專利名稱：來自辣椒疫霉菌的果膠裂解酶pcpel18及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種果膠裂解酶及其編碼基因與應用，特別涉及來自辣椒疫霉菌的果膠裂解酶及其編碼基因與應用。
背景技術：
辣椒疫病(Pepper Phytophthora Blight)是在世界范圍內普遍發生的一種毀滅性病害。引起該病的病原為Phytophthora capsici Leonian,屬卵菌門(Oomycetes),霜霉目(Peronosporales),腐霉科(Pythiaceae),疫霉屬(Phytophthora)。病原菌通常以菌絲體、厚垣孢子及卵孢子在病株殘體、土壤內越冬，也可以在其它寄主植物上越冬，成為第二年初侵染源。條件適宜時，越冬后的病原隨灌水、氣流等傳到寄主各部位，引起發病，進行再侵染。在發病季節，一般病株率為20%左右，嚴重的達到80%以上。近年來，隨著辣椒在各 主產區的連茬種植，病害有逐漸加重的趨勢，危害較為顯著。該病原菌除危害辣椒外，也可侵染番茄、茄子、黃瓜、西瓜、南瓜等作物，對生產威脅極大。植物病原卵菌與寄主互作過程中分泌多種重要的細胞壁降解酶或致病酶，其中比較重要的三類細胞壁降解酶為以下三種(I)聚半乳糖醒酸酶(polygalacturonase, PG)能分解半乳糖醒酸中的a_l, 4糖苷鍵。(2)果膠甲基酯酶(pectin methylesterase, PME)可促使果膠脫酯,生成果膠酸。(3)果膠裂解酶(pectate lyase, PL)由P消去反應裂解a_l，4糖苷鍵，在反應產物的非還原端殘基C-4和C-5之間產生一個雙鍵。可裂解高度酯化的果膠，能迅速降低粘度。上述三類細胞壁降解酶均屬于果膠酶。果膠酶是指能夠分解果膠物質的多種酶的總稱。果膠物質在自然界中分布非常廣泛，它是植物體中一類復雜的，膠體性質糖類，是天然的高分子化合物，分子量約50000-300000。它是植物細胞壁的重要組成成分，主要存在于細胞壁的中間層，初生壁也有一部分，而次生壁則很少有果膠物質存在。在世界范圍內，植物病原卵菌易導致多種植物的病害，給農業生產造成了嚴重的損失。辣椒疫霉病是一種重要的卵菌病害，能導致多種植物發生嚴重病害，深入開展辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)果膠裂解酶基因分離及祀標基因編碼的蛋白制作和功能分析具重要的實踐意義，可以實現對于植物病原卵菌所導致的多種植物病害的防治與研究。而且，果膠裂解酶可用于食品加工，如在果汁和酒的生產中，果膠裂解酶可用于增加果汁的產量，便于加壓和過濾，而且可以提高果汁和酒的透明度。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種果膠裂解酶。本發明所提供的果膠裂解酶，名稱為PCPEL18，來源于辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici) SD33,是如下a)或b)或c)的蛋白質a)由序列表中序列2第23-261位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第23-261位所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有果膠裂解酶活性的由a)衍生的蛋白質。其中，序列表中序列2由261個氨基酸殘基組成，第1-22位氨基酸組成信號肽。a)所述的蛋白質是果膠裂解酶的成熟蛋白，b)所述的蛋白質是果膠裂解酶的前體蛋白。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標簽。表I標簽的序列
權利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白質 a)由序列表中序列2第23-261位所示的氨基酸序列組成的蛋白質； b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第23-261位所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有果膠裂解酶活性的由a)衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求I所述蛋白的核酸分子。
3.根據權利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子為如下I)或2)或3)或4)所示的基因 1)其編碼序列是序列表中序列I的第67-786位核苷酸的DNA分子； 2)其編碼序列是序列表中序列I的第1-786位核苷酸的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求I所述蛋白的DNA分子; 4)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼權利要求I所述蛋白的DNA分子。
4.下述I)-4)中的任一種生物材料 1)含有權利要求2或3所述核酸分子的表達盒； 2)含有權利要求2或3所述核酸分子的重組表達載體； 3)含有權利要求2或3所述核酸分子的重組微生物； 4)含有權利要求2或3所述核酸分子的轉基因細胞系。
5.制備權利要求I所述蛋白質的方法，包括將權利要求I所述的蛋白質的編碼基因在生物細胞中進行表達得到權利要求I所述蛋白質的步驟；所述生物細胞為微生物細胞、植物細胞或非人動物細胞。
6.制備表達權利要求I所述蛋白質的重組微生物的方法，包括將權利要求I所述的蛋白質的編碼基因導入宿主微生物細胞，得到表達權利要求I所述蛋白質的重組微生物的步驟。
7.權利要求I所述的蛋白質在作為果膠裂解酶中的應用。
8.權利要求2或3所述的核酸分子或權利要求4所述的生物材料在制備果膠裂解酶中的應用。
9.權利要求I所述的蛋白質在降解植物細胞壁中的應用。
10.權利要求I所述的蛋白質在降解果膠中的應用。
全文摘要
本發明公開了來自辣椒疫霉菌的果膠裂解酶PCPEL18及其編碼基因與應用。本發明所提供的果膠裂解酶PCPEL18，是如下a)或b)或c)的蛋白質a)由序列表中序列2第23-261位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第23-261位所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有果膠裂解酶活性的由a)衍生的蛋白質。果膠裂解酶PCPEL18具有較高的酶活性，其比活力達24±0.2U/mg蛋白，可用于食品加工，如在果汁和酒的生產中。
文檔編號C12N15/63GK102676486SQ201210140039
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月8日 優先權日2012年5月8日
發明者張修國 申請人:山東農業大學