專利名稱：Prv、pcv-2、ppv多重pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種試劑盒，尤其是ー種PRV、PCV-2、PPV多重PCR檢測試劑盒。
背景技術：
隨著規模化養豬的不斷發展，當前豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV-2)、豬細小病毒(PPV)造成的繁殖障礙較為嚴重，并常常發生混合感染，給養豬業造成了巨大的經濟損失。PRV、PCV-2和PPV的混合感染，僅根據臨床癥狀較難進行鑒別診斷，而且PRV基因缺失疫苗的大規模應用，使野毒感染和疫苗接種的區分十分必要。目前，主要的檢測方式有病毒分離鑒定、瓊脂擴散試驗、微量血清中和試驗、ELISA、PCR方法，而針對PRV基因缺失疫苗有gE-ELISA以區分野毒感染和疫苗接種。然而常規的診斷方法很難將此癥狀相似的疾病同時加以區別，而且常規的病原學和血清學檢測方法，又存在操作繁雜、費時費力、敏感性低等不足。
發明內容
本發明的目的是提供ー種PRV、PCV-2、PPV多重PCR檢測試劑盒，它可以同時檢測出豬偽狂犬病病毒、豬圓環病毒及豬細小病毒，特異性和敏感性高、檢測時間短、檢測成本低。本發明是這樣實現的PRV、PCV-2、PPV多重PCR檢測試劑盒，它包括40 μ L等體積混合的PRV引物、PCV-2引物及PPV引物，PRV引物、PCV-2引物及PPV引物的濃度均為10 μ Μ，緩沖液600 μ L，陰性對照20 μ L，PCR酶250 μ L，超純水170yL，50yL的MarkerDL2000以及陽性對照20 μ L ；PRV引物的目的基因為gE，PRV引物的上游引物的序列號為PRV-1 :5’ - CCCACGCACGAGGACTAC - 3’，PRV引物的下游引物的序列號為PRV-2 :5’-GGGCGGGACATCAACAGG - 3’，片段大小為288bp ；PCV-2引物的目的基因為0RF2，PCV-2弓丨物的上游引物序列號為PCV-1:5’ - GGATTGTATGGCGGGAGG - 3’、PCV-2引物的下游引物的序列號為PCV-2 :5’ - AGGAGGCGTTACCGAAGGAG - 3’，片段大小為419bp ；PPV引物的目的基因為VP2，PPV引物的上游引物的序列號為PPV-I :5’ -GGGAGGGCTTGGTTAGAATC-3’、PPV引物的下游引物的序列號為PPV-2 :5’ - TTGTTTGCCATGAGTGAGTT - 3’，片段大小為681bp。緩沖液為50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。陰性對照為超純水。陽性對照為重組pMD18-T-HBV-S質粒。PCR 酶的組成包括 IOmM 的 Tris_HcL、50mM 的 KCL、1. 5mM 的 MgCL2 以及 O. 05U 的Poymerase/uL。PRV引物的上游引物為PRV-1，下游引物為PRV-2、PCV-2弓丨物及PPV引物 為了驗證本發明的效果進行了如下實驗
I材料與方法
I.I病毒和細菌PRV閩-I株、PCV-2、PPV強毒株7909、CFSV石門系強毒株Fl 14、PRRSV美洲株CH-Ia株均由山東濱州畜牧獸醫研究院贈送；PRV CgE基因缺失Bartha-k61株)購自山東綠都生物科技有限公司；大腸桿菌為本研究室保存。1.2主要試劑
Goldview、Tris 緩沖液、EDTA、DL2000、7 DNA Polymerase (5U/^L)及相應IOXTai7Buffer^dNTP等購自寶生物(大連)工程有限公司；TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。1.3引物設計
根據GenBank中登錄的(PRV) ) gE、PCV-2 0RF2和PPV VP2基因組序列，應用DNAStar軟件，設計了 3對引物，用于擴增PRV、PCV-2、PPV目的基因片段，引物的序列(見表I )。
權利要求
1.一種PRV、PCV-2、PPV多重PCR檢測試劑盒，其特征在于它包括40 ii L等體積混合的PRV引物、PCV-2弓丨物及PPV引物，PRV引物、PCV-2弓丨物及PPV弓丨物的濃度均為10 y M，緩沖液600 u L，陰性對照20 u L，PCR酶250 u L，超純水170 y L，50 y L的 Marker DL2000以及陽性對照20 y L ;PRV引物的目的基因為gE，PRV引物的上游引物的序列號為PRV-I :5’ - CCCACGCACGAGGACTAC - 3’，PRV引物的下游引物的序列號為PRV-2 5’ - GGGCGGGACATCAACAGG - 3’，片段大小為 288bp ；PCV-2 引物的目的基因為 ORF2，PCV_2引物的上游引物序列號為PCV-1 :5 ’ - GGATTGTATGGCGGGAGG - 3 ’、PCV-2引物的下游引物的序列號為PCV-2 :5’ - AGGAGGCGTTACCGAAGGAG - 3’，片段大小為419bp ；PPV引物的目的基因為VP2，PPV引物的上游引物的序列號為PPV-I :5’ - GGGAGGGCTTGGTTAGAATC - 3’、PPV引物的下游引物的序列號為PPV-2 :5 ’ - TTGTTTGCCATGAGTGAGTT - 3 ’，片段大小為681bp。
2.根據權利要求I所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR檢測試劑盒，其特征在于緩沖液為50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。
3.根據權利要求I所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR檢測試劑盒，其特征在于陰性對照為超純水。
4.根據權利要求I所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR檢測試劑盒，其特征在于陽性對照為重組PMD18-T-HBV-S質粒。
5.根據權利要求I所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR檢測試劑盒，其特征在于PCR酶的組成包括 IOmM 的 Tris-HcL、50mM 的 KCL、1. 5mM 的 MgCL2 以及 0. 05U 的 Poymerase/uL。
全文摘要
本發明公開了一種PRV、PCV-2、PPV多重PCR檢測試劑盒，它包括40μL等體積混合的PRV引物、PCV-2引物及PPV引物，PRV引物、PCV-2引物及PPV引物的濃度均為10μM，緩沖液600μL，陰性對照20μL，PCR酶250μL，超純水170μL，50μL的MarkerDL2000以及陽性對照20μL。本發明針對PRV、PCV-2和PPV存在于同一反應體系的情況設計了3種引物，采用這3種引物制成的試劑盒，使用該試劑盒能同時檢測出豬偽狂犬病病毒、豬圓環病毒及豬細小病毒，而且特異性和敏感性高、檢測時間短、檢測成本低，為豬傳染病的防制提供科學依據。
文檔編號C12R1/93GK102676698SQ201210153439
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者余波, 冉懋韜, 徐景峨, 李干洲, 王璇, 艾玉萍, 譚詩文 申請人:貴州省畜牧獸醫研究所