專利名稱：乳腺癌分子標志物miR-195-5p的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤診斷領域，具體來說涉及一種乳腺癌分子標志物miR-195-5p，其可應用于乳腺癌高危人群的篩選、乳腺癌的鑒定、乳腺癌治療狀況的監測和乳腺癌預后的監測等領域。
背景技術：
microRNA (miRNA)是近年來的研究熱點,它是一種廣泛存在于真核生物中的單鏈小分子RNA，不具編碼功能，但它能夠結合于基因序列的側翼區域阻遏或抑制靶mRNA的翻譯，具有高度的保守性、時序性和組織特異性。2008年Mitchell等首先發現許多miRNA穩定存在于血漿中，其中miR-141的水平可作為前列腺癌診斷標志物。隨后的研究又發現了 結腸癌診斷標志物miR-92a和肝損傷監控標志物miR-122。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近50年來發病率在全球呈上升趨勢，其發病率占全身各種惡性腫瘤的7-10%，且發病人群呈年輕化趨勢。目前，乳腺癌的臨床診斷方式主要有以下幾種乳腺鑰靶攝片、紅外乳腺掃描、活組織病理檢查、雌激素和孕激素受體測定及超聲顯像。乳腺鑰靶攝片具有簡單、方便、無創傷及費用低等特點，是乳腺癌檢查的首選方法之一，它通過顯示腫塊的大小、數目、位置、密度、邊緣、形態、有無鈣化以及鈣化的形態、大小、數目、分步以及周圍的暈環、皮膚改變等提供定位及定性征象并判斷病變的性質；其局限性是(1)當患者的乳腺腺體豐富時與病變重疊，不能顯示病變的全貌，甚至出現假陰性，(2)對于接近胸壁和致密性乳腺的小癌灶容易漏診，(3)有時不能提供明確的定性診斷。紅外乳腺掃描操作簡便、直觀、無損傷，與鑰靶攝片有互補的作用，能直接顯示乳腺血管的走行分步及管徑改變，但因其不能顯示腫瘤的內部結構及周圍組織所以診斷符合率很低，對乳腺上部及近胸壁的癌灶易于漏診。活組織病理檢查因其創傷性、復雜性不能作為初篩的手段，但是它是乳腺癌確診的金標準，一般與影像學技術連用，在對患者進行治療前均應獲得病理學診斷依據。人乳腺癌組織中，有60 70%的組織存在雌激素受體(ER)和/或孕激素受體(PR)，其存在狀況與診斷、治療及判斷預后有關，衛生部發布的乳腺癌診斷標準中所要求的乳腺癌病理報告至少應包括ER、PR和HER-2 (人類表皮生長因子受體_2)；其局限性較大主要表現在(1)技術和設備要求高，標本量大，故對測定非切除標本或腫塊較小的早期乳腺癌難以滿足需要，(2)受體對溫熱極不穩定，標本必需新鮮，儲存運輸不便，
(3)腫瘤組織中受體分布不均勻，邊緣部位含量較中央部位高，故需混合取材。超聲成像對一些缺乏典型征象的實性良惡性腫塊有較高的誤診率，且不能發現5_以下的腫塊。近年來的研究表明，乳腺癌和miRNA密切相關，它們可能參與腫瘤的生成，所以對腫瘤的治療也可能有相應的作用。與乳腺癌相關的miRNA種類較多且作用不一，已有研究表明在乳腺癌患者中上調的miRNA包括miR-26a，miR-29b, miR-375, miR-92, mir-183,miR-197 等，下調的 miRNA 包括 miR-145，miR-497，miR-339-5p，miR-22，miR-125b 等。雖然已在該領域進行了一些研究，但是現有的miRNA標志物的準確性、靈敏性方面均有不足，在臨床和研究中仍然存在尋找更加準確和靈敏的乳腺癌miRNA標志物的需求。
發明內容
本發明提供了一種新的乳腺癌相關的miRNA作為乳腺癌的分子標志物，該miRNA為 miR-195-5p，其序列為 5’ -UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3’ (SEQ IDNO :1)。發明人發現，miR-195_5p在乳腺癌患者血清中的含量相比在正常人血清中的含量升高，而在患者接受手術后，其血清中的miR-195-5p含量回落到正常水平，由此可見，增加的miR-195-5p與腫瘤的存在密切相關。在上述發現的基礎上，本發明提供了 miR-195_5p在制備診斷乳腺癌的診斷試劑中的用途。具體地，所述診斷試劑通過檢測被試者血清中miR-195_5p的含量，并與正常水平相比較來診斷乳腺癌。在一個特定的實施方案中，使用定量PCR的方法來檢測被試者血清中 miR-195-5p 含量。本發明還提供了一種診斷乳腺癌的診斷試劑盒，其包括(I)血清總RNA提取試劑，(2) RNA 加 polyA 試劑，(3) RT-PCR 試劑，(4)定量 PCR 試劑。其中，定量PCR試劑中包括乳腺癌分子標志物miR-195_5p的特異性正向引物，優選地，其序列為 5’ -GGGTAGCAGCACA-3’ (SEQ IDNO :7)。在一個特定的實施方案中，所述血清總RNA提取試劑中包括序列為5，-CAACCTCCTAGAAAGA-3’ (SEQ ID NO :2)的 External Control-1 ;所述 RNA 加 polyA 試劑中包括序列為 5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ ID NO :3)的 External Control-2 ;所述RT-PCR 試劑中包括序列為 SCCAGTGGTATCAACGCACTCCTTITITITITITITITITITITITITITITVN-3’ (SEQ ID NO :4)的RT-Primer (其中，V為A或C或G，N為A或T或C或G);所述定量PCR 試劑中包括序列分別為 5，-CTCACACGACTCACGACAC-3，(SEQ IDNO :5)和 5，-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’(SEQ IDNO :6)的通用反向引物UPM-short和UPM-long。使用本發明的乳腺癌分子標志物miR-195_5p診斷乳腺癌具有操作簡單，取材方便，安全無創傷，高特異性，高靈敏性以及易于大量篩查的特點。
具體實施例方式I 血清中總RNA的提取抽取5名乳腺癌患者術前及術后7天各2ml血液，同時抽取5名正常人血液各2ml作為正常對照，凝血后進行離心，最后取上層血清Iml置于I. 5ml的RNase/DNase-free離心管中。使用RNA提取試劑盒(北京曠博生物技術有限公司)自血清中提取總RNA，每250 ii I 血清中加入 Iii I (20nM)序列為 5’ -CAACCTCCTAGAAAGA-3’ (SEQ ID NO 2)的External Control-I (上海生工生物工程技術有限公司合成)來監控血清中RNA的提取質量。提取的總RNA使用Thermo NanoDrop 2000c測定濃度。2.三步法定量檢測血清中的miRNA
(I)加 polyA 尾:i.在無RNA酶的PCR管(Axygen公司，200 ii I)中配制加polyA尾的反應液，體系為 20 ii I。每 20 ii I 體系中加入 I U I (20nM)序列為 5’ -TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ IDNO 3)的External Control-2 (上海生工生物工程技術有限公司合成)來監控miRNA的加
尾及反轉錄質量。
權利要求
1.一種乳腺癌分子標志物miR-195-5p，其序列如SEQ ID NO :1所示。
2.權利要求I所述乳腺癌分子標志物miR-195-5p在制備診斷乳腺癌的診斷試劑中的用途。
3.權利要求2所述用途，其中，所述診斷試劑通過檢測被試者血清中miR-195-5p的含量，并與正常水平相比較來診斷乳腺癌。
4.權利要求3所述用途，其中，使用定量PCR的方法來檢測被試者血清中miR-195-5p含量。
5.一種診斷乳腺癌的診斷試劑盒，其包括 (1)血清總RNA提取試劑，(2)RNAjJP PolyA 試劑，(3)RT-PCR 試劑， (4)定量PCR試劑； 其中，定量PCR試劑中包括權利要求I所述乳腺癌分子標志物miR-195-5p的特異性正向引物。
6.權利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述血清總RNA提取試劑中包括序列為SEQIDNO :2 的 External Control-1。
7.權利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述RNA加polyA試劑中包括序列為SEQID NO:3 的 External Control-2。
8.權利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述RT-PCR試劑中包括序列為SEQID NO :4的RT-Primer0
9.權利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述定量PCR試劑中包括序列分別為SEQID NO5和6的通用反向引物UPM-short和UPM-long。
10.權利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述乳腺癌分子標志物miR-195-5p的特異性正向引物的序列如SEQ ID NO 7所示。
全文摘要
本發明提供了一種乳腺癌分子標志物miR-195-5p及其在制備診斷乳腺癌的診斷試劑中的用途。miR-195-5p在乳腺癌患者血清中的含量比在正常人血清中的含量升高，而在患者接受手術后，其血清中的miR-195-5p含量回落到正常水平。本發明還提供了一種診斷乳腺癌的診斷試劑盒。使用本發明的乳腺癌分子標志物miR-195-5p診斷乳腺癌具有操作簡單，取材方便，安全無創傷，高特異性，高靈敏性以及易于大量篩查的特點。
文檔編號C12Q1/68GK102676522SQ20121015310
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月16日 優先權日2012年5月16日
發明者李同恩, 李啟靖, 栗世鈾 申請人:北京曠博生物技術有限公司