專利名稱：一種木聚糖酶及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于酶的提取、應用技術領域，具體涉及一種木聚糖酶及其應用。
背景技術：
半纖維素占植物干重的35%，是自然界中含量僅次于纖維素的碳水化合物。與纖維素相比，半纖維素結構與組成十分復雜，包括木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖等多種組分。其中木聚糖是細胞中最具代表性的半纖維素，它可以作為再生資源被人們利用。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各種酶相互之間協同完成。廣義的木聚糖酶是指能夠降解半纖維素木聚糖的一組酶的總稱，包括內切-￠-1,4-木聚糖酶(1，4-0 -D-木聚糖酶水解酶，EC. 3. 2. I. 8)、外切-P -1，4-木聚糖酶(1，4-P -D-木聚糖 酶水解酶，EC. 3. 2. 1.92)、P -木糖苷酶(1，4-P-D-木聚糖酶水解酶，EC. 3. 2. I. 37)，另外還包括a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-葡萄糖苷酶、乙酰木聚糖脂酶和苯酚酸脂酶。其中以內切-￠-1,4-木聚糖酶、￠-木糖苷酶最為重要，作用于木聚糖主鏈。狹義上的木聚糖酶僅限于內切-￠-1,4-木聚糖酶。內切-@ -I，4-木聚糖酶作用于木聚糖和長鏈木聚糖，從￠-1,4-木聚糖主鏈的內部切割木糖苷鍵，從而使木聚糖降解為木寡糖，其水解產物主要為木二糖與木二糖以上的寡聚木糖，也有些可以產生少量木糖和阿拉伯糖。自七十年代末，八十年代初開展木聚糖酶基因的研究工作以來，已有上百種來自真菌和細菌的木聚糖酶基因被克隆并在大腸桿菌中表達。Lapidot (Lapidot A, MechalyA, Shoham Y. J. of Biotechnology, 1996, 51:259)等根據一個已知序列的芽孢桿菌木聚糖酶基因，重新設計引物，利用PCR方法克隆起始密碼子ATG以后的結構基因(不帶前導序列)，轉到T-7RNA多聚酶表達載體pET3d上，在IPTG誘導下表達的木聚糖酶高達140U/ml o Jung (Jung KH, PackM Y. Biotechnology Letters, 1993，15 (2) : 115-120)等用枯草芽孢桿菌染色體上的強啟動子替換熱纖維梭菌木聚糖酶基因自身的啟動子，并去掉C末端與酶活無關的一段基因序列，把該基因轉化到枯草芽孢桿菌中表達，胞外酶活可達30U/ml。Ghangas (Ghangas, G S，Hu, Y J, Wilson, D B. J. Bacteriol.，1989，171 (6) : 2963-2969)等將褐色高溫單孢菌的木聚糖酶基因用穿梭質粒轉到淺青紫鏈霉菌中表達，其表達量是在大腸桿菌中表達量的10-20倍，但只有原始菌株表達量的四分之一。Herbers (Herbers K，WiIkeI, Sonnewald U. Biotechnology, 1995, 13:63-66)等將熱纖維梭菌的熱穩定木聚糖酶基因轉到煙草中，產生的木聚糖酶位于煙草的質外體空間，酶的熱穩定性及活性都沒有喪失而且酶易于提純。另一例煙草中表達的是糞堆梭菌的木聚糖酶基因，該基因在煙草花葉病毒35S的啟動子控制下表達,表達的木聚糖酶大部分在培養液的上清液中，一小部分在細胞內，木聚糖酶蛋白的量占可溶性總蛋白的5%。值得一提的還有Whitehead (WhiteheadRT, Hespell B R. FEMS Microbiology Letters, 1990, 66:61-66)的工作，他們使用大腸桿菌一類菌體穿梭載體將棲瘤胃擬桿菌的木聚糖酶基因接合轉移至脆弱擬桿菌和單形擬桿菌中，該基因在這兩種菌中都能表達，粗酶液的比活分別是原始菌株的1400倍和1600倍。華中農業大學的張桂敏等采用不同的基因克隆方法分別從短小芽孢桿菌Bacilluspumilus、真菌 Plectosphaerella cucumerina 和 Verticillium dahlia 克隆到三個木聚糖基因，從土壤微生物DNA中克隆到10個木聚糖基因片段，并分別在畢赤酵母進行了高效表達，研究了重組酶的酶學性質，為木聚糖酶的有效應用奠定了基礎。對半纖維素能進行有效降解的生物包括細菌、絲狀真菌、放線菌、軟體動物、原生動物和昆蟲在內的各種生物。對于不同來源的木聚糖酶，其分子量范圍為8 45kDa，pi范圍為pH3 10。通常細菌可產生兩種木聚糖酶，即低分子量的堿性木聚糖酶和高分子量的酸性木聚糖酶。Wong等(1988)從芽孢桿菌中分離出分子量為24kDa的木聚糖酶，其最適pH為6. 0,最適酶促反應溫度為50 °C。Winterhalter等(1995)從海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)中分離了兩種極端耐熱木聚糖酶，XynA和XynB,他們的分子量分別是120和40kDa，最適pH分別為6. 2和5. 4，在最適pH下，其最適反應溫度分別高達92°C和105°C，為目前已知的對熱最為穩定的木聚糖酶。多年來對真菌木聚糖酶的研究主要集中在里氏木霉(Trichoderma reesei)和綠色木霉(Trichoderma viride)上。以里氏木霉為例，它可以產生主要的木聚糖酶Xyn I和Xyn II，其分子量分別為19和21kDa，最適pH分別為3. 5和 4. 5,但它們在溫度超過60°C條件下均不穩定。Huang等(1991)從康寧木霉(Trichodermakoningii)中分離純化到一種木聚糖酶，SDS-PAGE電泳分子量為21. 5kDa, pi為8. 9 ;Ujiie等(1991)則從T. viride中分離純化到兩種木聚糖酶，其分子量分別為19和20kDa，Pl則在5. 5和9.0。除了木霉外，一些曲霉也能產生木聚糖酶，如Krisana等(2005)從Aspergilluscf. niger BCC14405中分離到一種內切木聚糖酶,其分子量約為21kDa,最適pH為5.0,最適溫度則為55°C。不同來源的木聚糖酶其最適pH和最適溫度不同,應用范圍也有較大差異。
發明內容
本發明的目的是提供一種木聚糖酶及其應用，以彌補現有技術的不足。本發明的木聚糖酶，名稱為XYA6205，其氨基酸序列為SEQ ID NO :2，其編碼核苷酸序列為 SEQ ID NO :1。酶活實驗結果表明，本發明提供的木聚糖酶在pH5. (T9. 0范圍內均有較高的活性，在堿性范圍內依然能保持60%以上活性，其最適pH為5.8 ;最適溫度分析顯示，該酶在200C 70°C范圍內均有活性，其最適溫度為50°C。本發明的木聚糖酶在烘焙中的應用效果較明顯。由于小麥面粉中含有2-3%的阿拉伯木聚糖，其中水溶性阿拉伯木聚糖約占25-30%，水不溶性阿拉伯木聚糖約占70-75%。水溶性的阿拉伯木聚糖對面包品質有積極影響，而非水溶性的卻會產生負作用。木聚糖酶可將水不溶性阿拉伯木聚糖降解為水溶性的阿拉伯木聚糖，從而改善面團中面筋網絡的彈性，增強面團的乳化凝膠作用，使面團的內部氣孔更加均勻細密，增大面包體積。本發明的木聚糖酶運用到面包烘焙中，可使面包體積增大I(T15%。
圖I :本發明從葡萄穗霉基因組上PCR擴增木聚糖酶的電泳圖片，圖2 :本發明的木聚糖酶的蛋白電泳圖片；圖3 :發明的木聚糖酶在不同pH值條件下的酶相對活力曲線；
圖4 :發明的木聚糖酶在不同溫度條件下的酶相對活力曲線。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的木聚糖酶進行詳細描述，如沒有特別提及，是采用本領域的通用方法。對于實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。本發明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Trans5 a ChemicallyCompetent Cell,北京全式金生物技術有限公司);穿梭質粒載體pGm (具有乙酰胺和氨節選擇標記);黑曲霉Gl ;PCR試劑盒、質粒提取試劑盒、限制性內切酶、連接酶、纖維素酶、蛋白電泳試劑盒以及羧甲基纖維素等試劑購自TAKARA、SIGMA或MBI。實施例I、木聚糖酶XYA6205編碼基因的獲得I. I木聚糖酶在葡萄穗霉全基因組上的挖掘 通過對葡萄穗霉(購自中國微生物菌種保管委員會普通微生物中心，CGMCC3. 5365)全基因組進行比較基因組學的研究，挑選出具有木聚糖酶活性的xya6205基因(核苷酸序列為SEQ ID NO: 1)，此基因編碼一個含227個氨基酸的蛋白質XYA6205，具有序列表SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列。用DNAStar軟件預測該蛋白質的理論分子量大小為25. 071千道爾頓，SignaIP分析第1_18位氨基酸為信號肽。XYA6205同來源于 Verticillium dahliae VdLs. 17 的內切木聚糖酶(GenBank 索引號為 EGY14130. I)具有較高同源性，為67%。I. 2重組載體pGm_xya6205的構建I. 2. I提取葡萄穗霉染色體DNA，PCR擴增xya6205將葡萄穗霉孢子接于IOOml液體CMC培養液中，震蕩培養2天，條件為30°C，200rpm。培養好后用六層無菌紗布過濾，而后轉移到預冷_80°C的無菌研缽中，迅速倒入液氮，稍揮發后立即用力研磨至粉末，最后用Fungal DNA kit按操作說明書進行提取。通過分析xya6205基因序列,利用Primer Premier5軟件設計引物,并在引物兩頭加上限制性酶切位點(用DNAMAN軟件分析酶切位點)和保護堿基，引物如下XYA6205-F:CCATTACGTAAGAATGTTCTTCTCCCAAGTCATCASnaBIXYA6205-R:CTAGTCTAGATCAACCACCATGCCGCATCCTTXbaI取提取的葡萄穗霉染色體DNA1. 5ul，并向其中依次加入上下游引物2. Oul、KODbuffer 5ul、dNTP 4ul、Me2+2ul以及重蒸水34ul，最后加入KOD酶Iul，渦旋振蕩混勻后開始PCR。最后用試劑盒回收PCR產物，并進行瓊脂糖凝膠電泳初步查看結果。(圖I)I. 2. 2 酶切 pGm，與 xya6205 連接取PCR產物基因40ul，并向其中依次加入Green buffer 6ul、SnaBI酶2ul、XbaI酶2ul及重蒸水IOul，上下緩慢吹吸混勻，37°C水浴I小時條件進行酶切。同時將pGm以同樣的操作酶切。酶切結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，并用試劑盒切膠回收酶切產物。取酶切后的xya6205基因IOul及酶切pGm2ul，加入I. 5ulT4連接酶及連接酶緩沖液，利用PCR儀在16°C條件下連接12小時，最終完成重組質粒的制備。I. 2. 3重組質粒在大腸桿菌中的轉化與提取
取50ul冰浴上融化的感受態細胞(Trans5 a Chemically Competent Cell,北京全式金生物技術有限公司)，加入15ul連接液，在冰浴上繼續放置30分鐘；42°C金屬浴中熱激45秒，然后快速將管轉移到冰浴中2分鐘，該過程不要搖動離心管；向離心管中加入普通LB培養液1ml，混勻后置于37°C，200rpm培養一小時，使細菌復蘇；低速(4000rpm)離心5分鐘，去SOOul上清，余下的立即用槍輕輕吹吸混勻，均勻涂布到含氨芐的LB平板上，直至完全吸收；37°C倒置培養16小時。挑取五個單個菌落做PCR驗證，對照組用空質粒，同時將挑取模板的牙簽放入加氨芐的4mlLB培養液中，37°C，200rpm，培養24小時。將驗證正確的LB管用質粒提取試劑盒提取質粒(同時再次質粒PCR驗證)。將該重組質粒PGm-Xya6205寄送到博尚生物技術有限公司進行雙向測序。測 序結果用DNAMAN軟件與正確序列進行比對，發現沒有發生突變，完全正確，重組質粒pGm-xya6205構建成功。實施例2、xya6205在黑曲霉Gl中的表達2. I 重組菌 Gl-pGm_xya6205 的構建重蒸水(4ml)吹洗下新長出的黑曲霉Gl孢子，轉移至IOOml的液體菌絲培養基中，30°C，200rpm搖床培養16小時；六層無菌紗布過濾培養好的Gl菌液，并用Solution A沖洗紗布及菌絲，將氮源充分洗掉；過濾后菌絲轉移到裝有40mlSOlutiOn A、0. 6g纖維素裂解酶(SIGMA)的無菌三角瓶中(30°C，160rpm預培養半小時左右)，震蕩使菌絲分散，繼續搖床培養，300C，160rpm, I小時后轉速降為80rpm，繼續培養I小時到I. 5小時(鏡檢看消化情況確定培養時間)；用二層過濾紙將消化好的菌液過濾到50ml無菌離心管中,低速(4000rpm)離心5分鐘后去上清，用20ml Solution B懸浮，繼續低速離心，去上清，重復兩次,最后一次留IOOul ;向15ml離心管中依次加入IOOul菌液、12ul重組質粒、12. 5ul Solution C,在冰上靜置20分鐘；加入Iml Solution C、2ml Solution B，輕搖混勻；將55°C的amds上層培養基(乙酰胺為唯一氮源)8ml倒入離心管中，上下倒置混勻，立即分倒到3個amds下層培養基(乙酰胺為唯一氮源)平板上，靜置凝固后，30°C培養箱中培養5-7天。挑取轉化子到二次驗證板上，同時挑取陽性對照和陰性對照，30°C繼續培養，若能繼續生長則為陽性轉化子，進行菌絲PCR驗證。驗證正確的轉化子轉接到斜面上保存，同時保存孢子懸浮液，用甘油管儲存于-80°C冰箱中。菌絲PCR驗證體系如下從邊緣用牙簽挑取新長出的菌絲，在裝有20ul稀釋液(PhirccR植物組織直接PCR試劑)的小PCR管中混勻，作為模板；向另一 PCR管中依次加入緩沖液IOul、重蒸水10ul、上下引物Iul、模板0. 5ul及Phire 熱啟動II DNA聚合酶(Finnzymes) 0. 4ul ;按照適當的PCR條件做40個循環,完成后進行瓊脂糖凝膠電泳查看。搖瓶表達和蛋白電泳從斜面上用無菌竹簽挑取孢子，接種到25ml的產酶培養基三角瓶中，搖床培養，30°C,200rpm ;三天后取發酵液，IOOOOrpm離心8:30min,取上清30ul,加入IOul 4倍上樣buffer (已煮沸),水浴煮沸5min ； IOOOOrpm離心Imin待用。配置SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，待凝固后點樣，加入緩沖液，接通電源，首先80v電壓跑膠，待蛋白樣跑出凝縮膠后改電壓為120v，直至其跑到最底線；考馬斯亮藍染色30min ;脫色液脫色3次,每次30min,用清水浸泡過夜(圖2)。
實施例3本發明XYA6205木聚糖酶的酶學特性的研究3. I木聚糖酶的酶活測定采用DNS法，具體操作如下3. I. I 配置 DNS 試劑稱取 DNS6. 3g，加入 2mol/L 的 NaOH溶液 262ml，再加到 500ml含有185g酒石酸鉀鈉的熱溶液中，再加5g結晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000ml,忙存于棕色瓶中，避光放置一周后使用。3. I. 2葡萄糖標準曲線的繪制取11只4ml離心管，按下表加入溶液
權利要求
1.一種木聚糖酶，其氨基酸序列為SEQ ID N0:2。
2.編碼權利要求I所述的木聚糖酶的核苷酸，其序列為SEQID N0:1。
3.如權利要求I所述的木聚糖酶，其酶活最適pH值為5.8
4.如權利要求I所述的木聚糖酶，其酶活最適最適溫度為50°C。
5.權利要求I所述的木聚糖酶在烘焙中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種木聚糖酶，名稱為XYA6205，其氨基酸序列為SEQ ID NO2，其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO1。本發明的木聚糖酶在烘焙中的應用效果較明顯。由于小麥面粉中含有2-3%的阿拉伯木聚糖，其中水溶性阿拉伯木聚糖約占25-30%，水不溶性阿拉伯木聚糖約占70-75%。水溶性的阿拉伯木聚糖對面包品質有積極影響，而非水溶性的卻會產生負作用。木聚糖酶可將水不溶性阿拉伯木聚糖降解為水溶性的阿拉伯木聚糖，從而改善面團中面筋網絡的彈性，增強面團的乳化凝膠作用，使面團的內部氣孔更加均勻細密，增大面包體積。本發明的木聚糖酶運用到面包烘焙中，可使面包體積增大10~15%。
文檔編號C12N9/42GK102732496SQ20121015646
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者王華明, 王紅霞 申請人:天津工業生物技術研究所