce))。產擔孢子酵母包括白冬孢酵母屬(Leucosporidium)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲抱酵母屬(Sporidiobolus)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)和擬線黑粉酵母屬(Filobasidiella)。屬于半知菌類(芽孢綱)的酵母分為兩個家族，即擲 (Bullera))和隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如假絲酵母屬(Candid))。 用于本發明的特別值得關注的為畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、(Hansenula)、漢遜酵母屬(Hansenula)、球擬酵母屬(Torulopsis)和假絲酵母屬(Candida)內的種，包括(但不限于)巴氏畢赤酵母(P. pastoris)、季氏畢赤酵母(P. guiIlerimondii)、釀酒酵母(S. cerevisiae)、卡爾斯伯酵母(S. carlsbergensis)、糖化酵母(S. diastaticus)、道格拉斯酵母(S. douglasii)、克氏酵母(S. kluyveri)、諾氏酵母(S. norbensis)、卵形酵母(S. oviformis)、乳酸克魯維斯酵母(K. Iactis)、脆壁克魯維斯酵母(K. fragilis)、白假絲酵母(C. albicans)、麥芽假絲酵母(C. maltosa)和多形漢遜酵母(H.p0lymOTpha)。酵母一般可從各種來源得到，包括(但不限干)加州大學(Berkeley，CA)生物物理學和醫學物理學系酵母基因儲備中心(Yeast Genetic Stockしenter，Department of Biophysics and Medica丄 Physics，University of Californiaノ和美國典型微生物菌種保藏中心(American Type Culture Collection，“ATCC”)(Manassas, VA)。術語“酵母宿主”或“酵母宿主細胞”包括可用作重組載體或其它轉移DNA的受體或已用作重組載體或其它轉移DNA的受體的酵母。所述術語包括已接收重組載體或其它轉移DNA的原始酵母宿主細胞的子代。應了解，由于存在偶發突變或有意突變，単一親代細胞的子代的形態或基因組或總DNA補體可不必與原始親本完全相同。與親本足夠相似以通過相關特性(諸如，編碼所關注的多肽的核苷酸序列的存在)表征的親本細胞子代包括在本定義所預期的子代中。已研發表達和轉化載體(包括染色體外復制子或整合載體)以用于轉化到許多酵母宿主中。舉例來說，已研發針對下述的表達載體釀酒酵母(SikOTski等人，Genetics (1989) 122:19 ；Ito 等人，J.Bacteriol. (1983) 153:163 ;Hinnen 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:1929);白假絲酵母(Kurtz 等人，Mol. CELL.Biol. (1986)6:142);麥芽假絲酵母(Kunze 等人，J. BASIC MICROBIOL (1985)25:141)；多形漢遜酵母(Gleeson 等人，J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459 ； Roggenkamp 等人，Mol. Genetics and genomics (1986) 202:302);脆壁克魯維斯酵母(Das 等人，J.Bacteriol. (1984) 158:1165);乳酸克魯維斯酵母(De Louvencourt 等人,J. Bacteriol.(1983) 154:737 ；Van den Berg 等人,Biotechnology (ny) (1990) 8:135);李氏畢赤酵母(Kunze 等人，J. Basic Microbiol. (1985)25:141);巴氏畢赤酵母(美國專利第 5，324，639號；第4，929,555 號；和第4，837，148 號;Cregg 等人，Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376);粟酒裂殖酵母(Beach等人，NATURE (1982) 300:706);和耶羅威亞解脂酵母((Y. lipolytics)、構巢曲霉(A. nidulans) (Balance 等人，BIOCHEM. BIOPHYS. RES. Commun. (1983) 112:284-89 ；Tilburn 等人，Gene (1983)26:205-221 ;和 Yelton 等人，Proc.Natl. Acad.SCI.USA(1984)81:1470-74);黑曲霉(A. niger) (Kelly 和 Hynes, EMBO J. (1985)4:475-479)；木霉(T.reesia) (EP 0 244 234);和絲狀真菌，諸如土壤真菌(Neurospora)、青霉屬(PeniciIlium)、彎頸霉(Tolypocladium) (W091/00357)。酵母載體的控制序列已為所屬領域技術人員所知并且包括(但不限干)來自下述基因的啟動子區諸如醇脫氫酶(ADH)(EP O 284 044);烯醇化酶；葡糖激酶；葡萄糖-6-磷酸異構酶；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP或GAPDH);己糖激酶；磷酸果糖激酶；3_磷酸甘油 酸變位酶；和丙酮酸激酶(PyK) (EP O 329 203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可提供有用的啟動子序列(Miyanohara 等人,PROC. Natl. Acad. Sci. USA(1983)80:1)。用于酵母宿主的其它適當的啟動子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J. BI0L.Chem. (1980) 255:12073)和其它糖酵解酶(諸如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構酶和磷酸葡萄糖異構酶)(Holland 等人，BIOCHEMISTRY(1978) 17:4900 ；Hess 等人，J. Adv. Enzyme Reg.(1969)7:149)的啟動子。具有受生長條件所控制的其它轉錄優點的可誘導酵母啟動子可包括醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、與氮代謝相關的降解酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區。用于酵母表達的適當載體和啟動子進ー步描述于EP O 073 657中。酵母增強子還可與酵母啟動子合用。此外，合成啟動子也可用作酵母啟動子。舉例來說，可將酵母啟動子的上游活化序列(UAS)與另ー酵母啟動子的轉錄活化區連接，從而產生合成雜合啟動子。所述雜合啟動子的實例包括連接到GAP轉錄活化區的ADH調控序列。參看美國專利第4，880，734號和第4，876，197號，其是以引用的方式并入本文中。雜合啟動子的其它實例包括由ADH2、GAL4、GALlO或PH05基因的調控序列與糖酵解酶基因(諸如GAP或PyK)的轉錄活化區組成的啟動子。參看EP O 164 556。此外，酵母啟動子可包括具有結合酵母RNA聚合酶并且起始轉錄的能力的非酵母來源的天然存在的啟動子。可組成部分酵母表達載體的其它控制元件包括(例如)來自GAPDH或烯醇化酶基因的終止子(Holland等人，J.BI0L. Chem. (1981)256:1385)。此外，2μ質粒來源的復制起點適用于酵母。用于酵母中的適當選擇基因為存在于酵母質粒中的trpl基因。參看Tschumper 等人,Gene (1980) 10:157 ；Kingsman 等人,Gene (1979) 7:141。trpl 基因提供針對缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變菌株的選擇標記。類似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20, 622或38，626)通過具有Leu2基因的已知質粒補充。將外源DNA引入酵母宿主中的方法已為所屬領域技術人員所知，并且通常包括(但不限干)原生質球的轉化或經堿陽離子處理的完整酵母宿主細胞的轉化。舉例來說，酵母的轉化可根據 Hsiao 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:3829 和 Van Solingen 等人，J. Bact. (1977) 130:946中所述的方法進行。然而，也可如Sambrook等人，MolecularCloningiA Lab. Manual (2001)中一般所述，使用將DNA引入細胞的其它方法，諸如細胞核注射、電穿孔或原生質體融合。隨后可使用所屬領域技術人員已知的標準技術培養酵母宿主細胞。在酵母宿主細胞中表達異源蛋白質的其它方法已為所屬領域技術人員所知。一般參看美國專利公開案第20020055169號；美國專利第6，361，969號；第6，312，923 號；第 6，183，985 號；第 6，083，723 號；第 6，017，731 號；第 5，674，706 號；第5，629，203號；第5，602，034號；和第5，089，398號；美國再審專利第RE37, 343號和第 RE35, 749 號；PCT 公開專利申請案 WO 99/07862 ；W0 98/37208 ；和 WO 98/26080 ；歐洲專利申請案 EP O 946736 ；EP O 732 403 ；EP O 480 480 ；W0 90/10277 ；EP 0 340986 ；EP 0 329 203 ；EP 0 324274 ;和 EP 0 164 556。也參看 Gellissen 等人，AntonieVan Leeuwenhoek(1992)62(1-2) :79-93 ；Romanos 等人，Yeast(1992) 8(6) :423-488 ;Goedde I ,METHODS IN ENZYM0L0GY (1990) 185:3-7，各文獻都是以引用的方式并入本文中。
在擴增階段，酵母宿主菌株可使用所屬領域技術人員已知的標準補料分批發酵方法在發酵罐中生長。所述發酵方法可用于說明特定酵母宿主的碳利用路徑或表達控制模式的差異。舉例來說，酵母菌屬(Saccharomyces)酵母宿主的發酵可能需要單ー葡萄糖原料、復合氮源(例如，酪蛋白水解物)和多種維生素補充。相比之下，甲醇酵母巴氏畢赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量礦物原料，但僅簡單銨(氮)鹽以供最佳生長和表達。例如參看美國專利第 5, 324, 639 號；Elliott 等人，J. Protein Chem. (1990)9:95 ;和 Fieschko 等人，Biotech. Bioeng. (1987) 29:1113，各文獻都是以引用的方式并入本文中。然而，所述發酵方法可具有與所使用的酵母宿主菌株無關的某些常見特征。舉例來說，可在擴增階段將限制生長的養分(通常為碳)加到發酵罐中以允許最大生長。此外，發酵方法一般使用經設計以含有足量的碳、氮、基礎鹽(basal salt)、磷和其它微量養分(維生素、痕量礦物和鹽等)的發酵培養基。適用于畢赤酵母屬的發酵培養基的實例描述于美國專利第5，324, 639號和第5，231，178號中，其是以引用的方式并入本文中。 感染桿狀病毒的昆蟲細胞術語“昆蟲宿主”或“昆蟲宿主細胞”是指可用作重組載體或其它轉移DNA的受體或已用作重組載體或其它轉移DNA的受體的昆蟲。所述術語包括已經轉染的原始昆蟲宿主細胞的子代。應了解，由于存在偶發突變或有意突變，単一親代細胞的子代的形態或基因組或總DNA補體可不必與原始親本完全相同。與親本足夠相似以通過相關特性(諸如，編碼所關注的多肽的核苷酸序列的存在)表征的親本細胞的子代包括在本定義所預期的子代中。表達所關注的多肽的適當昆蟲細胞的選擇已為所屬領域技術人員所知。數種昆蟲物種已在所屬領域中進行充分描述并且在市面有售，包括埃及斑蚊(Aedes aegypti)、家香(Bombyx mori)、黑腹果妮(Drosophila meIanogaster)、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。在選擇供表達的昆蟲宿主的過程中，適當的宿主可包括經證實尤其具有良好的分泌能力、低的蛋白水解活性和整體穩定性的宿主。昆蟲一般可從各種來源得到，包括(但不限干)加州大學(Berkeley，CA)生物物理學和醫學物理學系昆蟲基因儲備中心(Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysicsand Medical Physics, University of California)和美國典型微生物菌種保藏中心(“ATCC”)(Manassas, VA)。一般說來，感染桿狀病毒的昆蟲表達系統的組件包括轉移載體，通常為細菌質粒，其含有桿狀病毒基因組的片段和插入欲表達的異源基因的便利限制性位點；具有與轉移載體中的桿狀病毒特異性片段同源的序列(這允許將異源基因同源重組到桿狀病毒基因組中)的野生型桿狀病毒；和適當的昆蟲宿主細胞和生長培養基。用于構建載體、轉染細胞、揀選斑塊、使細胞在培養基中生長等的材料、方法和技術已為所屬領域技術人員所知并且可使用描述這些技術的手冊。將異源基因插入轉移載體中后，將載體和野生型病毒基因組轉染到昆蟲宿主細胞中，其中載體與病毒基因組重組。表達經包裝的重組病毒并且對重組斑塊進行鑒別和純化。用于桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統的材料和方法是從(例如)Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)以試劑盒形式購得。這些技術一般為所屬領域技術人員所知并且充分地描述于以弓I 用方式并入本文的 Summers and Smith, Texas Agricultural ExperimentStation Bulletin No. 1555 (1987)中。也參看 Richardson, 39 Methods in MolecularBiology: Baculovirus Expression Protocols (1995) ;ausubel 等人，current protocolsin molecular biology 16.9-16. 11(1994) ;king 和 Possee, The Baculovirus System:ALaboratory Guide(1992)；矛ロ O’Reilly 等人,Baculovirus Expression Vectors:ALaboratory Manual(1992)。事實上，所屬領域技術人員已知使用桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統進行的各種異源蛋白質的制造。例如，參看美國專利第6，368，825號、第6，342，216號、第6，338，846號、第 6，261，805 號、第 6，245，528 號、第 6，225，060 號、第 6，183，987 號、第 6，168，932 號、第 6，126，944 號、第 6，096，304 號、第 6，013，433 號、第 5，965，393 號、第 5，939，285 號、第 5，891，676 號、第 5，871，986 號、第 5，861，279 號、第 5，858，368 號、第 5，843，733 號、第5，762，939 號、第 5，753，220 號、第 5，605，827 號、第 5，583，023 號、第 5，571，709 號、第5，516，657 號、第 5，290，686 號、WO 02/06305、WO 01/90390、WO 01/27301、W001/05956、WO 00/55345、WO 00/20032、WO 99/51721、WO 99/45130、WO 99/31257、WO 99/10515、WO 99/09193、WO 97/26332、WO 96/29400、WO 96/25496、WO 96/06161、WO 95/20672、WO 93/03173、WO 92/16619、WO 92/02628、WO 92/01801、WO 90/14428、WO 90/10078、WO90/02566、WO 90/02186,WO 90/01556、WO 89/01038,WO 89/01037、WO 88/07082，所述專利都是以引用的方式并入本文中。可用于桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統的載體已為所屬領域中所知并且包括(例如)自桿狀病毒苜猜尺蠖(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcNPV)獲得的昆蟲表達和轉移載體，其為非輔助依賴性病毒表達載體(helper-independent viral expressionvector)。源自這一系統的病毒表達載體通常使用強的病毒多角體蛋白基因啟動子來驅動異源基因的表達。一般參看O’Reilly等人，Baculovirus Expression Vectors: ALaboratory Manual(1992)。在將外來基因插入桿狀病毒基因組之前，通常將上述組件(包含啟動子、前導序 列(視需要)、所關注的編碼序列和轉錄終止序列)組裝成中間移位構筑體(intermediatetransplacement construct)(轉移載體)。中間移位構筑體通常保持在復制子中，諸如能夠在宿主(諸如細菌)中穩定保持的染色體外元件(例如，質粒)。復制子將具有復制系統，因此使其能夠保持在適當宿主中以供克隆和擴増。更具體地說，質粒可含有多角體蛋白聚腺苷酸化信號(Miller, Ann. Rev. Microbiol. (1988)42:177)和原核生物氨比西林(ampicillin)抗性(amp)基因和復制起點以在大腸桿菌中選擇和繁埴。將外來基因引入AcNPV的ー種常用轉移載體為pAc373。也已設計出許多所屬領域技術人員已知的其它載體，包括(例如)PVL985，其將多角體蛋白起始密碼子從ATG變為ATT并且在ATT下游32個堿基對處引入BamHI克隆位點。參看Luckow和Summers, VIROLOGY170:31(1989)。其它市售載體包括(例如)PBlueBac4. 5/V5_His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBiueBac4. 5 (Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)。插入異源基因后，將轉移載體和野生型桿狀病毒基因組共轉染到昆蟲細胞宿主中。將異源DNA引入桿狀病毒中所需位點中的方法已為所屬領域所知。參看Summers和Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) ；Smith 等人，MOL. CELL. Biol. (1983) 3:2156 ；Luckow和 Summers, VIROLOGY(1989) 170:31。舉例來說，可通過同源雙交換重組插入到基因(諸如多角體蛋白基因)中；也可插入到工程設計于所需 桿狀病毒基因中的限制性酶位點中。參看Miller等人，BIOESSAYS (1989) 11 (4) : 91。轉染可通過電穿孔實現。參看Trotter和Wood, 39 Methods INMolecular Biology (1995) ；Mann 和 King, J. Gen. Virol. (1989)70:3501。 或者，可使用脂質體利用重組表達載體和桿狀病毒轉染昆蟲細胞。例如參看Liebman等人,Biotechniques(1999)26(I) :36 ；Graves 等人,Biochemistry(1998) 37:6050 ；Nomura等人，J. Biol. Chem. (1998)273(22):13570 ；Schmidt 等人，Protein Expression andPurification(1998)12:323 ;SifTert 等人，Nature Genetics(1998)18:45 ；Tilkins 等A, Cell Biology :A Laboratory Handbookl45-154 (1998) ;Cai 等人，Protein Expressionand Purification(1997) 10:263 ;Dolphin 等人，Nature Genetics (1997) 17:491 ；Kost 等人，Gene (1997) 190:139 Jakobsson 等人，J. Biol. Chem. (1996)271:22203 ；Rowles 等人,J. Biol. Chem. (1996) 271 (37) : 22376 ；Reverey 等人,J. Biol. Chem.(1996)271(39) :23607-10 !Stanley 等人,J. Biol. Chem. (1995)270:4121 ；Sisk 等人，J.VIROL. (1994) 68 (2) : 766 ；和 Peng 等人，BIOTECHNIQUES (1993) 14 (2) : 274。市售脂質體包括(例如)Cellfectin 和 Lipofectin (Invitrogen, Corp.，Carlsbad, CA)。此外，還可使用憐酸I丐轉染法。參看 Trotter 和 Wood, 39 Methods in Molecular Biology (1995)；Kitts, NAR(1990) 18 (19):5667 ;和 Mann 和 King, J. Gen. Virol. (1989)70:3501。桿狀病毒表達載體通常含有桿狀病毒啟動子。桿狀病毒啟動子是能夠結合桿狀病毒RNA聚合酶并且起始編碼序列(例如，結構基因)下游(3’)轉錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子將具有通常放在接近編碼序列5’端的轉錄起始區。所述轉錄起始區通常包括RNA聚合酶結合位點和轉錄起始位點。桿狀病毒啟動子也可具有稱為增強子的第二域，如果存在，那么其通常在結構基因的遠端。此外，表達可為經調控表達或組成性表達。在感染循環的后期大量轉錄的結構基因提供特別有用的啟動子序列。實例包括從編碼病毒多角體蛋白的基因(Friesen等人，The Regulation of Baculovirus GeneExpression,在 THE MOLECULAR Biology OF Baculoviruses (1986)中；EP 0 127 839 和 0155 476)和編碼plO蛋白的基因(Vlak等人，J. Gen. Virol. (1988)69:765)得到的序列。將新近形成的桿狀病毒表達載體包裝于感染性重組桿狀病毒中并且隨后可通過所屬領域技術人員已知的技術對所生長的斑塊進行純化。參看Miller等人，BIOESSAYS(1989) 11 (4):91 ;Summers 和 Smith, Texas Agricultural ExperimentStation Bulletin No. 1555(1987)。已研發出重組桿狀病毒表達載體以感染到若干昆蟲細胞中。舉例來說，已研發出重組桿狀病毒用于(尤其)埃及斑蚊(ATCC第CCL-125號)、家蠶(ATCC第CRL-8910號)、黑腹果蠅(ATCC第1963號)、草地貪夜蛾和粉紋夜蛾。參看Wright, Nature (1986) 321:718 ；Carbonell 等人，J. VIROL. (1985) 56:153 ;Smith 等人，Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156。一般參看Fraser等人，In Vitro Cell. Dev. Biol. (1989) 25:225。更具體來說，用于桿狀病毒表達載體系統的細胞系通常包括(但不限于)Sf9 (草地貪夜蛾)(ATCC第CRL-1711號)、Sf21 (草地貪夜蛾)(Invitrogen Corp.,目錄號 11497-013 (Carlsbad, CA))、Tri_368 (粉紋夜蛾)和 High-Five BTI-TN-5B1-4 (粉紋夜蛾)。細胞和培養基可為市售以用于在桿狀病毒/表達中直接表達和融合表達異源多肽，并且細胞培養技術一般為所屬領域技術人員所知。 大腸桿菌、假單胞菌屬和其它原核生物所屬領域技術人員已知細菌表達技木。多種載體可用于細菌宿主中。所述載體可以為單一拷貝或者低或高多拷貝載體。載體可用于克隆和/或表達。鑒于存在有關載體、許多載體市面有售以及甚至描述載體和其限制性圖譜與特征的手冊的大量文獻，此處就不需要多加論述。眾所周知，載體通常涉及允許選擇的標記，這些標記可提供細胞毒性劑抗性、原養性或免疫性。通常，存在將提供不同特征的多種標記。細菌啟動子是能夠結合細菌RNA聚合酶并且起始編碼序列(例如，結構基因)下游(3’)轉錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子將具有通常放在接近編碼序列5’端的轉錄起始區。所述轉錄起始區通常包括RNA聚合酶結合位點和轉錄起始位點。細菌啟動子也可具有稱為操縱子的第二域，其可與開始RNA合成的相鄰RNA聚合酶結合位點重疊。當基因阻遏蛋白可結合操縱子并且由此抑制特定基因的轉錄時，操縱子允許負調控(可誘導)轉錄。組成性表達可在不存在負調控元件(諸如操縱子)的情況下發生。此外，可通過基因活化蛋白結合序列(如果存在，則通常鄰近(5’)RNA聚合酶結合序列)實現正調控。基因活化蛋白的實例為分解代謝物活化蛋白(CAP)，其幫助起始大腸桿菌中Iac操縱子的轉錄[Raibaud等人，Annu. Rev. Genet. (1984) 18:173]。因此，調控表達可為正或負調控表達，由此增強或減弱轉錄。編碼代謝路徑酶的序列提供特別有用的啟動子序列。實例包括自糖代謝酶獲得的啟動子序列，諸如，半乳糖、乳糖(lac) [Chang等人，NATURE(1977) 198:1056]和麥芽糖。其它實例包括自生物合成酶獲得的啟動子序列，諸如色氨酸(trp) [Goeddel等人，Nuc.ACIDS RES. (1980)8:4057 ;Yelverton 等人,Nucl. Acids Res. (1981)9:731 ;美國專利第4，738，921號；EP公開案第036 776號和第121 775號，其是以引用的方式并入本文中]ο β -半乳糖苷酶(bla)啟動子系統[Weissmann (1981) “The cloning of interferonand other mistakes.，，In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)λ PL[Shimatake 等人，Nature (1981) 292:128]和T5 [美國專利第4，689，406號，其是以引用的方式并入本文]啟動子系統也提供有用的啟動子序列。可使用強啟動子(諸如Τ7啟動子)以高水平誘導所關注的多肽。所述載體的實例已為所屬領域技術人員所知并且包括來自Novagen的ρΕΤ29系列和W099/05297 (其是以引用的方式并入本文)中所述的pPOP載體。所述表達系統在不損害宿主細胞的活力或生長參數的情況下于宿主中產生高水平的多肽。PET19 (Novagen)為所屬領域已知的另ー載體。此外，自然界中不存在的合成啟動子也可充當細菌啟動子。舉例來說，可將ー種細菌或噬菌體啟動子的轉錄活化序列與另ー種細菌或噬菌體啟動子的操縱子序列連接，從而產生合成雜合啟動子[美國專利第4，551，433號，其是以引用的方式并入本文中]。舉例來說，tac啟動子為由trp啟動子與Iac操縱子序列構成的雜合trp-lac啟動子,其受到 Iac 阻遏子調控[Amann 等人,Gene (1983) 25:167 ；de Boer 等人,Proc. Natl. Acad. Sci.(1983)80:21]。此外，細菌啟動子可包括具有結合細菌 RNA聚合酶并且起始轉錄的能力的非細菌來源的天然存在啟動子。也可將非細菌來源的天然存在的啟動子與可相容的RNA聚合物偶聯以使ー些基因在原核生物中高水平表達。噬菌體T7 RNA聚合酶/啟動子系統為偶聯啟動子系統的實例[Studier 等人，J. Mol. BIOL. (1986) 189:113 ;Tabor 等人，Proc Natl.Acad. Sci. (1985)82:1074]。此外，雜合啟動子也可由噬菌體啟動子和大腸桿菌操縱子區構成(EP公開案第267 851號)。除起作用的啟動子序列外，有效的核糖體結合位點對于原核生物中外來基因的表達也有用。在大腸桿菌中，核糖體結合位點被稱為Shine-Dalgarno (SD)序列并且包括起始密碼子(ATG)和位于起始密碼子上游3-11個核苷酸處3-9個核苷酸長的序列[Shine等人，Nature (1975) 254:34]。認為SD序列通過SD序列與大腸桿菌16S rRNA的3’端之間的喊基配對來促進mRNA與核糖體的結合[Steitz等人“Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA，，，In Biological Regulation and Development: GeneExpression (R. F. Goldberger編，1979)]。為表達具有弱核糖體結合位點的真核基因和原核達因[Sambrookせ人‘‘Expression of cloned genes in Escherichia coli，，，MolecularCloning:A Laboratory Manual, 1989]。術語“細菌宿主”或“細菌宿主細胞”是指可用作重組載體或其它轉移DNA的受體或已用作重組載體或其它轉移DNA的受體的細菌。所述術語包括已經轉染的原始細菌宿主細胞的子代。應了解，由于存在偶發突變或有意突變，単一親代細胞的子代的形態或基因組或總DNA補體可不必與原始親本完全相同。與親本足夠相似以通過相關特性(諸如，編碼所關注的多肽的核苷酸序列的存在)表征的親本細胞的子代包括在本定義所預期的子代中。表達多肽的適當宿主細菌的選擇已為所屬領域技術人員所知。在選擇供表達的細菌宿主的過程中，適當的宿主可包括經證實尤其具有良好的包涵體形成能力、低的蛋白水解活性和整體穩定性的宿主。細菌宿主一般可從各種來源得到，包括(但不限干)加州大學(Berkeley，CA)生物物理學和醫學物理學系細菌基因儲備中心和美國典型微生物菌種保藏中心(“ATCC”)(Manassas, VA)。エ業/藥物發酵一般使用自K菌株獲得的細菌(例如W3110)或自B菌株獲得的細菌(例如，BL21)。由于這些菌株的生長參數眾所周知并且相當穩定，故其特別有用。此外，這些菌株為非病原性菌株，出于安全和環境原因，其在商業上也極為重要。適當大腸桿菌宿主的其它實例包括(但不限干)菌株BL21、DH10B或其衍生物。在本發明方法的另ー個實施例中，大腸桿菌宿主為負蛋白酶菌株(protease minus strain),包括(但不限干)OMP-和L0N-。宿主細胞株可為假單胞菌屬，包括(但不限干)熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌。已知熒光假單胞菌生物型1(稱為菌株MBlOl)對于重組制造有用并且可用于治療性蛋白質的制造過程中。假單胞菌表達系統的實例包括購自TheDow Chemical Company的系統作為宿主菌株(Midland, Ml,可在國際互聯網dow. com上獲得)。美國專利第4，755，465號和第4，859，600號(以引用的方式并入本文中)中描述假單胞菌菌株作為宿主細胞用于hGH制造的用途。在產生重組宿主細胞株(B卩，已將表達構筑體引入宿主細胞中并且將具有適當表達構筑體的宿主細胞分離)后，在適于制造所關注的多肽的條件下培養所述重組宿主細胞株。如所屬領域技術人員顯而易見，重組宿主細胞株的培養方法將視所利用的表達構筑體的性質和宿主細胞的身份而定。通常使用所屬領域眾所周知的方法來培養重組宿主菌株。重組宿主細胞通常是在含有可吸收的碳源、氮源和無機鹽源并且視情況含有維生素、氨基酸、生長因子和所屬領域技術人員已知的其它蛋白質培養補充物的液體培養基中培養。培養宿主細胞的液體培養基可視情況含有用于防止不需要的微生物生長的抗生素或抗真菌齊U，和/或用于選擇含有表達載體的宿主細胞的化合物，包括(但不限干)抗生素。可以分批或連續方式培養重組宿主細胞，且以分批或連續方式進行細胞采集(在所關注的多肽在細胞內積累的情況中)或進行培養物上清液的采集。對于在原核宿主細胞 中制造來說，優選分批培養和細胞采集。詵擇件密碼子本發明的選擇性密碼子擴展蛋白質生物合成機器的遺傳密碼子框架。舉例來說，選擇性密碼子包括(例如)獨特的三堿基密碼子；無義密碼子，諸如終止密碼子，包括(但不限干)琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或蛋白石密碼子(UGA);非天然密碼子；四堿基(或更多堿基)密碼子；稀有密碼子等。可將多個(例如ー個或ー個以上、兩個或兩個以上、三個或三個以上等)選擇性密碼子引入所需基因或多肽中。在一個實施例中，所述方法涉及使用為終止密碼子的選擇性密碼子以在活體內并入所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)。舉例來說，制造識別終止密碼子并且通過O-RS用所選氨基酸氨酰基化的Ο-tRNA。天然存在的宿主氨酰基tRNA合成酶不識別所述Ο-tRNA。可使用常規定點誘變將終止密碼子引入所關注的多肽中的所關注的位點處。例如參看 Sayers, J. R.等人(1988), 5 ' -3，Exonucleases in phosphorotnioate—basedoligonucleotide-directed mutaRenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802。當例如在活體內將0-RS、Ο-tRNA和編碼所關注的多肽的核酸組合吋，響應終止密碼子而并入所選氨基酸從而得到在特定位置處含有所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。在本發明的ー個實施例中，用作選擇性密碼子的終止密碼子為琥珀密碼子UAG和/或蛋白石密碼子UGA。舉例來說，有關識別琥珀密碼子的Ο-tRNA的實例參看SEQ ID NO. :6，并且有關識別蛋白石密碼子的Ο-tRNA的實例參看SEQ ID NO. :7。將UAG和UGA用作選擇性密碼子的遺傳密碼可在保留赭石無義密碼子UAA (其為最豐富的終止信號)的同時編碼22個氨基酸。在活體內并入所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)可在不顯著干擾宿主細胞的情況下進行。舉例來說，在非真核細胞(諸如大腸桿菌)中，由于UAG密碼子的抑制效率視0-tRNA(例如，琥珀抑制性tRNA)與釋放因子I (RFl)(其與UAG密碼子結合并且起始正在生長的肽從核糖體釋放)之間的競爭而定，故所述抑制效率可(例如)通過增加Ο-tRNA (例如，抑制性tRNA)的表達水平或使用RFl缺陷型菌株來加以調節。在真核細胞中，由于UAG密碼子的抑制效率視Ο-tRNA (例如，琥珀抑制性tRNA)與真核釋放因子(例如，eRF)(其結合終止密碼子并且起始正在生長的肽從核糖體釋放)之間的競爭而定，故所述抑制效率可(例如)通過增加Ο-tRNA (例如，抑制性tRNA)的表達水平來加以調節。非天然氨基酸也可用稀有密碼子來編碼。舉例來說，當活體外蛋白質合成反應中精氨酸的濃度降低吋，經證實，稀有的精氨酸密碼子AGG對于通過經丙氨酸酰基化的合成tRNA插入Ala有效。例如參看Ma等人，Biochemistry, 32:7939(1993)。在這一情況中，合成tRNA與在大腸桿菌中作為少量物質存在的天然存在的tRNAArg競爭。ー些有機體不使用所有三聯體密碼子。已將藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)中的未指定密碼子AGA用于在活體外轉錄/翻譯提取物中插入氨基酸。例如參看Kowal和Oliver, Nucl. Acid.Res. .25:4685(1997)。可產生本發明的組件以在活體內使用這些稀有密碼子。選擇性密碼子也包含擴充的密碼子，例如四個或四個以上堿基的密碼子，諸如四 堿基密碼子、五堿基密碼子、六堿基密碼子或更多個堿基的密碼子。四堿基密碼子的實例包括(但不限于)AGGA, CUAG, UAGA, CCCU等。五堿基密碼子的實例包括(但不限于)AGGAC,CCCCU、CCCUC、CUAGA, CUACU、UAGGC等。特征可包括基于移碼抑制使用擴充的密碼子。四個或四個以上堿基的密碼子可將(例如)一個或多個所選氨基酸(包括但不限于，非天然氨基酸)插入同一蛋白質中。舉例來說，在存在具有反密碼子環、例如具有CU(X)nXXXAA序列(其中n=l)的突變Ο-tRNA (例如，特定移碼抑制性tRNA)的情況下，將四個或四個以上堿基的密碼子讀作單ー氨基酸。舉例來說，有關識別四堿基密碼子的Ο-tRNA參看PCT/US04/22061的SEQ ID NO. :6、12。在其它實施例中，反密碼子環可解碼(例如)至少四堿基密碼子、至少五堿基密碼子或至少六堿基密碼子或更多堿基的密碼子。由于存在256個可能的四堿基密碼子，故可在同一細胞中使用四個或四個以上堿基的密碼子編碼多個非天然氨基酸。參看 Anderson 等人，(2002) Exploring the Limits of Codon and AnticodonSize, Chemistry and BioIory,9:237-244 MaRliery, (2001) Expanding the GeneticCode:Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identiiicationof ^Shifty Four-base Codons with a Library Approach in Eschericma coil，J. Mol.Biol.307:755-769o舉例來說，已使用四堿基密碼子使用活體外生物合成方法將非天然氨基酸并入蛋白質中。例如參看 Ma 等人，(1993) Biochemistry, 32:7939 :和 Hohsaka 等人,(1999) .1. Am.Chem. Soc. 121:34。使用CGGG和AGGU利用兩個以化學方式酰基化的移碼抑制性tRNA在活體外將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物同時并入抗生蛋白鏈菌素中。例如參看Hohsaka等人，(1999) .1. Am. Chem. Soc, 121:12194。在活體內研究中，Moore等人檢查具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力，并且發現四聯體UAGA可以通過具有UCUA反密碼子的tRNALeu以13%到26%的效率解碼且在O或-1框內極少解碼。參看Moore等人，(2000)1. Mol. Biol, 298:195。在一個實施例中，可將基于稀有密碼子或無義密碼子的擴充的密碼子用于本發明中，其可減少錯義通讀和其它不合需要的位點處的移碼抑制。對于指定系統來說，選擇性密碼子也可包括ー個天然三堿基密碼子，其中內源系統不使用(或極少使用)天然堿基密碼子。舉例來說，這包括缺乏識別天然三堿基密碼子的tRNA的系統和/或三堿基密碼子為稀有密碼子的系統。選擇性密碼子視情況包括非天然堿基對。這些非天然堿基對使現有的遺傳代碼進ー步擴展。ー種額外的堿基對使三聯體密碼子的數量從64増加到125。第三堿基對的特性包括穩定且具選擇性的堿基配對、通過聚合酶以高保真度有效酶促并入DNA中和合成新的非天然堿基對之后有效的持續引物延伸。可用于方法和組合物的非天然堿基對的描述包括(例如)Hirao %=人，(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acidanalogues into protein. Nature Biotechnology, 20:177-182。還參看Wu, Y.等人，(2002)T. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630。其它相關公開案列于下文中。對于活體內使用來說，非天然核苷可滲透膜并且磷酸化形成相應的三磷酸鹽。此外，増加的遺傳信息穩定并且不被細胞酶所破壞。Benner和其它人先前的工作利用不同于規范Watson-Crick配對的氫鍵模式，最值得關注的實例為iso_C: iso_G配對。例如參看 Switzer 等人，(1989) T. Am. Chem. Soc, 111:8322 ；和 Piccirilli 等人，(1990)Nature, 343:33 Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. , 4:602。一般說來，這些喊基以某種程度與天然堿基錯配并且無法酶促復制。Kool和同事證實，堿基之間的疏水堆積相互作用可替代氫鍵以驅動堿基對的形成。參看Kool, (2000)Curr. Opin. Chem. Biol. 4:602 :和Guckian 和 Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 36, 2825。在研發滿足所有上述需求的 非天然堿基對的工作中，Schultz、Romesberg和同事已系統地合成一系列非天然疏水堿基并且對其進行研究。已發現，PICS:PICS自身配對比天然堿基對穩定，并且能夠通過大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。例如參看McMinn等人，(1999)T. Am. Chem. Soc. 121:11585—6 ;和Ogawa等人，(2000) T. Am. Chem. Soc. 122:3274。3MN:3MN 自身配對可通過KF以足以用于生物功能的效率和選擇性合成。例如參看Ogawa等人，(2000)J. Am. Chem. Soc, 122:8803。然而,兩種堿基都充當用于進ー步復制的鏈終止子。近來已開發出可用于復制PICS自身配對的突變體DNA聚合酶。此外，可復制7AI自身配對。例如參看Tae等人，(2001) .1. Am. Chem. Soc, 123:7439。也已開發出新穎的金屬堿基對Dipic: Py,其在結合 Cu(II)后形成穩定的配對。參看 Meggers 等人，(2000) .1. Am. Chem. Soc, 122:10714。由于擴充的密碼子和非天然密碼子內在地與天然密碼子正交，故本發明的方法可利用這ー特性產生正交tRNA供其使用。也可使用翻譯旁路系統將所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)并入所需多肽中。在翻譯旁路系統中，將較大序列插入基因中但并不被翻譯成蛋白質。所述序列含有充當誘導核糖體越過所述序列并且在插入下游重新開始翻譯的線索的結構。經選擇目.非天然的氨基酸如本文所使用，所選氨基酸是指任何所需的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。天然存在的氨基酸包括二十種遺傳編碼的α-氨基酸中的任ー種丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。在一個實施例中，將所選氨基酸以高保真度(例如)以對指定的選擇性密碼子大于約70%的效率、對指定的選擇性密碼子大于75%的效率、對指定的選擇性密碼子大于約80%的效率、對指定的選擇性密碼子大于約85%的效率、對指定的選擇性密碼子大于約90%的效率、對指定的選擇性密碼子大于約95%的效率或對指定的選擇性密碼子大于約99%或更高的效率并入正在生長的多肽鏈中。如本文所使用，非天然氨基酸是指任何氨基酸、經修飾氨基酸或除硒代半胱氨酸和/或吡咯賴氨酸和以下二十種遺傳編碼的α-氨基酸外的氨基酸類似物丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。α -氨基酸的通用結構如式I中所示
權利要求
1.一種組合物，其具有tRNA，前述tRNA或其部分是由SEQ ID NO: 1、3中所述的聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列編碼。
2.根據權利要求I所述的組合物，其中所述tRNA經氨酰基化。
3.根據權利要求2所述的組合物，其中所述tRNA經非天然編碼的氨基酸氨酰基化。
4.根據權利要求3所述的組合物，其中所述非天然編碼的氨基酸為對乙酰基苯丙氨酸。
5.根據權利要求2所述的組合物，其中所述tRNA以化學方式經氨酰基化。
6.根據權利要求2所述的組合物，其中所述tRNA以酶方式經氨酰基化。
7.根據權利要求6所述的組合物，其中所述tRNA經tRNA合成酶(RS)或經核糖體以酶方式氨酰基化。
8.根據權利要求I所述的組合物,其另外包含tRNA合成酶(RS)，其中所述tRNA經氨基酸氨酰基化。
9.根據權利要求8所述的組合物，其中所述氨基酸為非天然編碼的氨基酸。
10.根據權利要求9所述的組合物，其中所述非天然編碼的氨基酸為對乙酰基苯丙氨酸。
11.根據權利要求I所述的組合物，其中所述tRNA自古細菌tRNA得到。
12.根據權利要求I所述的組合物,其中所述tRNA自詹氏甲燒球菌(M.janneschii)得到。
13.根據權利要求I所述的組合物，其另外包含翻譯系統。
14.根據權利要求13所述的組合物，其中所述翻譯系統為無細胞翻譯系統。
15.根據權利要求13所述的組合物，其中所述翻譯系統為細胞溶解產物。
16.根據權利要求13所述的組合物，其中所述翻譯系統為重建的系統。
17.根據權利要求13所述的組合物，其中所述翻譯系統為細胞翻譯系統。
18.一種細胞，其包含翻譯系統，其中所述翻譯系統包含權利要求I的tRNA。
19.根據權利要求18所述的細胞，其中所述細胞是真核細胞。
20.根據權利要求19所述的細胞，其中所述真核細胞是酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞。
21.根據權利要求18所述的細胞，其中所述細胞是非真核細胞。
22.根據權利要求21所述的細胞，其中所述非真核細胞是大腸桿菌(E.coli)細胞。
23.根據權利要求18所述的細胞，其另外包含編碼所關注的多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含由所述tRNA識別的選擇性密碼子。
24.根據權利要求23所述的細胞，其中所述所關注的多肽為人生長激素。
25.一種細胞，其包含權利要求I的tRNA :其中所述細胞是大腸桿菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞。
26.—種載體，其具有tRNA，所述tRNA或其部分是由SEQ ID NO: 1、3中所述的聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列編碼。
27.根據權利要求26所述的載體，其中所述載體包含質粒或病毒。
28.根據權利要求27所述的載體，其中所述載體包含柯斯質粒(cosmid)或噬菌體。
29.根據權利要求26所述的載體，其中所述載體為表達載體。
30.一種細胞，其包含權利要求26的載體。
31.一種在細胞中制造在特定位置處具有所選氨基酸的多肽的方法，所述方法包含 使所述細胞在適當培養基中生長，其中所述細胞包含核酸，所述核酸包含至少一個選擇性密碼子并且編碼多肽；和提供所述所選氨基酸； 其中所述細胞另外具有 正交tRNA (O-tRNA)，其在所述細胞中起作用并且識別具有選自由SEQ ID NO:l、3、其互補聚核苷酸序列編碼的序列組成的群組的核酸序列的選擇性密碼子；和 正交氨酰基tRNA合成酶(0-RS)，其中所述O-RS利用所述所選氨基酸使所述0-tRNA氨酰基化。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述所選氨基酸為對乙酰基苯丙氨酸。
33.根據權利要求31所述的方法，其中所述多肽為人生長激素。
全文摘要
本發明提供制造蛋白質生物合成機器的組件的組合物和方法，所述組合物和方法包括正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和正交tRNA/合成酶對。本發明還提供鑒別這些正交對的方法以及使用這些正交對制造蛋白質的方法。
文檔編號C12N15/63GK102703446SQ201210175059
公開日2012年10月3日 申請日期2005年12月1日 優先權日2005年8月18日
發明者芬·蒂昂 申請人:Ambrx公司