專利名稱：一種微生物油脂的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物油脂的生產方法,特別涉及一種利用酵母Trichosporondermatis與Trichosporn coremiiforme發酵木質纖維素水解液生產微生物油脂的方法。
背景技術：
微生物油脂，又稱單細胞油脂(Single Cell Oil，SCO)，是指由微生物在一定條件下合成并儲存在菌體內的甘油脂，其脂肪酸組成與一般的植物油脂相似，主要是ci6、C18系脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞麻酸等。某些微生物如細菌、酵母、霉菌、微藻能夠利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源積累大量油脂，如果油脂積累量能超過細胞干重的20%,即稱為產油微生物(Oleaginous microorganisms)。近二十年來，具有保健作用的功能性油脂日益受到人們的青睞，因此有關微生物油脂的探索主要集中在獲取經濟價值高的功能性油脂，如Y-亞麻酸(GLA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。與此同時，隨著化石資源日益枯竭，石油價格不斷上漲；大量使用化石燃料引起的環境污染問題，對生物柴油等可再生能源的需求逐年遞增。生物柴油，即長鏈脂肪酸單酯，是由各種油脂經轉酯反應而得。傳統的生物柴油原料以植物油脂、餐飲或工業廢油脂為主，但植物油脂成本很高，且植物生長周期長，占地面積大，易受季節、氣候影響；而餐飲或工業廢油脂的數量有限，不能滿足對可再生能源日益增長的需求，因此限制了生物柴油的大規模生產與應用。微生物油脂具有與植物油脂相似的脂肪酸組成，故被認為是生產生物柴油的良好原料。最近美國國家可再生能源實驗室(NREL)的報道特別指出，微生物油脂發酵可作為生物柴油產業和生物經濟的重要研究方向。產油微生物種類繁多、且具有油脂含量高、碳源利用廣等特點，因此，微生物油脂的研究與開發已引起眾多學者的關注。現有的微生物油脂發酵中使用的培養基主要由市售的葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等配置的合成培養基，成本較高，高昂的培養基成本限制了微生物油脂的大規模生產，因此，探索可利用于微生物油脂生產的廉價原料具有重要意義。木質纖維素是地球上最豐富的可再生資源，其主要成分為纖維素、半纖維素和木質素。我國是一個農業大國，各種農業廢棄物，如玉米芯、農作物秸桿、蔗渣等數量巨大。過去，這部分木質纖維素資源經常被廢棄或低值化利用，如農作物秸桿經焚燒后用于農田堆月巴，但焚燒過程中產生的黑煙會污染環境。利用玉米芯、農作物秸桿或蔗渣等木質纖維素資源來生產微生物油脂可大大降低微生物油脂的生產成本，但在木質纖維素的稀酸水解以及酶法水解前用稀酸預處理的過程中，會產生許多抑制微生物生長代謝的物質，如有機酸、醛類化合物和醇類化合物等。這些物質降低了水解液中還原糖的可發酵性，并抑制微生物細胞積累油脂。然而于大多數油脂微生物而言，油脂產率很低，并不能滿足微生物油脂工業化生產的需求。當前，文獻報道的可利用木質纖維素水解液發酵產油脂的僅有Trichosporon fermentans、Cryptococcuscurvatus、Yarrowia Iipolytica 等幾種。
因此，獲得能夠利用廣譜碳源且在含抑制劑的木質纖維素水解液中高效積累油脂的菌株或菌株組合是實現廉價生產微生物油脂的關鍵。
發明內容
本發明的目的是提供一種發酵過程簡單、成本低廉，油脂得率系數高的微生物油脂的生產方法。本發明的微生物油脂的生產方法，其特征在于，包括以下步驟(a)油脂酵母的馴化將酵母菌株接種到馴化培養基中，25 35°C培養，逐漸增加馴化培養基中木質纖維素水解液的比例，待馴化培養基中木質纖維素水解液的比例為100%時，繼續培養10 15天，得到油脂酵母，所述的馴化培養基包括10 30%的木質纖維素水解液和余量的發酵培養基，PH5. 0 8. 0，所述的發酵培養基包括木糖60g/L、蛋白胨I. 8g/L、酵母粉0. 5g/L，余量為水；(b)發酵以木質纖維素水解液為原料，調節其pH值為5. 0 8. 0，再將油脂酵母接入到木質纖維素水解液中，22 35°C振動培養2 10天，得到發酵液；(c)提取生物油脂收集發酵液中的菌體，干燥得到干菌體，將干菌體進一步破碎后得到細胞破碎液，再加入有機溶劑萃取微生物油脂，然后再蒸餾去除有機溶劑，得到微生物油脂。所述的步驟(a)中的酵母菌株優選為Trichosporon dermatis CCIC 32903或 Trichosporn coremiiforme CCIC 1256。 Trichosporon dermatis CCIC 32903 和Trichosporn coremiiforme CCIC1256都購自中國工業微生物菌種保藏中心,在該保藏中心的編號分別為CCIC 32903和CCIC1256。所述的步驟(a)中的逐漸增加馴化培養基中木質纖維素水解液的比例，優選是按每天5 %的量逐漸增加木質纖維素水解液在馴化培養基中的比例。所述的步驟(b)中的將油脂酵母接入木質纖維素水解液中優選是將油脂酵母接到發酵培養基中進行活化，24小時后再以4 10%的接種量接入木質纖維素水解液中。所述的步驟(C)中的將干菌體進一步破碎優選為按每克干菌體加入IOmL濃度為
I.0 I. 5mol/L HC1，于 90 100°C處理 20 50min。所述的步驟(C)中加入有機溶劑萃取微生物油脂，優選，有機溶劑為氯仿和甲醇按體積比I 2 I I. 5的混合溶液，其加入量為細胞破碎液體積的I 3倍，再收集氯仿層，減壓蒸餾去除氯仿得到微生物油脂。所述的木質纖維素水解液是由木質纖維素原料經常規酸水解或酶水解制得，其總糖濃度優選為30 100g/L。所述的木質纖維素原料優選為玉米芯、水稻秸桿、小麥秸桿、玉米秸桿、甘蔗渣、棉花桿以及其他草本植物中一種或數種。本發明的有益效果是本發明通過對酵母進行馴化得到油脂酵母，該馴化方法操作簡單，馴化后所得到的油脂酵母在木質纖維素水解液中的油脂得率系數為13 20%，比馴化處理前提高20% 30%以上。本發明方法，無需對木質纖維素酶水解液進行脫毒等處理，僅需對木質纖維素酸水解液進行簡單預處理，且木質纖維素水解液中無需添加任何氮源物質與微量元、素，接種酵母菌株之后，可以高效的利用不同糖類物質以及木質纖維素水解液發酵得到微生物油脂，發酵過程簡單，成本低廉。
具體實施例方式
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例I :將玉米芯粉碎至20目，按照玉米芯與稀硫酸(濃度為2wt% )的固液比為Ig IOmL的比例加入稀硫酸，于125°C下水解I. 5h，過濾，用氫氧化鈣把水解液pH調至
7.0，過濾，得到玉米芯稀酸水解液，總糖濃度為40g/L。將玉米芯稀酸水解液和發酵培養基(木糖60g/L，蛋白胨I. 8g/L，酵母粉O. 5g/L，余量為水)按體積比10 : 90混合，配制成馴化培養基。以Trichosporn coremiiformeCCIC 1256為出發菌株，接種到馴化培養基中，用乙酸調節pH5. 0，30°C培養。按每天5%的量逐漸增加玉米芯稀酸水解液在馴化培養基中的比例，直到馴化培養基中玉米芯稀酸水解液的比例為100%，繼續培養10天，得到馴化后的油脂酵母，其在玉米芯稀酸水解液中的油脂得率系數為20%，然后保存。在斜面上挑取3環上述馴化后的油脂酵母接種到50mL發酵培養基(木糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，余量為水)中進行活化，24小時后以4%的接種量轉接到50mL玉米芯稀酸水解液中，于25°C、160r/min搖瓶振蕩培養10天，停止發酵，得到發酵液；將發酵液于4000r/min離心IOmin,收集菌體,用水洗漆后于105°C干燥至恒重,得干菌體20. 5g/L0按每克干菌體加入IOmL I. Omol/L HCl,于100°C水浴20min ;冷卻后再加入體積比為2 I的氯仿和甲醇混合溶液(30mL)進行萃取，收集氯仿層，用旋轉蒸發儀減壓去除有機溶劑，得到微生物油脂，其油脂含量為41.1%，油脂產率8. 4g/L。實施例2水稻秸桿的酶水解液的制備I)酸預處理將水稻秸桿粉碎至20目，按照水稻秸桿與稀硫酸(濃度為2wt% )固液比為Ig 8mL的比例加入稀硫酸，于130°C下水解3h。2)堿預處理將酸預處理后的水解液過濾收集固體、水洗后，按照固液比為Ig : 6ml的比例加入NaOH溶液(濃度為I. 5wt% ),于100°C、160r/min下處理2h。3)酶解將經過酸、堿預處理過后的水稻秸桿水解液過濾收集固體、水洗、干燥，按照20FPU纖維素酶(Sigam-Aldrich公司)/克纖維素和60IU β -葡萄糖苷酶(Novozyme) /克纖維素的加入量加入兩種酶,于50°C、180r/min下酶解3. 5天,得到水稻稻桿酶水解液，總糖濃度為100g/L，其pH值為5. O。將水稻秸桿酶水解液和發酵培養基(木糖60g/L，蛋白胨I. 8g/L，酵母粉0. 5g/L，余量為水)按照30 : 70的比例混合,配制成馴化培養基。以Trichosporon dermatis CCIC32903為出發菌株，接種到馴化培養基中，用NaOH溶液(濃度為I. 5wt% )調節pH8. 0，35°C培養。按每天5 %的量逐漸增加水稻秸桿酶水解液在馴化培養基中的比例，直到馴化培養基中水稻秸桿酶水解液的比例為100%，繼續培養15天，得到馴化后的油脂酵母，其在水稻秸桿酶水解液中的油脂得率系數為13%。
用NaOH溶液(濃度為I. 5wt % )調節水稻秸桿酶水解液pH8. 0，在斜面上挑取3環上述馴化后的油脂酵母接種到50mL發酵培養基(木糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉IOg/L，余量為水)中進行活化，24小時后以10%的接種量轉接到50mL水稻秸桿酶水解液中，于35°C、160r/min搖瓶振蕩培養9天，停止發酵，得到發酵液；將發酵液于4000r/min離心IOmin,收集菌體,用水洗漆后于105°C干燥至恒重,得干菌體50. lg/L。按每克干菌體加入IOmL I. 5mol/LHCl,于90°C水浴50min ;冷卻后加入體積比為I I. 5的氯仿和甲醇混合溶液(20mL)進行萃取，收集氯仿層，用旋轉蒸發儀減壓去除有機溶劑，得到微生物油脂，其油脂含量為45. 8%，油脂產率22. 95g/L。實施例3按實例2對水稻秸桿進行酶水解，得到水稻秸桿酶水解液，總糖濃度為100g/L，其pH值為5. 0，加水稀釋成總糖濃度為50g/L稻秸桿酶水解液。將水稻秸桿酶水解液和發酵培養基(木糖60g/L，蛋白胨I. 8g/L，酵母粉0. 5g/L，余量為水)按照15 : 85的比例混合,配制成馴化培養基。以Trichosporon dermatis CCIC32903為出發菌株，接種到馴化培養基中，用NaOH溶液(濃度為I. 5wt% )調節pH6. 5，25°C培養。按每天5 %的量逐漸增加水稻秸桿酶水解液在馴化培養基中的比例，直到馴化培養基中水稻秸桿酶水解液的比例為100%，繼續培養12天，得到馴化后的油脂酵母，其在水稻秸桿酶水解液中的油脂得率系數為14. 5%。用NaOH溶液(濃度為I. 5wt % )調節水稻秸桿酶水解液pH6. 0，在斜面上挑取3環上述馴化后的油脂酵母接種到50mL發酵培養基(木糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉IOg/L，余量為水)中進行活化，24小時后以7. 5%的接種量轉接到50mL水稻秸桿酶水解液中，于30°C、160r/min搖瓶振蕩培養9天，停止發酵，得到發酵液；將發酵液于4000r/min離心IOmin,收集菌體，用水洗滌后于105°C干燥至恒重，得干菌體25. 7g/L。按每克干菌體加入IOmL I. 5mol/LHCl,于90°C水浴50min ;冷卻后加入體積比為I I. 5的氯仿和甲醇混合溶液(IOmL)進行萃取，收集氯仿層，用旋轉蒸發儀減壓去除有機溶劑，得到微生物油脂，其油脂含量為46. 2%，油脂產率11. 9g/L。實施例4本實施例與實施例I的區別在于所選木質纖維素原料分別為水稻秸桿、甘蔗渣、玉米秸桿、小麥秸桿，按照實施例I的方法進行酸水解，其稀酸水解液的總糖濃度分別35g/L，42g/L，38g/L，32g/L。以 T. coremiiforme CCIC 1256 為出發菌株，按照實施例 I 的方法進行馴化、發酵、提取生物油脂。水稻秸桿、甘蔗渣、玉米秸桿、小麥秸桿稀酸水解液中，發酵的條件分別為接種量10 %，溫度22°C，初始pH值5. 0，發酵10天；接種量5 %，溫度25 V，初始PH值7. 0，發酵8天；接種量7. 5%，溫度30°C，初始pH值7. 5，發酵6天；接種量5%，溫度35°C，初始pH值8. 0，發酵9天，馴化后的油脂酵母的油脂產率分別7. 5g/L，8. 5g/L，7. 9g/L, 7. 2g/L。實施例5本實施例與實施例4的區別在于所用菌株為Trichosporon dermatis CCIC32903,水稻稻桿、甘鹿洛、玉米稻桿、小麥稻桿稀酸水解液中，發酵的條件分別為接種量10 %，溫度22°C，初始pH值6. 5，發酵2天；接種量5 %，溫度25°C，初始pH值7. 0，發酵7天；接種量7. 5 %，溫度28 V，初始pH值7. 2，發酵6天；接種量5 %，溫度32°C，初始pH值、8. O，發酵9天，其余的與實施例3相同。馴化后的油脂酵母在水稻秸桿、甘蔗渣、玉米秸桿、小麥秸桿稀酸水解液中的油脂產率分別3. 4g/L，7. lg/L，6. 5g/L，6. lg/L。實施例6本實施例與實施例2的區別在于所選木質纖維素原料為玉米芯、甘蔗渣、玉米秸桿、小麥秸桿。按照實施例2的方法進行酶水解，加水稀釋成糖濃度分別85g/L，72g/L，78g/L，82g/L酶水解液。以T. dermatis CCIC 32903為出發菌株，按照實施例2的方法進行馴化、發酵、提取生物油脂，玉米芯、甘蔗渣、玉米秸桿、小麥秸桿酶水解液中，馴化后的油脂酵母的油脂產率分別 8. 5g/L，7. 7g/L，8. 2g/L，8. 3g/L。實施例7本實施例與實施例6的區別在于所用菌株為Trichosporn coremiiforme CCIC 1256，其余與實施例6基本相同。馴化后的油脂酵母在玉米芯、甘蔗渣、玉米秸桿、小麥秸桿稀酸水解液中的油脂得率分別8. lg/L, 7. 8g/L，7. 9g/L，8. 2g/L。
權利要求
1.一種微生物油脂的生產方法，其特征在于，包括以下步驟 (a)油脂酵母的馴化將酵母菌株接種到馴化培養基中，25 35°C培養，逐漸增加馴化培養基中木質纖維素水解液的比例，待馴化培養基中木質纖維素水解液的比例為100 %時，繼續培養10 15天，得到油脂酵母，所述的馴化培養基包括10 30%的木質纖維素水解液和余量的發酵培養基，pH5. 0 8. 0，所述的發酵培養基包括木糖60g/L、蛋白胨I. 8g/L、酵母粉0. 5g/L，余量為水； (b)發酵以木質纖維素水解液為原料，調節其pH值為5.0 8. 0，再將油脂酵母接入到木質纖維素水解液中，22 35°C振動培養2 10天，得到發酵液； (c)提取生物油脂收集發酵液中的菌體，干燥得到干菌體，將干菌體進一步破碎后得到細胞破碎液，再加入有機溶劑萃取微生物油脂，然后再蒸餾去除有機溶劑，得到微生物油脂。
2.根據權利要求I所述的微生物油脂的生產方法，其特征在于，所述的步驟(a)中的酵母菌株為 Trichosporon dermatis CCIC 32903 或Trichosporn coremiiforme CCIC 1256。
3.根據權利要求I所述的微生物油脂的生產方法，其特征在于，所述的步驟(a)中的逐漸增加馴化培養基中木質纖維素水解液的比例，是按每天5 %的量逐漸增加木質纖維素水解液在馴化培養基中的比例。
4.根據權利要求I所述的微生物油脂的生產方法，其特征在于，所述的步驟(b)中的將油脂酵母接入木質纖維素水解液中是將油脂酵母接到發酵培養基中進行活化，24小時后再以4 10%的接種量接入木質纖維素水解液中。
5.根據權利要求I所述的微生物油脂的生產方法，其特征在于，所述的步驟(c)中的將干菌體進一步破碎為按每克干菌體加入IOmL濃度為I. 0 I. 5mol/L HCl，于90 100°C處理20 50min。
6.根據權利要求I所述的微生物油脂的生產方法，其特征在于，所述的步驟(c)中加入有機溶劑萃取微生物油脂，所述的有機溶劑為氯仿和甲醇按體積比I 2 I I. 5的混合溶液，其加入量為細胞破碎液體積的I 3倍，再收集氯仿層，減壓蒸餾去除氯仿得到微生物油脂。
7.根據權利要求I所述的微生物油脂的生產方法，其特征在于，所述的木質纖維素水解液是由木質纖維素原料經常規酸水解或酶水解制得，其總糖濃度為30 100g/L。
8.根據權利要求7所述的微生物油脂的生產方法，其特征在于，所述的木質纖維素原料為玉米芯、水稻秸桿、小麥秸桿、玉米秸桿、甘蔗渣、棉花桿以及其他草本植物中一種或數種。
全文摘要
本發明公開了一種微生物油脂的生產方法。本發明通過對酵母進行馴化得到油脂酵母，該馴化方法操作簡單，馴化后所得到的油脂酵母在木質纖維素水解液中的油脂得率系數為13～20％，比馴化處理前提高20％～30％以上，將馴化后的油脂酵母接種到木質纖維素水解液發酵，然后收集發酵液中的菌體，破碎菌體，用有機溶劑萃取，然后去掉有機溶劑得到微生物油脂。本發明方法，無需對木質纖維素酶水解液進行脫毒等處理，僅需對木質纖維素酸水解液進行簡單預處理，且木質纖維素水解液中無需添加任何氮源物質與微量元素，接種酵母菌株之后，可以高效的利用不同糖類物質以及木質纖維素水解液發酵得到微生物油脂，發酵過程簡單，成本低廉。
文檔編號C12R1/645GK102634549SQ201210132659
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者張海榮, 熊蓮, 陳新德, 陳雪芳, 黃超 申請人:中國科學院廣州能源研究所