專利名稱：一株產甘草苷的甘草內生真菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株內生真菌。
背景技術：
甘草為烏拉爾甘草(G. uralensis Fisch),脹果甘草(G. inf late Bat)和光果甘草(G. glabra L)的干燥根和根莖，國家二級保護植物。甘草是一種補益中草藥，具有很多生理活性，如抗癌、抗變態、抑制SARS病毒以及抑制艾滋病毒等特殊功效。其主要成分甘草苷是一種黃酮類成分，具有解痙、抗潰瘍、抑制酪氨酸酶活性、清除氧自由基的功效，還有抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌等作用。實驗研究表明，植物與內生真菌在相互作用的過程中，有內生真菌能產生與植物相同或相似的活性物質，因此從藥用植物中分離到產生活性物質的內生真菌已成為當今學者的研究趨勢。·
發明內容
本發明提供了一株產甘草苷的甘草內生真菌。本發明產甘草苷的甘草內生真菌，它為枝頂抱菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M 2012048，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日；它在PDA固體培養基上培養7d后，菌落直徑為3 5cm，中心凸起，菌落為深綠色，基質為灰綠色，易生深綠色孢子，菌落邊緣整齊呈白色，緊貼培養基，分生孢子聚成繩索狀的菌索，分生孢子梗直立，錐形，直接長在菌絲細胞上，基部附近偶分枝，有隔膜，分生孢子單生，單細胞。本發明產甘草苷的甘草內生真菌，它為枝頂孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4，其ITS序列提交至NCBI網頁，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過所構建系統進化樹，內生真菌RP4的ITS序列與(Acremonium dichromosporum,編號AB540572. I)菌株的相似性都達到了 98%以上，結合形態學觀察結果，確定內生真菌RP4為枝頂抱菌(Acremonium dichromosporum)。本發明產甘草苷的甘草內生真菌，它為枝頂抱菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M 2012048，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本發明利用微生物制藥手段提取分離野生甘草健康植株的內生真菌，以抑菌活性為指標，采用濾紙片法進行抑菌實驗，篩選得到抑菌活性較強的RP4，采用HPLC法為分析甘草內生真菌RP4的發酵液，結果在內生真菌RP4的發酵液中發現含有甘草苷，說明內生真菌RP4為產甘草苷的內生真菌。最后將獲得的RP4菌株通過形態學觀察和18S rDNA序列分析鑒定其種屬。本發明甘草內生真菌RP4為枝頂抱菌(Acremonium dichromosporum),其代謝物具有較好的抑菌活性，同時從其代謝物中發現其含有甘草苷，本發明對采用甘草內生真菌RP4生產甘草苷具有指導意義。
圖I為具體實施方式
一中枝頂抱菌(Acremonium dichromosporum)RP4的菌落形態圖；圖2為具體實 施方式一中枝頂抱菌(Acremonium dichromosporum)RP4的抱子顯微結構圖；圖3為具體實施方式
一中枝頂抱菌(Acremonium dichromosporum) RP4基因組DNA的電泳圖，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RP4 ；圖4為具體實施方式
一中枝頂抱菌(Acremonium dichromosporum) RP4的PCR擴增產物的電泳圖，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RP4 ；圖5為具體實施方式
一中枝頂抱菌(Acremonium dichromosporum)RP4的系統進化樹；圖6為具體實施方式
一中甘草苷對照品的HPLC色譜圖，其中a表示甘草苷；圖7為具體實施方式
一中供試品RP4的HPLC色譜圖，其中a表示甘草苷；圖8為具體實施方式
一中加入對照品后供試品RP4的HPLC色譜圖，其中a表示甘草苷；圖9為具體實施方式
一中空白對照品的HPLC色譜圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式產甘草苷的甘草內生真菌，它為枝頂孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4,已在中國典型培養物保藏中心保藏,保藏編號為CCTCCNo :M2012048，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本實施方式中枝頂抱菌(Acremonium dichromosporum) RP4,它在PDA固體培養基上培養7d后，菌落直徑為3 5cm，中心凸起，菌落為深綠色，基質為灰綠色，易生深綠色孢子，菌落邊緣整齊呈白色，緊貼培養基，分生孢子聚成繩索狀的菌索，分生孢子梗直立，錐形，直接長在菌絲細胞上，基部附近偶分枝，有隔膜，分生孢子單生，單細胞。本實施方式中枝頂孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4,其生長溫度為28°C,生長pH值自然。本實施方式中產甘草苷的甘草內生真菌，它為枝頂孢菌(Acremoniumdichromosporum) RP4,該菌株分離自健康的野生甘草的根莖，采自大慶地區，植株年齡3年，植株健壯，無病蟲害，其樣本現存于黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業實驗室；它按以下步驟進行分離培養選取健康的野生甘草的根莖用自來水沖洗干凈后以無菌濾紙吸干水分，切成Icm小段，然后于無菌超凈臺內將甘草的根莖按下述方法進行表面消毒75%酒精浸泡lmin-2%次氯酸鈉浸泡15min-無菌水沖洗3次；用無菌手術刀將野生甘草的根莖從中間切開，分別置于馬鈴薯固體分離培養基和馬鈴薯液體分離培養基中，于28°C恒溫水浴搖床和恒溫培養箱中，培養3 5d，待實驗材料周圍長出菌體，挑取菌體轉入平板多次劃線分離純化，將純化后的菌株置于斜面固體培養基中，4°C保存備用；其中馬鈴薯固體分離培養基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖、20g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，pH值為7. O 7. 2，121 °C下高壓滅菌30min ；馬鈴薯液體分離培養基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖和余量的蒸餾水組成，pH值為7. 0 7. 2，121°C下高壓滅菌30min ；斜面固體培養基為取5mL馬鈴薯固體分離培養基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。結果從野生甘草的根莖中分離出內生真菌RP4，并且陰性對照中對照平板和對照液體培養基內均無任何菌長出，多次重復均如此，證明所分到的菌是植物內生真菌，而不是表面的附生菌。篩選出的內生真菌RP4根據《真菌分類學》、《真菌鑒定手冊》和《半知菌屬圖解》進行形態學鑒定，其菌株的菌落特征和孢子形態與枝頂孢菌特征極為相近，菌落形態如圖I所示,孢子顯微結構如圖2所示；分子鑒定內生真菌RP4發酵液抽濾得菌絲體用25%乙醇漂洗2次，滅菌的去離 子水沖洗2次，離心去上清液，然后采用SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳后，0. 5mg/L的EB染色，紫外觀察，結果如圖3所示；然后進行目的片段的PCR擴增，PCR產物瓊脂糖電泳后經凝膠純化試劑盒SK1131膠回收純化，成像結果如圖4圖所示。在550bp附近得到一擴增片段，證明已成功從RP4菌株中提取出其基因組DNA。純化產物上海生工生物工程公司測序，測序結果的喊基序列見SEQ ID NO 1 ；測得的ITS序列在在NCBI數據庫中應用BLAST分析進行同源性比較，應用MEGA5. 03軟件中鄰接法(Neighbour-joining methods, NJ)構建系統發育樹(如圖5所示)，確定目標菌株的分類地位。將內生真菌RP4的ITS序列提交至NCBI網頁，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過所構建系統進化樹，內生真菌RP4的ITS序列與(Acremonium dichromosporum,編號AB540572. I)菌株的相似性都達到了 98%以上，結合形態學觀察結果，確定內生真菌RP4為枝頂孢菌(Acremonium dichromosporum)。采用瓊脂塊法測定甘草內生真菌RP4的抑菌活性將已分離到的內生真菌RP4接種于PDA培養基(200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖、20g的瓊脂和IOOOmL的水組成，pH自然，1211滅菌201^11)上，28°C培養4-7天，待培養基內有明顯的顏色變化后，用直徑為6mm的打孔器打取菌餅，放在含各種供試菌的平板上，做3個重復，用PDA培養基做陰性對照，用含鏈霉素和制霉素PDA培養基做陽性對照，制備好的平板在37°C恒溫培養24h后觀察，十字交叉法測量抑菌圈直徑(O)。甘草內生真菌RP4對12種試驗菌的抑菌活性實驗結果見表I。表I
權利要求
1.ー株產甘草苷的甘草內生真菌，其特征在于它為枝頂孢菌(Acremoniumdichromosporum) RP4,已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M2012048，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。
全文摘要
一株產甘草苷的甘草內生真菌，它涉及一株內生真菌。產甘草苷的甘草內生真菌，它為枝頂孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NoM 2012048，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本發明甘草內生真菌RP4為枝頂孢菌(Acremonium dichromosporum)，其代謝物具有較好的抑菌活性，同時從其代謝物中發現其含有甘草苷，本發明對采用甘草內生真菌RP4生產甘草苷具有指導意義。
文檔編號C12R1/645GK102676405SQ20121017118
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者孔德崴, 孫雅北, 白長勝, 譚佳音, 鄭春英 申請人:黑龍江大學