共表達布魯氏菌重組腺病毒及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：共表達布魯氏菌重組腺病毒及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組病毒及這種重組病毒的制備及用途，特別是涉及ー種布魯氏菌重組腺病毒、該重組腺病毒的制備方法，以及這種重組腺病毒在布魯氏菌基因工程疫苗中的用途。
背景技術：
布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella spp.)引起的一種人畜共患傳染病，又稱為馬耳他熱或波狀熱，簡稱布病。世界動物衛生組織(OIE)將其列為B類動物疫病，我國也將其列為ニ類動物疫病，直接影響畜牧業發展，嚴重威脅著人類健康，造成巨大經濟損失(蔡寶祥，2001)。布魯氏菌病因其獨特的致病機制及胞內寄生感染后難以根治的特點，除了大規模撲殺，應用疫苗預防一直是動物布魯氏菌病防控最有效且經濟的手段(Ko et al.，2003)。雖然布魯氏菌疫苗種類較多，也為世界布病的免疫防控發揮了重要作 用，但至今還沒有一種布魯氏菌傳統疫苗在國際上獲得普遍或持久應用，原因是現有的各類型疫苗在保護效果、安全性和制作成本等方面均存在著不同程度相互矛盾而又難以克服的缺點。隨著現代基因工程技術、分子生物學和免疫學的快速發展，新一代布魯氏菌分子疫苗可以兼顧免疫保護性抗原的多價性、表達載體的高效性、疫苗佐劑的靶向性、接種途徑的簡便性、安全有效性等特點，能有效激發機體產生免疫應答和免疫保護效果(Ko et al.，2003)。L7/L12核蛋白(Ribosome protein)是布魯氏菌重要的T細胞優勢抗原,在核糖體亞單位中以四個拷貝的形式存在，能夠誘導細胞免疫應答的產生，在各菌株中具有高度的保守性(Bachrach et al.，1994)。L7/L12蛋白能特異性地刺激感染動物的單核細胞，并上調IFN-Y的表達，從而起到保護作用(Winter et al.，1996)。外膜蛋白BCSP31也是抗布魯氏菌感染重要的抗原分子。Yu等(2007)制備了包含BCSP31的基因疫苗，免疫BALB/c小鼠肌肉或腹腔內產生了 CTL效應和特異性抗體應答，但在整體免疫應答和免疫保護效果上還存在著諸多問題。客服現有疫苗技術的不足，尋找ー種可以長期使用而不產生毒カ返強，培養生產更為容易的布魯氏菌疫苗對保證食品和公共衛生安全，保護人民健康，維護社會穩定，促進養殖業可持續發展等具有重要意義。

發明內容
本發明提供一種共表達布魯氏菌重組腺病毒，以及這種病毒的制備方法和用途。本發明的共表達布魯氏菌重組腺病毒活載體中包括有布魯氏菌L7/L12和BCSP31基因，其序列為SEQN2 1，并以復制缺陷型Ad5腺病毒為載體。本發明的含有布魯氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表達重組腺病毒制備方法是a.從流產布魯氏菌2型CVCC 12株提取細菌總DNA，以此為模板，分別以SEQ2、SEQ3和SEQ4、SEQ5為引物進行聚合酶鏈式反應，得到L7/L12和BCSP31目的蛋白基因；
b.將陽性 pMD-LL 和 pQCXIX Retroviral Vector 質粒，用 Not I 和 BamH I 內切酶分別進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒進行切膠純化，再將回收后的L7/L12目的基因用T4DNA連接酶連入pQCXIX載體的MCS I位點中，同法用Mlu I和Xho I內切酶將BCSP31基因定向克隆于pQCXIX載體的MCS II位點；C.將b步驟得到的帶有外源性目的基因的pQCXIX轉化JM109感受態細胞，獲得陽性質粒 pQC-LL/BP ；e.將pQC-LL/BP和pShuttIe-CMV質粒，用Not I和Xho I內切酶分別進行雙酶切，純化回收L7/L12-IRES-BCSP31目的片段和線性化的pShuttle_CMV載體片段，再將兩種回收產物用T4DNA連接酶進行定向連接，然后轉化E. coli JM109感受態細胞，在含kan抗性的瓊脂平板上挑取單克隆，并于LB液體抗性培養基中增菌后，得到陽性質粒pSh-LL/BP ；
f.將pSh-LL/BP陽性質粒，進行Pme I單酶切后，用こ醇沉淀法收獲線性化的重組腺病毒穿梭載體pSh-LL/BP ；g.將pAdEasy-Ι空腺病毒骨架載體常規CaCl2法轉化BJ5183感受態細胞，得到BJ5183-AD-1 細菌；h.挑選有氨芐抗性的BJ5183-AD-1單克隆菌落，接種于無抗生素LB培養基，37°C，220rpm搖床培養12 14h，制成宿主液；i.將經線性化的重組腺病毒穿梭載體pSh-LL/BP和含有骨架載體pAdEasy-Ι的BJ5183細菌感受態細胞轉移到冰預電轉移杯中進行電轉化處理，得到含有SEQl序列的重組腺病毒陽性質粒pAd-LL/BP，再用陽性pAd-LL/BP轉化DHlOB感受態細胞；j.純化h步驟得到的DHlOB感受態細胞，并進行線性化處理，將線性化的重組腺病毒骨架質粒轉染293AD細胞，得到含有布魯氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表達重組腺病毒 Ad-LL/BP。本發明的共表達布魯氏菌重組腺病毒活載體可在制備布魯氏菌疫苗中的應用。本發明的共表達布魯氏菌重組腺病毒可為動物布魯氏菌提供一種更為安全的分子疫苗或免疫制劑，可刺激機體產生特異性抗體，有效誘導以細胞免疫為主的免疫應答反應。本發明的腺病毒活載體制備的疫苗不存在毒力返強的安全隱患，還具有外源基因容量大，宿主范圍廣，可獲得較高滴度的抗原，并容易濃縮和純化，疫苗免疫方便等優點。相關實驗表明，本發明具有如下優點(I)采用人腺病毒血清5型載體為表達載體，可對目的蛋白進行有效表達，而且有效誘導以細胞免疫為主的免疫應答反應，具有良好的免疫原性；(2)本發明采用第三代腺病毒載體，僅保留了兩端非編碼基因倒置重復序列與包裝信號，不存在毒力返強危險，這也在實踐中得到了證實，如用該載體制備的其它腺病毒疫苗或表達載體已在人和動物上多有應用，實施例3結果也表明本發明所構建的共表達重組腺病毒對小鼠沒有致病性，感染后不出現臨床征狀，沒有毒性反應，安全性良好；(3)本發明實現了布魯氏菌L7/L12和BCSP31雙基因重組腺病毒共表達，并獲得了較高的滴度，滴度可達109 68TCID5(l/mL。(4)腺病毒顆粒相對穩定，容易濃縮和純化(具體見實施例2中PCR穩定性鑒定及重組腺病毒TCID5tl測定)。


圖I為重組腺病毒在293AD細胞上引起的細胞病變；A :轉染后7天的CPE ；B :接度感染后48h的CPE ；C :正常對照細胞。圖2為重組腺病毒Ad-LL/BP的PCR鑒定；M DL2000分子量標準；N 陰性對照；I，2，3和8 :分別為第5、10、15和20代腺病毒L7/L12基因PCR產物；4 7 :分別為第5、10、15和20代腺病毒BCSP31基因PCR產物。圖3為間接免疫熒光法檢測重組腺病毒L7/L12及BCSP31基因表達；A :重組腺病毒Ad-LL/BP感染的293AD細胞；B :空載體Ad-CMV感染的293AD細胞。圖4為Western blot檢測重組腺病毒L7/L12及BCSP31蛋白的表達；M :蛋白質分子量標準；N:空載體Ad-CMV感染的293AD細胞；1和2 :重組腺病毒Ad-LL/BP感染的293AD細胞。圖5為ELISA檢測免疫小鼠血清IgG特異性抗體。 圖6為末次免疫后2周小鼠血清IgGl和IgG2a抗體比較。
具體實施例方式以下結合實施例來進ー步詳細描述本發明。這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。可在不偏離本發明的精神和范圍下對本發明技術方案細節進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍內。本發明主要實驗材料菌株、細胞和載體流產布魯氏菌2型CVCC 12株購自中國獸醫藥品監察所；人胚腎細胞293AD引進自美國Cell Biolabs, Inc.;腺病毒穿梭載體pShuttle_CMV購自美國 Stratagene公司；通用腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι、大腸桿菌BJ5183、DHlOB購自上海杰美基因醫藥科技有限公司；pQCXIX Retroviral Vector 購自 Clontech Laboratories, Inc.；pMD 18-T simple vector、E. coli JM 109和其感受態細胞由寶生物工程公司提供。主要試劑和工具酶Premix Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA Ligase, DL2000分子量標準，Not I、BamH I、Mlu I、Xho I，以及質粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產品；限制性內切酶Pac I、Pme I購自NEB公司；電轉感受態細菌制備試劑盒(GMS60001)購自上海杰美公司；Lipofectamine 2000 為 Invitrogen 產品；DMEM 培養基、無血清培養基0ΡΤΙ-ΜΕΜ、胎牛血清均為Invitrogen GIBCO產品；布魯氏菌陰陽性血清為青島易邦生物工程公司產品；HRP-羊抗兔IgG、FITC-羊抗兔IgG購自北京博奧森生物公司；預染 Blue Plus II Protein Marker 為南京百斯凱公司產品；'Wizard Genomic DNAPurification Kit為Promega產品。生物素化抗小鼠IgGl、IgG2a單抗均為BD公司產品；堿性磷酸酶標記的鏈酶親和素Streptavidin/AP購自Sigma公司；底物PNPP為Amresco公司產品。 實驗動物4 6周齡BALB/c雌性小鼠購自蘭州生物制品研究所。實施例I共表達布魯氏菌重組腺病毒Ad-LL/BP的構建I.布魯氏菌L7/L12和BCSP31目的基因的克隆用Wizard Genomic DNA Purification Kit，從流產布魯氏菌 2 型 CVCC 12 株提取細菌總DNA，以此為模板通過聚合酶鏈式反應，擴增到375bp的L7/L12和990bp的BCSP31目的蛋白基因；擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用TaKaRa公司凝膠回收試劑盒進行DNA目的基因片段回收純化，并分別將L7/L12和BCSP31基因克隆到pMD 18-T載體，獲得的陽性質粒分別命名為pMD-LL和pMD-BP。本實驗所用的引物由寶生物工程公司合成，序列如下
_引物名稱_序列(5’—3’)—酶切位點長度(bp)
L7/L12SAAA GCGGCCQC ATGGCTGATCTCGCNot I
375L7/L12RCG GGATCC TTACTTGAGTTCAACCTTG BamWl RCSP.31S CG ACGCGT ATGAAATTCGGAAGCAMlu I
990
BCSP31R_TT C丁CGAG TTATTTCAGCACGCC__Xho I__
2.重組pQC-LL/BP載體的構建將陽性pMD-LL 和 pQCXIX Retroviral Vector 質粒，用 Not I 和 BamH I 內切酶分別進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒進行切膠純化，將回收后的L7/L12目的基因用T4DNA連接酶連入pQCXIX載體的MCS I位點中；同理用Mlu I和Xho I內切酶將BCSP31基因定向克隆于pQCXIX載體的MCS II位點；轉化JM109感受態細胞，經PCR和酶切鑒定陽性質粒命名為pQC-LL/BP。3.重組腺病毒穿梭載體pSh-LL/BP的構建將pQC-LL/BP和pShuttle-CMV質粒，用Not I和Xho I內切酶分別進行37°C過夜雙酶切，純化回收L7/L12-IRES-BCSP31目的片段和線性化的pShuttle-CMV載體片段。兩種回收產物即可用T4 DNA連接酶進行定向連接，然后轉化E. coliJM109感受態細胞，在含kan抗性的瓊脂平板上挑取單克隆，并于LB液體抗性培養基中增菌后，提取質粒經測序鑒定，其陽性質粒命名為pSh-LL/BP。測序結果見SEQ I :L7/L12-IRES_BCSP31序列長1967bp，和預期大小一致，其中I 375bp為L7/L12序列，后376 977bp為IRES序列，978 1967bp為BCSP31序列。4.同源重組用線性化重組腺病毒穿梭載體的獲得提取pSh-LL/BP陽性質粒，進行Pme I單酶切，酶切總體系為100 μ L，其中pSh-LL/BP 質粒(O. Iyg/μ L) 58 μ L，IOXNE Buffer 10 μ L，Pme I 酶 2 μ L，100XBSA lyL，雙蒸水29 μ L ;經37°C過夜酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳分析，酶切完全后，こ醇沉淀法收獲線性化的重組腺病毒穿梭載體pSh-LL/BP。5.腺病毒骨架載體工程菌BJ5183-AD-1的制備(I)將I μ L pAdEasy-Ι質粒，無菌條件加入到制備好的200 μ L BJ5183感受態細胞中，溫和搖勻，冰浴30min。(2) 42°C水浴熱激90s，快速冰浴3min使之冷卻。(3)加入37で預熱的80(^しLB培養液，37°C，200rpm培養lh，使細胞恢復抗藥性。(4) 4°C, 4000rpm 離心 5min,棄上清使剩余 2OO μ し(5)懸浮后,均勻涂布于含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上,37°C溫箱過夜培養。(6)將菌液抽提質粒，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定為陽性者，命名為BJ5183-AD-1細菌。6.電轉BJ5183-AD-1感受態細胞的制備挑選有氨芐抗性的BJ5183-AD-1單克隆菌落，接種6mL無抗生素LB培養基，37°C，220rpm搖床培養12 14h，制成宿主液(Reagent B)。然后使用上海杰美公司電轉感受態細菌制備試劑盒(GMS60001)進行BJ5183-AD-1電轉感受態細胞的制備。7.電轉化BJ5183-AD-1細菌感受態細胞及在DHlOB菌中擴增(I)將直徑為2. Omm的電轉杯冰浴20min。(2)取Pme I線性化，酚氯仿抽提，乙醇沉淀純化回收的重組穿梭質粒IOuL(Iyg)以及含有骨架載體pAdEasy-Ι的BJ5183細菌感受態細胞40 μ L，轉移到冰預電轉移杯中，混勻，輕輕敲擊臺面，使內容物沉底，避免氣泡，冰上放置IOmin。(3)將電轉杯放在電擊儀上電擊一次電壓2500V，電阻200 Ω，電容25 μ F，時間5ms ο(4)電擊結束，移入到I. 5mL離心管，加入盛有650 μ L 37°C預熱的LB培養液，混勻。 (5)37°C，22Orpm 震蕩培養 40min。(6)分別按10(^し20(^し40(^し涂布卡那霉素抗性1^平板，37で恒溫培養20h。(7)挑選同一平板上比正常菌落小三分之ー的菌落，接種于含50μ g/mL卡那霉素的LB液體培養基里，370C，220rpm震蕩培養15h。(8)抽提質粒，并進行PCR、酶切鑒定，陽性質粒命名為pAd-LL/BP。(9)將陽性pAd-LL/BP轉化DHlOB感受態細胞，獲得大量高質量質粒。8.復制缺陷型重組腺病毒的包裝與傳代(I)用質粒純化試劑盒從由上述(9)步驟得到的陽性pAd-LL/BP轉化的DHlOB菌中純化重組腺病毒質粒，用限制性內切酶Pac I進行陽性重組質粒的線性化，以完全切去ori和卡那霉素抗性基因等質粒構件，并暴露其反轉末端重復序列ITR ;酶切總體系為100 μ L，其中 10XNE Buffer 10 μ L, pAd-LL/BP 質粒(O. I μ g/μ L) 60 μ L，Pac I 酶 3 μ L，100 XBSA I μ L，雙蒸水26 μ L ;37°C過夜酶切后，進行O. 7%的瓊脂糖凝膠電泳，證實酶切完全后，用こ醇沉淀法回收DNA酶切產物。最后用紫外分光光度計測定其0D260和0D280，計算其含量與純度。(2)將線性化的重組腺病毒骨架質粒轉染至293AD細胞，同時將空載穿梭質粒pShuttIe-CMV制備成非重組腺病毒Ad-CMV作為陰性對照。具體操作按LipofectamineTM2000產品說明書進行。(3)轉染細胞培養7 12d，每2 3d可半量換液，逐日觀察細胞，待有較明顯的蝕斑形成或細胞快要脫落時，振蕩細胞瓶將所有細胞一起收集于離心管中，2000rpm，離心8min,吸去上清，細胞沉淀用PBS液重懸(ImL/孔)，然后_70°C /37°C反復凍融3次，收集凍融液于IOmL離心管中，12000rpm離心lOmin，收集上清即為收獲的病毒液，命名為Ad-LL/BP1，置于-70°C凍存備用。(4)將25cm2細胞培養瓶中接毒前24h無抗生素傳代的融合度達90%的293AD細胞，用無血清培養基Opti-MEM輕輕洗滌細胞2次，每次5mL ;吸去細胞中的無血清培養基后，取Ad-LL/BPl病毒液輕輕接于細胞瓶，3mL/25cm2細胞瓶，溫柔晃動使液體鋪滿瓶底，置37V,5% CO2培養箱靜置培養。2h后吸去病毒液，加入IOmL含10% FCS而無抗生素的DMEM完全培養基，37°C，5% CO2培養箱繼續培養并觀察細胞狀態，48 72h后，當有50% CPE出現時，將細胞凍融后收集病毒上清，命名為Ad-LL/BP2，-70°C凍存備用。同樣的方法可獲得更多代次的重組腺病毒液。結果顯示，pAd-LL/BP經Pac I酶切回收后轉染293AD細胞，7d后細胞出現腫脹、變圓、脫落等典型的CPE(圖1A)。將細胞收集、凍融、PBS重懸，收集病毒原液，將其繼續傳代感染3次293AD細胞，均在3 8d出現不同程度CPE，F5代以上病毒的培養細胞均在感染后48h左右出現典型的CPE (圖1B)，而使用對照腺病毒液Ad-CMV感染的對照細胞則沒有CPE出現(圖1C)。表明重組腺病毒Ad-LL/BP包裝成功。實施例2共表達布魯氏菌重組腺病毒Ad-LL/BP的鑒定
I、PCR 鑒定取IOOyL Ad-LL/BP4病毒上清液，加入IOyL蛋白酶K，56°C消化蛋白lh，煮沸IOmin使蛋白酶K失活，12000rpm離心6min，取上清即為病毒DNA模板。進行PCR擴增，反應后，取IOyL PCR產物，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果在第5、10、15和20代重組腺病毒中均擴增到了 375bp的L7/L12和990bp的BCSP31 (如圖2所示)，證明所構建的重組腺病毒具有良好的穩定性。2、間接免疫熒光檢測重組腺病毒的表達 分別取第10代重組腺病毒Ad-LL/BP和對照Ad_CMV，按每孔400吐病毒液于加有蓋玻片的6孔細胞板中感染293AD細胞，2h后吸去病毒液，加入IOmL含10% FCS的DMEM完全培養基，37°C，5% C02培養箱繼續培養I 2d按如下步驟進行間接免疫熒光檢測(I)先吸去6孔板中培養液，PBS洗滌兩次，3min/次；待PBS基本揮發后，-20°C預冷的甲醇固定細胞20min ；PBS洗滌兩次，3min/次。(2)自然干燥，加入O. I % Tritonx 100作用20min，PBS洗三次，3min/次；加入2% BSA封閉IOmin后，吸去封閉液，PBS洗三次，3min/次。(3)加I : 50稀釋的布魯氏菌兔血清，2mL/孔，37°C孵育2h，PBS洗滌3次，3min/次；再加I : 50稀釋的FITC-羊抗兔IgG ニ抗，2mL/孔，室溫避光作用Ih ;PBS洗滌3次后，滴加甘油水溶液封片，熒光顯微鏡下觀察。間接免疫熒光實驗結果顯示，重組腺病毒Ad-LL/BP感染的293AD細胞可產生綠色熒光(圖3A)，而空載體Ad-CMV感染的293AD細胞則不產生綠色熒光(圖3B)，說明轉染細胞表達了目的抗原。3. Western Blot 鑒定將293AD細胞分別感染第10代重組腺病毒Ad-LL/BP和對照Ad_CMV，出現CPE，待細胞脫落超過50%后離心收集細胞，細胞沉淀溶于2XSDS上樣緩沖液中，煮沸、離心后取上清進行12%的SDS-PAGE電泳；然后轉移至硝酸纖維素膜，取出硝酸纖維素膜，剪下預染蛋白Marker，將轉印上蛋白的硝酸纖維素膜進行封閉后，分別與I : 100稀釋的ー抗布魯氏菌陽性兔血清和I : 600稀釋的HRP-羊抗兔IgG ニ抗作用，于DAB底物中顯色，進行蛋白表達分析。結果發現重組腺病毒Ad-LL/BP有兩條大小分別約36. 3KD和13. 8KD的特異性蛋白條帶(如圖4泳道I和2)，與預期大小一致，而對照Ad-CMV無目的蛋白條帶產生，說明構建的重組腺病毒可以共表達目的蛋白，且具有良好的反應原性。4.重組腺病毒TCID5。測定收集200mL第10代以后的Ad-LL/BP感染細胞裂解上清，經CsCl密度梯度離心純化后，用DMEM維持液將CsCl密度梯度離心純化的病毒液從I : 10起作10倍梯度稀釋，然后分別接種于293AD細胞融合度達95 %的96孔培養板，每個稀釋度接種5孔，每孔100 μ L，同時設對照孔。5% CO2 37°C飽和濕度靜置培養3 5d，觀察病變，記錄每個稀釋度出現細胞病變的孔數，按Read-Muenels法，計算病毒TCID5tl (參考《動物病毒學》第二版)。重組腺病毒10倍比稀釋后接種293細胞，培養4d，觀察CPE，結果如下表I :表I重組腺病毒各稀釋度的CPE數

權利要求
1.共表達布魯氏菌重組腺病毒活載體，其特征在于共表達布魯氏菌重組腺病毒活載體中包括有布魯氏菌L7/L12和BCSP31基因，其序列為SEQN2 1，并以復制缺陷型Ad5腺病毒為載體。
2.權利要求I所述的含有布魯氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表達重組腺病毒制備方法，其特征在于a.從流產布魯氏菌2型CVCC 12株提取細菌總DNA，以此為模板，分別以SEQ2、SEQ3和SEQ4、SEQ5為引物進行聚合酶鏈式反應，得到L7/L12和BCSP31目的蛋白基因； b.將陽性pMD-LL 和 pQCXIX Retroviral Vector 質粒,用 Not I 和 BamH I 內切酶分別進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒進行切膠純化，再將回收后的L7/L12目的基因用T4 DNA連接酶連入pQCXIX載體的MCS I位點中，同法用Mlu I和Xho I內切酶將BCSP31基因定向克隆于pQCXIX載體的MCS II位點； c.將b步驟得到的帶有外源性目的基因的pQCXIX轉化JM109感受態細胞，獲得陽性質粒 pQC-LL/BP ； e.將pQC-LL/BP和pShuttle-CMV質粒，用NotI和Xho I內切酶分別進行雙酶切，純化回收L7/L12-IRES-BCSP31目的片段和線性化的pShuttle-CMV載體片段，再將兩種回收產物用T4 DNA連接酶進行定向連接，然后轉化E. coli JM109感受態細胞，在含kan抗性的瓊脂平板上挑取單克隆，并于LB液體抗性培養基中增菌后，得到陽性質粒pSh-LL/BP ； f.將pSh-LL/BP陽性質粒，進行PmeI單酶切后，用乙醇沉淀法收獲線性化的重組腺病毒穿梭載體pSh-LL/BP ； g.將pAdEasy-1空腺病毒骨架載體常規CaCl2法轉化BJ5183感受態細胞，得到BJ5183-AD-1 細菌； h.挑選有氨芐抗性的BJ5183-AD-1單克隆菌落，接種于無抗生素LB培養基，37°C，.220rpm搖床培養12 14h，制成宿主液； i.將經線性化的重組腺病毒穿梭載體pSh-LL/BP和含有骨架載體pAdEasy-1的BJ5183細菌感受態細胞轉移到冰預電轉移杯中進行電轉化處理，得到含有SEQl序列的重組腺病毒陽性質粒pAd-LL/BP，再用陽性pAd-LL/BP轉化DHlOB感受態細胞； j.純化h步驟得到的DHlOB感受態細胞，并進行線性化處理，將線性化的重組腺病毒骨架質粒轉染293AD細胞，得到含有布魯氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表達重組腺病毒Ad-LL/BP。
3.權利要求I所述的共表達布魯氏菌重組腺病毒活載體在制備布魯氏菌疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開一種布魯氏菌重組腺病毒、該重組腺病毒的制備方法，以及這種重組腺病毒在布魯氏菌基因工程疫苗中的用途。本發明的共表達布魯氏菌重組腺病毒活載體中包括有布魯氏菌L7/L12和BCSP31基因，其序列為SEQ№1，并以復制缺陷型Ad5腺病毒為載體。
文檔編號C12N15/861GK102703505SQ20121015694
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月18日 優先權日2012年5月18日
發明者景志忠, 藺國珍, 邱昌慶, 鄭福英 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所