專利名稱：一株固氮紅細菌及其培養方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株產生催化鏈孢紅素和番茄紅素脫氫的類胡蘿卜素C-3，4脫氫酶的固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans) Y6及其培養方法與應用，屬于微生物技術領域。
背景技術：
類胡蘿卜素是ー種多類異戊ニ烯化合物，廣泛存在于微生物、植物、動物體內。類胡蘿卜素包含特殊的長鏈多烯共軛結構，使其具有了特殊的生理活性，包括光吸收、抗氧化、淬滅自由基等。目前類胡蘿卜素生產主要靠植物提取，產量有限，不能滿足需求，微生物發酵生產成為研究熱點。通過在工程菌株中表達不同的類胡蘿卜素合成酶可以產生不同種類的類胡蘿卜素，尋求新的微生物來源可以獲得不同催化特征的類胡蘿卜素合成酶，為不同種類類胡蘿卜素的生產提供新途徑。類胡蘿卜素C-3，4脫氫酶(CrtD)是類胡蘿卜素合成途徑中的ー個脫氫酶，通常催化I-羥基類胡蘿卜素和I’ -羥基類胡蘿卜素進行C-3，4和C-3’，4’脫氫反應。在產氧光合細菌——藍細菌中，有文獻報道CrtD催化鏈孢紅素和番茄紅素進行C-3，4脫氫的反應，但在不產氧光合細菌中尚未發現CrtD具備該催化特性。經檢索，目前國際上沒有固氮紅細菌產類胡蘿卜素C-3，4脫氫酶的文獻報道。
發明內容
本發明針對現有微生物類胡蘿卜素合成酶種類有限，特別是不產氧光合細菌類胡蘿卜素C-3，4脫氫酶催化鏈孢紅素和番茄紅素脫氫研究的空白，提供一株產生催化鏈孢紅素和番茄紅素脫氫的類胡蘿卜素C-3，4脫氫酶的固氮紅細菌(Rhodobacterazotoformans) Y6及其培養方法與應用。發明概述本發明所述的固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans) Y6,具有產類胡蘿卜素C-3，4脫氫酶，可以催化鏈孢紅素和番茄紅素進行C-3，4脫氫反應，生成3，4-ニ脫氫鏈孢紅素和3，4-ニ脫氫番茄紅素的功能。此外本發明還提供該固氮紅細菌菌株的特征、培養方法與應用。發明詳述一株固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans) Y6菌株,2012年5月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6086。上述固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans) Y6的培養方法,步驟如下將固氮紅細菌(Rhodobacterazotoformans) Y6 按 8 12wt% 接種量接種于 RCVBN培養基中，在溫度為25 35°C的條件下恒溫光照靜置培養48 72小吋，即可； 上述RCVBN培養基組分如下
MgSO4 · 7H20 0. 2g/L, CaCl2 0. 056g/L, FeSO4 · 7H20 0. 012g/L, Na2EDTA 0. 02g/L, H3B032. 8X l(T3g/L，MnSO4L 6X l(T3g/L，ZnSO4 · 7H20 2. 4X l(T4g/L，Na2MoO4 · 2H207. 52 X l(T4g/L，Ca (N03) 2 · 3H20 4 X l(T5g/L，生物素 I. 5 X l(T5g/L，尼克酸 I X l(T3g/L，對氨基苯甲酸 I X 10-3g/L，鹽酸硫胺素 I X 10-3g/L，KH2PO4 O. 6g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 9g/L，DL-蘋果酸 4g/L，(NH4)2. SO4 lg/L，pH6.8，115°C滅菌 30 分鐘。根據本發明優選的，所述培養溫度為30°C。本發明固氮紅細菌Y6菌株產生的CrtD能催化鏈孢紅素和番茄紅素進行脫氫反應。上述固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans) Y6在鏈孢紅素或番爺紅素脫氫反應中的應用。上述應用，步驟如下 利用PCR技術以固氣紅細菌(Rhodobacter azotoformans)Y6菌株基因組DNA為模板，采用上游引物 D-F :TGCCATATGATGAGACAGATTGTGCCGAA (SEQ ID NO. 3)和下游引物 D-R :TCGAAGCTTCCTCGATCGCGAAGCAAGGT (SEQ ID NO. 4)，擴增類胡蘿卜素 crtD 基因，將該基因通過表達載體pET-22b在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行表達，收集重組大腸桿菌細胞超聲波破壁制備重組CrtD粗酶液，再利用重組CrtD粗酶液對鏈孢紅素或番茄紅素進行體外脫氫反應，生成3，4- ニ脫氫鏈孢紅素或3，4- ニ脫氫番茄紅素。以上操作步驟、實驗條件及試劑如無特別說明，均采用本領域常規操作和常用試齊 。有益效果本發明所述固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans) Y6中，含有類胡蘿卜素C-3, 4-脫氫酶，該酶能催化鏈孢紅素或番茄紅素進行脫氫反應分別生成3，4- ニ脫氫鏈孢紅素或3，4-ニ脫氫番茄紅素，該特征在不產氧光合細菌中為首次發現，為3，4-ニ脫氫鏈孢紅素或3，4- ニ脫氫番茄紅素的微生物發酵生產提供了新的酶源。
圖I是固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重組CrtD粗酶液催化鏈孢紅素脫氫產物HPLC圖；其中，1、3，4- ニ脫氫鏈孢紅素；2、鏈孢紅素；圖2是固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重組CrtD粗酶液催化番爺紅素脫氫產物HPLC圖；其中，3、3，4-ニ脫氫番茄紅素；4、番茄紅素；圖3是固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重組CrtD粗酶液催化鏈抱紅素脫氫產物3，4- ニ脫氫鏈孢紅素光吸收圖譜；圖4是固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重組CrtD粗酶液催化番爺紅素脫氫產物3，4- ニ脫氫番茄紅素光吸收圖譜；圖5是固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重組CrtD粗酶液催化鏈抱紅素脫氫產物3，4- ニ脫氫鏈孢紅素質譜圖譜；圖6是固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重組CrtD粗酶液催化番爺紅素脫氫產物3，4- ニ脫氫番茄紅素質譜圖譜。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進ー步闡述，但本發明所保護范圍不僅限于此。實施例中所述固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans)Y6, 2012年5月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中科院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC No. 6086。Na2EDTA購自美國Amresco公司；Na2Mo04 · 2H20購自上海膠體化工廠；對氨基苯甲酸購自上海化學試劑采購供應站；DL-蘋果酸購自天津市大茂化學試劑廠；生物素、尼克酸、鹽酸硫胺素購自中國醫藥(集団)上海化學試劑公司；蛋白胨和酵母粉購自英國Oxoid公司。高效液相色譜儀及色譜柱TC-C18均購自美國Agilent公司。實施例I :一株固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans),于山東省濟南市小清河生活污水中分離獲得，具有如下生物學特征(I)形態學特征觀察革蘭氏染色陰性，細胞橢圓形，菌體直徑為O. 6 μ πΓ . 2 μ m ;在光照厭氧、黑暗好氧和黑暗厭氧條件下均可生長。光照厭氧條件下，培養物為棕黃色；光照半厭氧條件下，培養物為紅色。(2)生理生化特征觀察在光照厭氧條件下，能利用半乳糖醇為唯一碳源生長，不能利用酒石酸鉀；在黑暗厭氧和硝酸鉀條件下，能利用果糖或木糖為唯一碳源生長；其他特征詳見表I。表I固氮紅細菌Y6碳源和電子供體利用
權利要求
1.一株固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans) Y6菌株,2012年5月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6086。
2.權利要求I所述固氮紅細菌(Rhodobacterazotoformans) Y6的培養方法,其特征在于，步驟如下 將固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans) Y6按8 12wt%接種量接種于RCVBN培養基中，在溫度為25 35°C的條件下恒溫光照靜置培養48 72小吋，即可； 上述RCVBN培養基組分如下MgSO4 · 7H20 O. 2g/L, CaCl2 O. 056g/L, FeSO4 · 7H20 0. 012g/L, Na2EDTA 0. 02g/L, H3B032. 8X l(T3g/L，MnSO4 I. 6X l(T3g/L，ZnSO4 · 7H20 2. 4X l(T4g/L，Na2MoO4 · 2H20.7.52 X l(T4g/L，Ca (N03) 2 · 3H20 4 X l(T5g/L，生物素 I. 5 X l(T5g/L，尼克酸 I X l(T3g/L，對氨基苯甲酸 I X 10-3g/L，鹽酸硫胺素 I X 10-3g/L，KH2PO4 0. 6g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 9g/L，DL-蘋果酸 4g/L，(NH4)2. SO4 lg/L，pH6.8，115°C滅菌 30 分鐘。
3.如權利要求2所述的固氮紅細菌Y6的培養方法，其特征在于，所述溫度為30°C。
4.權利要求I所述固氮紅細菌(Rhodobacterazotoformans)Y6在鏈孢紅素或番爺紅素脫氫反應中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，步驟如下 利用PCR技術以固氣紅細菌(Rhodobacter azotoformans) Y6菌株基因組DNA為模板，采用上游引物D-F TGCCATATGATGAGACAGATTGTGCCGAA和下游引物D-R TCGAAGCTTCCTCGATCGCGAAGCAAGGT，擴增類胡蘿卜素crtD基因，將該基因通過表達載體pET-22b在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行表達，收集重組大腸桿菌細胞超聲波破壁制備重組CrtD粗酶液，再利用重組CrtD粗酶液對鏈孢紅素或番茄紅素進行體外脫氫反應，生成.3，4- ニ脫氫鏈孢紅素或3，4- ニ脫氫番茄紅素。
全文摘要
本發明涉及一株固氮紅細菌(Rhodobacter azotoformans)Y6及其培養方法與應用，該菌株具有產類胡蘿卜素C-3,4脫氫酶，可以催化鏈孢紅素和番茄紅素進行C-3,4脫氫反應，生成3,4-二脫氫鏈孢紅素和3,4-二脫氫番茄紅素的功能。此外本發明還提供該固氮紅細菌的菌株、特征、培養方法及其類胡蘿卜素C-3,4脫氫酶的催化性質。來源于該菌株的crtD基因在大腸桿菌中重組表達的重組酶能催化鏈孢紅素或番茄紅素脫氫分別生成3,4-二脫氫鏈孢紅素或3,4-二脫氫番茄紅素，為3,4-二脫氫鏈孢紅素和3,4-二脫氫番茄紅素的微生物發酵生產提供了新的酶源。
文檔編號C12R1/01GK102660484SQ20121015675
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月18日 優先權日2012年5月18日
發明者盧麗麗, 張金華, 肖敏, 錢新民 申請人:山東大學