專利名稱：一種利用兩段pH控制生產堿性果膠酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產堿性果膠酶的方法，尤其涉及一種通過對補料前后PH進行分段控制發酵生產堿性果膠酶的方法，屬于生物酶制備技術領域。
背景技術：
果膠酶(pectinases)是大一類可分解植物細胞壁組分果膠質的酶系總稱，從分解方式上可以將果膠酶分為果膠水解酶和果膠裂解酶，前者主要包括原果膠酶(PPase)、果膠酯酶(PE)、低聚半乳糖醛酸水解酶、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、聚半乳糖醛酸酶(PG);后者主要包括聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGL)。人們常稱的堿 性果膠酶一般指果膠裂解酶中的聚半乳糖醛酸裂解酶。果膠裂解酶通過反式消去作用裂解果膠聚合體，在C-4位置上斷開糖苷鍵，同時在C-5處消去一個H原子。從而產生一個Δ4:5不飽和鍵。目前對于果膠酶的研究已有大量的文獻報道，其中研究時間較長的酸性果膠酶主要用于果膠組分的提取和果酒果汁的澄清，堿性果膠酶在制漿漂白，棉織物處理工藝中的應用取得了一定進展，特別是在麻類纖維的脫膠上的應用研究日趨增多。原麻是一種被各種膠質粘接在一起的片條狀物，單纖維不易分開，因此在梳理紡紗之前必須對原麻進行脫膠處理。長期以來的脫膠方式主要是化學脫膠，其基本原理是利用原麻中纖維素和膠質成分對堿、無機酸和氧化劑的穩定性不同以去除原麻中的膠質成分。該方法往往導致麻纖維受損，影響麻織物的優良品質，同時消耗大量的化工原料和熱能，造成嚴重的環境污染。因此該工藝不適應于經濟社會的發展。近年來，生物脫膠受到了較多的關注，其主要包括微生物脫膠，酶脫膠和生物-化學聯合脫膠。其中酶脫膠因具有操作靈活性強，便于添加脫膠助劑等優勢而成為研究的重點。日本學者Koki Horkoshi于1972年首次報道了嗜堿細菌可分泌堿性果膠酶，Junwei Cao, T. SaKai, Tohru Kobayashi等也相繼分離篩選到產堿性果膠酶的菌株。我國 從90年代初開始對堿性果膠酶進行了研究，已經報道的產生菌包括歐文氏菌、嗜堿芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、螺孢菌等，但研究工作主要停留在菌種篩選及對酶學性質的研究；在堿性果膠酶的發酵研究方面，大多停留在搖瓶條件優化，小型發酵罐產酶條件的初步優化研究上。劉曦等對高產堿性果膠酶枯草芽孢的產酶條件進行了優化，使酶活力提高到了14. 82U ml/1 (堿性果膠酶高產菌株產酶條件的優化.生物技術，2008，18 ￠) :71-74.)。蔣紅菊等對多粘類芽孢桿菌發酵產堿性果膠酶的培養基及發酵培養條件進行了優化，使酶活達到311UH1L-1 (多粘類芽孢桿菌20185液態發酵產堿性果膠酶發酵條件的研究.中國釀造，2011，235:111-114.)。董云舟等在小型發酵罐中采用溫度控制策略對堿性果膠酶進行發酵優化，使芽孢桿菌WSH03-09產堿性果膠酶的酶活達5. 99U mL—1 (芽孢桿菌發酵產堿性果膠酶溫度控制策略.應用與環境生物學報，2005，11 (3) :359-362.)。劉慧娟等研究了不同溫度(32-41° C)對芽孢桿菌WSHB04-02分批發酵生產堿性果膠酶動力學參數的影響，溫度優化后可使堿性果膠酶的酶活達到53. OU mL—1，生產強度為(芽孢桿菌發酵生產堿性果膠酶的溫度控制策略.過程工程學報，2007,7(4) :786-789.)。中國專利ZL 03131952. I公開了一株產堿性果膠酶的短小芽孢桿菌，液體深層發酵得到堿性果膠酶酶活力為20UH1L-1 ;中國專利ZL 200410065807. X公開了一種通過氧氣在發酵液中的傳遞速率體積溶氧系數(K#)提高堿性果膠酶活力的方法，其酶活力達到了 40U mL-1,但該酶活力與工業化要求還有一段距離。李祖明等對克勞氏芽孢桿菌進行了紫外誘變育種和固態發酵條件優化(高產堿性果膠酶菌株的育種及其發酵條件的研究.工業微生物，2008，38(3) :27-31.);中國專利 ZL 94105708. 9、CN 101096650B、ZL 200410073818.2、CN 101235361A公開了不同菌株固體發酵生產堿性果膠酶的方法，由于酶活力測定方法不一，產酶能力無法直觀比較；同時也因為固體發酵設備要求高、工藝復雜而鮮見其應用于工業生產。ZL 97109044公開了一株嗜堿芽孢桿菌及其苧麻脫膠的方法，但由于脫膠時間長(16-24h)，果膠酶活力低也難于工業化應用。ZL01106844. 2公開了一株堿性果膠酶生產菌CCTCC N0:M200038，并將發酵所得酶液應用于苧麻脫膠，由于其發酵酶活力較低而未能應用于工業化生產。因此通過發酵工藝控制和優化提高堿性果膠酶酶活力和容積生產效率，降低生產成本是技術開發和工程放大的關鍵。其中，PH控制優化在發酵生產中得到了廣泛的應用，其可以有效調控細胞生長和產酶的理化環境，間接反映培養基的C/N和細胞存活情況，是發酵罐控制和優化的關鍵因素。由于發酵前期細胞生長和發酵中后期細胞大量產酶對于理化環境、營養狀況要求存在差異，因此在pH的控制上也應當做出相應調整。在檢索到的相關方法中，關于通過兩段PH控制進行堿性果膠酶生產的方法還未見報道。
發明內容
針對現有技術中，堿性果膠酶活力低，成本高，不適合工業化生產和應用的不足，本發明目的是提供一種利用兩段PH控制發酵生產堿性果膠酶的方法。本發明所述的利用兩段pH控制生產堿性果膠酶的方法，是通過對補料前后pH進行兩段控制提高堿性果膠酶酶活力及其生產效率，具體方法如下(I)種子培養在無菌的條件下，活化斜面菌種枯草芽孢桿菌CCTCC N0:M200038,并接種至50ml種子培養基中進行種子培養，36-37° C搖床震蕩培養7_9h ；(2)初發酵將種子培養液接種至裝有發酵培養基的7. 5L發酵罐,進行發酵培養，發酵罐裝液量3-4L，接種量10%，溫度33-34° C，通氣量2. 5-4. 5L mirT1 ；(3) pH控制I :采用10%磷酸(v/v)和氨水通過在線反饋控制初發酵液pH值，將pH控制在5. 47. O ；(4)補料培養基中的淀粉預處理用中溫淀粉酶對補料培養基中的淀粉進行液化處理，加酶量為32. 5U g—1，液化溫度為55° C，液化時間為30min ；(5)補料發酵初發酵至16h，按初發酵培養基體積量20%補加預處理后的補料培 養基，繼續發酵，發酵溫度為33-34° C，通氣量為2. 5-4. 5L mirT1 ；(6) pH控制II :采用10%磷酸(v/v)和氨水通過在線反饋控制補料后發酵液pH值，將pH控制在4. 9-6. 5 ;發酵周期為36-48h ；(7)粗酶液制備發酵完畢后，將發酵液12000rpm離心lOmin，上清液即為含有堿性果膠酶的粗酶液；種子培養基組成是葡萄糖Ilg ΙΛ酵母粉4，5g ΙΛ蛋白胨4. 5g L-1，NaCl 4. 5gΙΛ K2HPO4IOg ΙΛ pH 8. O ；發酵培養基組成是淀粉20g ΙΛ 麥麩 40g L-1，(NH4)2SO4 I. 5g Γ1, MgSO4 · 7H20Ig L-1 ；補料培養基組成是淀粉122. 5g L—1，麥麩 10. 5g L-1，(NH4)2SO4 IOg L-1，MgSO4 · 7H206. 5g L'上述利用兩段pH控制生產堿性果膠酶的方法中步驟(3)所述初發酵液pH值優選控制在5. 6-6. 8，最優選為6. 2±0. 2。
步驟(6)所述補料后發酵液pH值優選控制在5. 1-6. 3，最優選為5. 7±0. 2。上述方法中涉及的在線參數測定溶氧(DO)、pH、溫度采用電極在線自動控制，DO為相對溶氧水平，即在培養基未接種之前通氣30min，使培養基達到飽和溶氧水平，此時DO標定為100%，飽和亞硫酸鈉溶氧標定為0%。上述方法中涉及的離線參數測定生物量取發酵液ImL (以發酵液離心后上清作為對照)于比色管中加入IM的高氯酸ImL,沸水浴20min后,轉至離心管中IOOOOrpm離心IOmin,取上清ImL定容到IOmL,于紫外分光光度計260nm處測定其吸光值測定吸光值，比照標準曲線計算菌體干重。標準曲線制作方法為稀釋得到濃度梯度菌體，分別測定OD 26(|，并對應稱量菌體干重，以細胞干重為X軸，OD 26(|為Y軸繪制標準曲線。堿性果膠酶(PGL)活性取5mL發酵液，與1200rpm，4° C離心lOmin，取上清用pH 9. 6Gly-Na0H緩沖液稀釋一定倍數后取20 μ I加入2mL O. 2% (w/v)的聚半乳糖醛酸溶液(用 pH 9. 6，含 O. 44mM CaCl2, O. 05mM Gly-NaOH 緩沖液配置)，45° C 反應 15min,用 3mLO. 03M磷酸溶液終止反應，于紫外分光光度計235nm處測定其吸光值。一個標準酶活力單位(IU)定義為單位時間(Imin)使聚半乳糖醛酸裂解產生I μ mo I不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。其中不飽和半乳糖醛酸在波長235nm處的摩爾吸光系數為 4600 (M)0本發明的有益效果本發明方法通過對補料前后pH進行兩段控制明顯提高了堿性果膠酶酶活力及其生產效率；使堿性果膠酶的單位酶活力達到了 743U πιΓ1，最高容積生產效率達到24U(ml · h)-1 (國內外未見報道)。該方法大大縮短了發酵周期，從而提高了發酵罐利用效率，降低了生產成本；該方法操作簡單易行，為工業化生產奠定了堅實的基礎。發酵生產的堿性果膠酶初酶液可用于麻纖維原料的脫膠處理，能有效縮短甚至省去化學脫膠工序，改善麻纖維產品的品質，減少廢液對環境的污染。
圖I為補料分批發酵和兩段pH控制對堿性果膠酶活力的影響。
具體實施例方式實施例I枯草芽孢桿菌CCTCC N0:M200038 (申請人于2000年11月20日保藏于中國典型培養物中心(CCTCC)，相關專利見ZL01106844. 2)經斜面活化，挑起菌苔接種至裝有種子培養基的搖瓶進行培養，培養條件為300ml三角瓶裝液量為50ml，發酵溫度37° C，200rpm震蕩培養8h。以接種量10%接種初發酵培養基，pH控制在5. 6-6.0，溫度33-34° C，通氣量2. 5-4. SLmin^10用中溫淀粉酶對補料培養基中的淀粉進行液化處理，加酶量為32. 5U g_S液化溫度為55° C，液化時間為30min。初發酵至16h，按初發酵培養基體積的20%補加預處理以后的補料培養基，pH控制在5. 1-5. 5，控制溫度33-34° C，，通氣量2. 5-4. 5Lmin^0發酵周期為36-48h。發酵完畢后，將發酵液12000rpm離心lOmin，上清液即為含有堿性果膠酶的粗酶液；經實驗測定，獲得的粗酶液最高堿性果膠酶活力為671U mL'發酵過程如圖I所示。其中培養基配方如下 種子培養基組成是葡萄糖Ilg ΙΛ酵母粉4，5g ΙΛ蛋白胨4. 5g L-1，NaCl 4. 5gΙΛ K2HPO4IOg ΙΛ pH 8. O ；發酵培養基組成是淀粉20g ΙΛ 麥麩 40g L-1，(NH4)2SO4L 5g IAMgSO4 · 7H20 IgL-1 ；補料培養基組成是淀粉122. 5g ΙΛ 麥麩 10. 5g L-1，(NH4)2SO4IOg L-1，MgSO4 · 7Η206· 5g L'實施例2發酵方法、條件除以下變動之外，其余同實施例1，補料前pH控制為6. 0-6. 4，補料后PH控制為5. 5-5. 9。經實驗測定，發酵獲得的粗酶液最高堿性果膠酶活力為743伽1人發酵過程如圖I所示。實施例3發酵方法、條件除以下變動之外，其余同實施例1，補料前pH控制為6. 4-6. 8，補料后PH控制為5. 9-6. 3。經實驗測定，發酵獲得的粗酶液最高堿性果膠酶活力為660U ml'發酵過程如圖I所示。實施例4發酵方法、條件除以下變動之外，其余同實施例1，補料前pH不控制，補料后pH自然。經實驗測定，發酵獲得的粗酶液最高堿性果膠酶活力為531U πιΓ1。發酵過程如圖I所示。與實施例1、2、3相比，本實施例獲得的粗酶液堿性果膠酶酶活力明顯較低。實施例5發酵方法、條件除以下變動之外，其余同實施例1，補料前pH控制為5. 4-5. 8，補料后PH控制為4. 9-5. 3。經實驗測定，發酵獲得的粗酶液最高堿性果膠酶活力為384U ml'實施例6發酵方法、條件除以下變動之外，其余同實施例1，補料前pH控制為6. 6-7. O，補料后PH控制為6. 1-6.5。經實驗測定，發酵獲得的粗酶液最高堿性果膠酶活力為349U ml'
權利要求
1.一種利用兩段pH控制生產堿性果膠酶的方法，其步驟如下 (1)種子培養在無菌的條件下，活化斜面菌種枯草芽孢桿菌CCTCCN0:M200038,并接種至50ml種子培養基中進行種子培養，36-37° C搖床震蕩培養7_9h ； (2)初發酵將種子培養液接種至裝有發酵培養基的7.5L發酵罐，進行發酵培養，發酵罐裝液量3-4L，接種量10%，溫度33-34° C，通氣量2. 5-4. 5L mirT1 ； (3)pH控制I :采用體積濃度為10%的磷酸和氨水通過在線反饋控制初發酵液pH值，將pH控制在5. 4-7. O ； (4)補料培養基中的淀粉預處理用中溫淀粉酶對補料培養基中的淀粉進行液化處理，加酶量為32. 5U g—1，液化溫度為55° C，液化時間為30min ； (5)補料發酵初發酵至16h，按初發酵培養基體積量20%補加預處理后的補料培養基，繼續發酵，發酵溫度為33-34° C，通氣量為2. 5-4. SLmirT1 ； (6)pH控制II:采用體積濃度為10%的磷酸和氨水通過在線反饋控制補料后發酵液pH值，將pH控制在4. 9-6. 5 ;發酵周期為36-48h ； (7)粗酶液制備發酵完畢后，將發酵液12000rpm離心lOmin，上清液即為含有堿性果膠酶的粗酶液； 上述種子培養基組成是葡萄糖Hg L—1，酵母粉4，5g L—1，蛋白胨4. 5g L-1，NaCl 4. 5gΙΛ K2HPO4IOg ΙΛ pH 8. O ； 上述發酵培養基組成是淀粉20g L—1，麥麩40g L—1，(NH4)2SO4L 5g L—1，MgSO4 · TH2Olgr1 ； 上述補料培養基組成是:淀粉 122. 5g L—1，麥麩 10. 5g L-1，(NH4)2SO4IOg LlMgSO4 ·7Η206.5gL、
2.如權利要求I所述利用兩段pH控制生產堿性果膠酶的方法，其特征在于，步驟(3)所述初發酵液PH值控制在5. 6-6. 8。
3.如權利要求2所述利用兩段pH控制生產堿性果膠酶的方法，其特征在于，步驟(3)所述初發酵液PH值控制在6. 2 ± O. 2。
4.如權利要求I所述利用兩段pH控制生產堿性果膠酶的方法，其特征在于，步驟(6)所述補料后發酵液PH值控制在5. 1-6. 3。
5.如權利要求4所述利用兩段pH控制生產堿性果膠酶的方法，其特征在于，步驟(6)所述補料后發酵液PH值控制在5. 7±0. 2。
全文摘要
本發明公開了一種利用兩段pH控制發酵生產堿性果膠酶的方法，是根據細胞在發酵前期分裂生長和發酵中后期大量產酶對于理化環境、營養狀況(pH可直接或間接放映)要求存在差異，通過在線反饋控制pH的方法在補料前后對發酵液進行兩段pH控制，提高了堿性果膠酶酶活力及其生產效率。經實驗檢測，本發明得到了聚半乳糖醛酸裂解酶活力為743Uml-1的堿性果膠酶的發酵粗酶液，最高容積生產效率達到24U(mL·h)-1。本方法生產的堿性果膠酶成本低廉、發酵周期短、設備利用率高、工藝簡單，適于規模化工業生產。
文檔編號C12R1/125GK102660526SQ20121017182
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月30日 優先權日2012年5月30日
發明者曲音波, 李雪芝, 趙建, 鄒謀勇 申請人:山東大學