專利名稱：轉基因米粉標準樣品、其建立方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于轉基因食品檢測技術領域，具體涉及轉基因米粉BT63的標準樣品制備、其建立方法及其在檢測轉基因米粉BT63中的應用。
背景技術：
水稻是人民生活的主糧，我國又是水稻的主產區，毎年我國出口到日本、韓國等國家的糙米、大米等產品占我國水稻產量的近1/3。為提高水稻產量，我國在轉基因水稻研究方面已經進行了廣泛深入的研究，并取得了可喜的成果 ，但并未批準進行商業化種植。然而，去年在湖北等國內市場上出現了未經商業化批準種植的轉BT基因大米的銷售，并被國外檢測公司公布于眾。這給我國農產品的貿易帶來了非常不好的影響。為此，韓國、日本等國對我國出口的糙米、大米等產品要求批批實施轉基因的檢測。轉Bt基因抗蟲水稻尚未在全球任何地區獲準種植，對于Bt轉基因水稻也未通過任何環境影響評估和人類食品安全評估。但是，從其它Bt轉基因作物(如玉米和棉花)的研究結果中，已經可以推斷出Bt水稻會對環境造成極大的影響，并且引起人類食品安全問題。2006年以來，我國出口的米制品中多次被歐盟和日本檢出轉基因水稻成分，其中多為我國研發的轉基因水稻汕優63號(BT63)。由于我國尚未向轉基因水稻發放生物安全證書，出口米制品中檢出轉基因水稻成分對我國的米制品出口貿易造成了一定影響。與出ロ米制品類似，我國檢驗檢疫部門也從美國進ロ的大米中檢出了未經我國批準進境的抗除草劑轉基因水稻成分。開展轉基因成分檢驗標準樣品的研制在保證測試結果的可比性和溯源性，保障食品安全，解決貿易爭端，促進經濟發展等方面均具有重要的意義。2008年，我們首次研制了轉基因玉米Mon810品系、NK603品系、T25品系、BTll品系、轉基因油菜RT73品系標準樣品以及相應的分子DNA標準樣品，填補了國內空白。這些標準樣品在轉基因產品檢測工作中發揮了巨大作用。然而，在我國米制品出口被檢測出轉基因BT63成分后，國內外各食品安全管理機構和檢測機構，開始大量地開展米制品中轉基因成分BT63的檢測，但國內外市場卻始終沒有轉基因BT63的標準樣品。國內轉基因BT63品系標準樣品緊缺。
發明內容
鑒于國內轉基因水稻BT63品系標準樣品緊缺的狀況，我們研制了轉基因米粉BT63品系標準樣品，本發明中，所述的轉基因米粉BT63即轉基因水稻BT63磨制成粉狀之后的產品，本項標準樣品的制備完成，對全面深入的研究解決轉基因成分檢測標準樣品的制備技術和穩定性保證技術，積極開展我國轉基因產品檢測標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現實意義。轉基因水稻BT63品系簡介轉基因水稻BT63在進行基因轉化時轉入的外源基因是抗蟲基因crylAb/crylAc，由NOS終止子調控。本發明通過以下技術路線實現本發明的一方面在于公開ー種轉基因米粉BT63標準樣品，其由下述方法制備，步驟包括a.在無菌操作間中，使用研缽粉磨水稻樣品，過100目標準篩，制成了米粉，向粉末中加入4倍質量的水，攪拌均勻；b.將混合樣品放置于中試凍干機中低溫真空冷凍干燥制備成混合凍干粉；c.將混合凍干粉樣品分裝于經160° C干熱處理2h的潔凈的棕色玻璃瓶中封蓋密封，甸瓶內裝混合凍干粉樣品lg。d.獲500瓶轉基因米粉標準樣品。瓶裝后的樣品加貼唯一性標識，放置于陰涼干燥處(TC 4°C貯存。上述步驟(a) Cd)中任ー項所述的凍干，其具體步驟如下低溫真空冷凍干燥程序①樣品預凍先把樣品在_80°C冷凍2h ；②冷凍過程關好冰凍干燥機的干燥室門，開始干燥室制冷；干燥室溫度降至-35°C時，開始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至-40°C時，將步驟①處理的樣品迅速放入干燥室內，關好干燥室門；啟動真空泵開始抽真空；當真空度降至O. 5Torr時，結束冷凍過程；③樣品干燥干燥室的溫度設置為15°C，當真空度降至O. ITorr吋，樣品已干燥好;④關閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內外氣壓平衡后，打開干燥室門，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋。本發明的另一方面在于公開ー種轉基因水稻BT63的Real-Time PCR檢測試劑盒，包括轉基因米粉BT63檢測基因和陽性標準對照品，其中，陽性標準對照品是利用上述a d的方法制備的轉基因米粉BT63標準樣品；轉基因米粉BT63檢測基因，包括SPS基因的檢測引物和探針序列正向引物5，-ttgcgcctgaacggatat-3’SEQ ID NO 1反向引物5，-cggttgatcttttcgggatg-3，SEQ ID NO 2探針5，-FAM-tccgagccgtccgtgcgtc-TAMRA-3，SEQ ID NO 3crylAc/NOS基因的檢測引物和探針序列正向引物5，-gactgctggagtgattatcgacaga-3，SEQ ID NO 4反向引物5，-agctcggtacctcgacttattcag-3，SEQ ID NO 5探針5，-FAM-tcgagttcattccagttactgcaacactcgag-TAMRA-3，SEQ ID NO 6其中FAM為 6-carboxyfluorescein, TAMRA 為 6-carboxytetramethylrhodamine。本發明中，上述檢測試劑盒中，采用了開放式的描述形式，其含義是均未限定檢測試劑盒中的其他緩沖液等成分，因其可根據現有技術確定，并通過配置或商業途徑購買獲得，檢測試劑盒的使用方法和檢測條件，技術人員可以依據實施例中所列條件做參考依據進行調整。這些關于制劑方式和方法的選擇，相信本領域技術人員可以從現有技術中得到充分的啟示，本發明不再贅述。
試劑盒的使用方法是以待測樣品的基因組為模板，利用轉基因米粉BT63檢測基因，經過Real-Time PCR反應，結束后確認Real-Time PCR的擴增曲線，先制作標準曲線，最后可以利用公式計算待測樣品中轉基因成分的含量。或者通過PCR特異性的引物和探針序列，擴增待測樣品與陽性標準對照品，并將擴增的結果進行比對，確認樣品中是否含有轉基因水稻BT63品種，具體制作和檢測方法參照實施例。上文所描述的使用方法，是本領域技術人員常用的方式，以此為例，本領域技術人員可以通過結合現有技術的公知常識進行更多拓展。本發明的創新特征是本項標準樣品的制備完成及其制備方法的建立，對解決轉基因BT63品系檢測分子標準樣品的制備技術和穩定性保證技術，開 展我國轉基因產品檢測標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現實意義及應用價值。
圖I :轉基因米粉BT63標準樣品制備、檢測エ藝流程。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。轉基因水稻BT63在進行基因轉化時轉入的外源基因是抗蟲基因crylAb/crylAc，由NOS終止子調控。我國尚未發放轉基因水稻BT63生物安全證書。轉基因水稻BT63品系原料獲贈于遼寧出入境檢驗檢疫局；研缽，100目標準篩，DNA提取試劑和PCR反應試劑均購于寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司(貨號D9093)；TaqMan Universal Master Mix :購于 ABI 公司；引物和探針寶生物工程(大連)有限公司合成；實時熒光定量PCR儀ABI 7500型；核酸蛋白分析儀日本日立公司。實施例I轉基因米粉狀標準樣品的制備步驟a.在無菌操作間中，使用研缽粉磨水稻樣品，過100目標準篩，向粉末中加入4倍質量的水，攪拌均勻；b.將混合樣品放置于中試凍干機中低溫真空冷凍干燥制備成混合凍干粉；c.將混合凍干粉樣品分裝于經160°C干熱處理2h的潔凈的棕色玻璃瓶中封蓋密封，甸瓶內裝混合凍干粉樣品lg。d.獲500瓶轉基因米粉標準樣品。瓶裝后的樣品加貼唯一性標識，放置于陰涼干燥處(TC 4°C貯存。上述步驟(a) Cd)中任ー項所述的凍干，其具體步驟如下低溫真空冷凍干燥程序
①樣品預凍先把樣品在_80°C冷凍2h ；②冷凍過程關好冰凍干燥機的干燥室門，開始干燥室制冷；干燥室溫度降至-35°C時，開始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至-40°C時，將步驟①處理的樣品迅速放入干燥室內，關好干燥室門；啟動真空泵開始抽真空；當真空度降至O. 5Torr時，結束冷凍過程；③樣品干燥干燥室的溫度設置為15°C，當真空度降至O. ITorr時，樣品已干燥好;④關閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內外氣壓平衡后，打開干燥室門，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋，制備成混合凍干粉。e.將混合凍干粉樣品分裝于經160°C干熱處理2h的潔凈的棕色玻璃瓶中封蓋密封，甸瓶內裝混合凍干粉樣品lg，獲500瓶轉基因米粉標準樣品。瓶裝后的樣品加貼卩隹一性標識，放置于陰涼干燥處0°C 4°C貯存。實施例2定值方法采用《水稻及其產品中轉基因成分實時熒光PCR檢測方法》SN/T 2584-2010和《轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法》GB/T 19495. 5-2004進行定值。(a) DNA提取試劑盒寶生物工程(大連)有限公司(貨號D9093)(b) TaqMan Universal Master Mix :ABI 公司(c)實時熒光定量PCR儀ABI 7500型(d)核酸蛋白分析儀日本日立公司檢測轉基因水稻BT63品系特異性及內源SPS基因的引物序列和探針序列見下表I。表I檢測轉基因水稻BT63品系特異性基因的引物序列和探針序列SPS棚的檢測11物和探針序列.
權利要求
1.轉基因米粉BT63標準樣品，其特征在干，由下述方法制備，步驟包括 將原料研磨成粉末，過100目篩，將過篩后的粉末收集，向粉末中加入4倍質量的水，攪拌均勻后，放置于中試凍干機中低溫真空冷凍干燥制備成凍干粉；分裝后于0°C 4°C貯存；上述低溫真空冷凍干燥的步驟包括 ①樣品預凍先把樣品在_80°C冷凍2h； ②冷凍過程關好冰凍干燥機的干燥室門，開始干燥室制冷；干燥室溫度降至-35°C吋，開始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至-40°C吋，將步驟①處理的樣品迅速放入干燥室內，關好干燥室門；啟動真空泵開始抽真空；當真空度降至O. 5Torr時，結束冷凍過程； ③樣品干燥干燥室的溫度設置為15°C，當真空度降至O.ITorr吋，樣品已干燥好； ④關閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內外氣壓平衡后，打開干燥室門，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋。
2.—種轉基因水稻BT63的Real-Time PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括轉基因米粉BT63檢測基因和陽性標準對照品 陽性標準對照品是權利要求2所述的轉基因米粉BT63標準樣品； 轉基因米粉BT63檢測基因，包括 SPS基因的檢測引物和探針序列 正向引物 SEQIDN0:1 反向引物 SEQ ID NO :2 探針SEQ ID NO 3 crylAc/NOS基因的檢測引物和探針序列 正向引物 SEQ ID NO :4 反向引物 SEQ ID NO :5 探針SEQ ID NO :6。
全文摘要
本發明公開一種轉基因米粉BT63的標準樣品制備、其建立方法及其在檢測轉基因水稻BT63中的應用，分別以轉基因水稻BT63為原料，將原料研磨、過篩、加水，攪拌、制備成凍干粉；再分裝,0℃~4℃貯存；通過上述方法獲得轉基因米粉BT63的標準樣品，也可以應用于轉基因水稻BT63的Real-Time PCR檢測試劑盒。這對全面深入的研究解決轉基因成分檢測標準樣品的制備技術和穩定性保證技術，積極開展我國轉基因產品檢測標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現實意義。
文檔編號C12Q1/68GK102690885SQ20121017220
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月30日 優先權日2012年5月30日
發明者于兵, 徐君怡, 曹冬梅, 曹際娟 申請人:于兵, 徐君怡, 曹冬梅, 曹際娟