專利名稱：基于溶血素基因的病原鰻利斯頓氏菌的SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種魚類病原細菌的檢測方法，特別是一種基于溶血素基因的病原鰻利斯頓氏菌的SYBR Green I實時定量PCR檢測方法。
背景技術：
鰻利斯頓氏菌是水產養殖動物中常見且重要的病原菌，該菌于1985年由MacDonell和Colwell等提議由弧菌屬(Vibrio Pacini 1954)轉入利斯頓氏菌屬{Li stone I la MacDonell and Colwell 1986)。該菌呈世界范圍分布，且宿主范圍廣泛，早在18 19世紀在意大利就造成了野生鰻鱺的毀滅性死亡，能引起虹鱒、大麻哈魚、真鯛、香鱒、牙鲆、大菱鲆、半滑舌鰨、大西洋鮭、太平洋鮭、紅點鮭、硬頭鱒、香魚、螄魚、鰈魚、鱈魚、 鮐魚等多種魚類、蝦蟹類及貝類等水產動物發生相應的“弧菌病”，嚴重制約了水產養殖業的發展。該菌傳統的檢驗方法包括形態學檢測、生理生化特征檢測等，這些檢測手段不僅エ作量大，而且耗時長，已遠遠不能滿足水產養殖生產上的診斷要求。因此選擇合適的分子靶標，研究開發靈敏度高、特異性強的病原鰻利斯頓氏菌簡便、快速檢測方法已十分重要，在水產養殖動物處于帶菌狀態或大規模爆發細菌性疾病之前能進行準確的檢測，這是傳統方法無法比擬的。目前溶血素被認為是鰻利斯頓氏菌重要的毒力因子，同時異種之間的hly基因核苷酸序列相似性較低，具設計PCR引物的保守區域，是弧菌科種間鑒定的良好分子靶標，hly基因可在種的水平上檢測鰻利斯頓氏菌。SYBR Green I是ー種結合于雙鏈DNA小溝中的結合染料，與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強，且其熒光強度的増加與雙鏈DNA的數量成正比。在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的増加與PCR產物的増加完全同歩。本發明以hly基因為靶基因，建立了 SYBRGreen I實時定量PCR檢測鰻利斯頓氏菌的方法，為鰻利斯頓氏菌引起的疾病的快速診斷、分子流行病學調查及水環境病原菌監測等奠定良好的基礎。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供ー種方法更為合理、可操作性強的基于溶血素基因的病原鰻利斯頓氏菌的SYBR Green I實時定量PCR檢測方法。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種基于溶血素基因的病原鰻利斯頓氏菌的SYBR Green I實時定量PCR檢測方法，其特點是，其步驟如下
(I)特異性引物設計從GenBank上獲得鰻利斯頓氏菌及其他弧菌的溶血素基因的DNA序列，采用DNA Star軟件進行同源性分析，確定在鰻利斯頓氏菌菌株內保守、其他弧菌間特異的片段，利用生物軟件Primer 5.0對該保守片段設計鰻利斯頓氏菌的特異性檢測引物為
va-hly-F 為 5，-TGC GCT ATA TTG TCG ATT TCA GTT-3'；
va-hly-R 為 5，-GCA CCC GTT GTA TCA TCA TCT AAG-3'；
(2)標準質粒的構建首先擴增病原鰻利斯頓氏菌anguiI larum BHl)溶血素基因，PCR反應條件為94°C預變性3min，接94°C變性lmin、58°C復性lmin、72°C延伸lmin、30個循環，然后72°C溫育7min ;在60 y L反應體系中含有雙蒸水13. 4uL,10 X PCR 緩沖液 2 ii L，25 mM MgCl2 I. 6u L,4X dNTP 混合物 0. 4 y L，引物各 0. 2 u L, 5U/ u LTaq DNA聚合酶0. 2 y L，模板DNA 2uL ；PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后用柱式DNA膠回收試劑盒將陽性PCR產物進行膠回收、純化，將回收純化的溶血素基因的PCR產物，利用PMD18T載體進行連接，連接完畢后將連接產物轉入大腸桿菌DH5 a感受態細胞，涂布含有100 u g/mL氨芐青霉素的LB平板進行藍白斑篩選，隨機挑取6個白色克隆進行菌液PCR鑒定，以確證為陽性克隆；取2個陽性克隆用柱式質粒小量抽提試劑盒提取質粒；用核酸蛋 白分析儀測量質粒濃度，根據阿佛加德羅常數換算出每U L質粒中的DNA的拷貝數，作為標準陽性樣本；
(3)SYBRGreen I實時定量PCR的反應體系20iiL反應體系包括雙蒸水8. 6 y L，SYBRGreen I Hotstar Fluo-PCR mix 10 y L,正反向引物各0. 2 y L, I y L標準陽性質粒或待測樣本；
(4)SYBR Green I 實時定量 PCR 的反應程序94°C 4 min ；94°C 30 s，60°C 30s, 72 °C30s,進行45個循環；PCR完成后，利用Bio-Rad iQ5 Optical System Software軟件進行數據分析，包括查看擴增曲線、Ct值、熔解曲線、Tm值；
(5)標準曲線的建立鰻利斯頓氏菌PMD18-溶血素基因重組質粒按10倍稀釋法稀釋成3. OX IO8 3.0 X 101，共8個濃度梯度，按上述SYBR Green I實時定量PCR的反應體系和反應程序在實時熒光定量PCR儀上進行擴增；反應結束后，根據得到的各個濃度梯度的循環閾值C t采用計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線；得出細菌拷貝數與Ct值的線性方程為
Ct= 2.086Log concentration+25. 306
在對樣品進行檢測時，根據其Ct值和線性方程獲得該樣品DNA拷貝數；
(6)樣品檢測取被檢魚肝臟或肌肉組織，進行研磨后用水煮法提取模板DNA;按上述SYBR Green I實時定量PCR的反應體系和反應程序在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴增，其中陰性對照采用去離子水，陽性對照采用鰻利斯頓氏菌PMD18-溶血素基因重組標準質粒的DNA ;反應結束后，將DNA樣本的循環閾值C t與標準曲線對照，得到DNA樣本中的溶血素基因片段拷貝濃度，據此得到被檢魚肝臟或肌肉組織中鰻利斯頓氏菌的DNA拷貝濃度。本發明所述的病原鰻利斯頓氏菌angui I larum BHl)已經在公開文獻《半滑舌鰨病原鰻利斯頓氏菌表型及分子特征研究》中所公開(菌株BHl )，上述公開文獻發表于《海洋學報》，2009，31 (5):112-121。菌株BHl的DNA序列長度及Genebank登錄號見下表
權利要求
1.一種基于溶血素基因的病原鰻利斯頓氏菌的SYBR Green I實時定量PCR檢測方法，其特征在于，其步驟如下 (1)特異性引物設計從GenBank上獲得鰻利斯頓氏菌及其他弧菌的溶血素基因的DNA序列，采用DNA Star軟件進行同源性分析，確定在鰻利斯頓氏菌菌株內保守、其他弧菌間特異的片段，利用生物軟件Primer 5.0對該保守片段設計鰻利斯頓氏菌的特異性檢測引物為va-hly-F 為 5，-TGC GCT ATA TTG TCG ATT TCA GTT-3，；va-hly-R 為 5，-GCA CCC GTT GTA TCA TCA TCT AAG-3’ ； (2)標準質粒的構建首先擴增病原鰻利斯頓氏菌BHIangui I Iarum BHl)溶血素基因，PCR反應條件為94°C預變性3min，接94°C變性lmin、58°C復性lmin、72°C延伸lmin、30個循環，然后72°C溫育7min ;在60 y L反應體系中含有雙蒸水13. 4yL， 10 X PCR 緩沖液 2 ii L，25 mM MgCl2 I. 6u L,4X dNTP 混合物 0. 4 y L，引物各 0. 2 u L, 5U/ u LTaq DNA聚合酶0. 2 y L，模板DNA 2uL ；PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后用柱式DNA膠回收試劑盒將陽性PCR產物進行膠回收、純化，將回收純化的溶血素基因的PCR產物，利用PMD18T載體進行連接，連接完畢后將連接產物轉入大腸桿菌DH5 a感受態細胞，涂布含有100 u g/mL氨芐青霉素的LB平板進行藍白斑篩選，隨機挑取6個白色克隆進行菌液PCR鑒定，以確證為陽性克隆；取2個陽性克隆用柱式質粒小量抽提試劑盒提取質粒；用核酸蛋白分析儀測量質粒濃度，根據阿佛加德羅常數換算出每U L質粒中的DNA的拷貝數，作為標準陽性樣本； (3)SYBRGreen I實時定量PCR的反應體系20y L反應體系包括雙蒸水8. 6 y L，SYBRGreen I Hotstar Fluo-PCR mix 10 y L,正反向引物各0. 2 y L, I y L標準陽性質粒或待測樣本； (4)SYBR Green I 實時定量 PCR 的反應程序94°C 4 min ；94°C 30 s，60°C 30s, 72 °C30s,進行45個循環；PCR完成后，利用Bio-Rad iQ5 Optical System Software軟件進行數據分析，包括查看擴增曲線、Ct值、熔解曲線、Tm值； (5)標準曲線的建立鰻利斯頓氏菌PMD18-溶血素基因重組質粒按10倍稀釋法稀釋成3. OX IO8 3.0 X 101，共8個濃度梯度，按上述SYBR Green I實時定量PCR的反應體系和反應程序在實時熒光定量PCR儀上進行擴增；反應結束后，根據得到的各個濃度梯度的循環閾值C t采用計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線；得出細菌拷貝數與Ct值的線性方程為Ct= 2.086Log concentration+25. 306 在對樣品進行檢測時，根據其Ct值和線性方程獲得該樣品DNA拷貝數； (6)樣品檢測取被檢魚肝臟或肌肉組織，進行研磨后用水煮法提取模板DNA;按上述SYBR Green I實時定量PCR的反應體系和反應程序在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴增，其中陰性對照采用去離子水，陽性對照采用鰻利斯頓氏菌PMD18-溶血素基因重組標準質粒的DNA ;反應結束后，將DNA樣本的循環閾值C t與 標準曲線對照，得到DNA樣本中的溶血素基因片段拷貝濃度，據此得到被檢魚肝臟或肌肉組織中鰻利斯頓氏菌的DNA拷貝濃度。
全文摘要
本發明是一種基于溶血素基因的病原鰻利斯頓氏菌的SYBRGreenⅠ實時定量PCR檢測方法，該方法包括特異性引物設計、標準質粒的構建、SYBRGreenⅠ實時定量PCR的反應體系、SYBRGreenⅠ實時定量PCR的反應程序、標準曲線的建立和樣品檢測，在對樣品進行檢測時,根據其Ct值和線性方程獲得該樣品DNA拷貝數；本發明采用SYBRGreenI熒光定量PCR技術，對發病水產動物及養殖用水的病原鰻利斯頓氏菌進行定量檢測，簡便快速、特異性好、靈敏度高，且價格低廉。它解決了以往檢測病原鰻利斯頓氏菌的方法繁瑣，檢測時間長，檢測費用高的問題，并且可以即時、準確的提供數據用于生產和科學研究。
文檔編號C12R1/01GK102827926SQ20121012780
公開日2012年12月19日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者張曉君 申請人:淮海工學院