專利名稱：一種優化的有核細胞體外分離試劑盒及使用方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，屬于一種從人類外周血、臍帶血、骨髓血中分離提取有核細胞的試劑盒技術，特別是一種優化的有核細胞體外分離試劑盒及使用方法。
背景技術：
人外周血、臍帶血、骨髓血都屬于人體的血液組織，它們共同的特點是含有紅細胞、白細胞、血小板及血漿物質；同一類細胞的形態、直徑和質量相同。而白細胞中除了淋巴細胞、粒細胞以外，還含有造血干細胞、間充質干細胞、類胚胎干細胞、多潛能成體祖細胞和少量的脂肪干細胞等成體干細胞。各系干細胞又因為各自表面所含有的抗原性不同，可以分為一百多種，如⑶3、⑶34、⑶105、⑶133、⑶10、SCA-ULin-等。各系干細胞和成熟的白細胞均為有核細胞。有核細胞中包含單核細胞，淋巴細胞及各系干細胞/祖細胞。人外周血、臍帶血、骨髓血只是各自所含的各類細胞的數量不同，細胞種類相同。夕卜周血、臍帶血、骨髓血它們的血漿離子濃度相同，滲透壓相同，物理性狀也相同。所以在臨床分離提取有核細胞或血漿物質時是以同一種組織對待，可以用相同的方法分離提取有核細胞。截止目前國際國內從骨髓血、臍帶血、外周血中分離提取有核細胞的方法有三類第一類是以除去紅細胞的方法如氯化銨裂解紅細胞法，Percoll非連續密度梯度離心法、Ficoll-Hypaque密度梯度離心法等，但實際操作過程還是不能完全除去紅細胞，最理想的還會有I%的紅細胞殘留。第二類是利用細胞表面抗原性不同分離細胞的方法，如磁珠法，免疫熒光標記法，富選法，流式細胞儀等，是選擇性的分離⑶3、⑶105、⑶113、⑶34等等。這些方法所存在的共同問題是一是不能有效保留所有類型的有核細胞或干細胞；二是分離提取的細胞種類單一，不能有效保留所有的細胞種類；三是造價太貴；四是技術條件不符合臨床使用，只適用于科學研究的方法。第三類是利用細胞生長的某些特性分離細胞的方法，如間充質干細胞在培養時具有貼壁生長的特性，從而分離出間充質干細胞。本發明人2006年發明了“一種有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法》”(專利號ZL200610106875. 9)已經獲得授權。該發明中描述試劑盒“其特征是紅細胞沉 淀劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400#HIS0PAQUE1077和細胞保養液，各試劑溶液分開保存。”實際試劑盒產品是分為A液、B液、C液各自瓶裝，共同組成一個試劑盒，并且取得了食品藥品監督局的注冊，注冊號寧(銀)食藥監械(準)字2008第1400008號。該產品能有效的從骨髓血、臍帶血、外周血中分離出有核細胞，供臨床醫生開展細胞治療。依據該專利生產的骨髓、臍帶血細胞體外分離試劑盒，供臨床醫生從骨髓血、臍帶血、外周血中分離出有核細胞。臨床醫生再拿有核細胞當做藥品一樣，用于臨床治療細胞損傷性疾病，取得了預想不到的效果。例如在治療失代償期肝硬化，升高白蛋白的療效非常肯定，有95%的病人白蛋白能升高到正常水平(>34g/L);能明顯改善肝硬化病人的凝血機制。在治療潰瘍性結腸炎病人的有效率大于70%。在治療糖尿病足有效率大于70%。從骨髓血、臍帶血、外周血中分離出有核細胞為臨床醫生治療那些傳統醫療手段認為難治或不治之癥提供了一種新的治療手段。比如傳統醫學認為神經是不可再生的，細胞治療顛覆了這一觀點，用干細胞治療神經損傷性疾病有了突破性的進展；如糖尿病的胰島e細胞壞死認為是不可逆的，而干細胞臨床治療性研究已經證明胰島細胞可以再生，臨床治療已經證明有30-40%的病人可以脫離胰島素達兩年之久(還在臨床觀察中)。依據該專利生產的骨髓、臍帶血細胞體外分離試劑盒經過4年多的臨床使用，我 們對其從試劑盒的生產、包裝、存儲、運輸、臨床操作方面認真研究，總結經驗發現還有還存在需要改進和優化的空間。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術缺陷，提供一種優化的有核細胞體外分離試劑盒及使用方法。本發明的目的按照下述方案實現一種優化的有核細胞體外分離試劑盒，由兩種試劑組成,試劑I由紅細胞沉淀劑、氯化鈉或氯化鉀構成；試劑2由泛影酸鈉加聚蔗糖400#，或者泛影酸鈉加右旋糖酐，或者珀庫爾(Percoll)構成，其密度在I. 076-1. 090之間；紅細胞沉淀劑是羥乙基淀粉、甲基纖維素、羧甲基淀粉、琥珀酰明膠中的一種；所述紅細胞沉淀劑的重量濃度為1.0-6.0% ;氯化鈉或氯化鉀的重量濃度為0. 2-1. 0% ；所述泛影酸鈉加聚蔗糖400#是重量濃度為10%泛影酸鈉和3%聚蔗糖400#的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，pH值7. 2-7. 3，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌；所述泛影酸鈉加右旋糖酐是重量濃度為10%泛影酸鈉和3%右旋糖酐的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，PH值7. 2-7. 4，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌；所述珀庫爾(Percoll)是重量濃度為6_8%二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮膠體的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，pH值7. 2-7. 4，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌；所述的優化的有核細胞體外分離試劑盒的使用方法，取IOOml人類骨髓血、或臍帶血或外周血，直接加入到200ml試劑I液體中靜置10-30分鐘，收取上清液，以2000轉/分鐘(IlOOxg)的速度離心5分鐘，棄上清液，余物加入到裝有試劑2液體的離心管中，進行密度梯度離心30分鐘，轉速控制在1500轉/分，吸取有核細胞層，然后再離心清洗I 3次，再用50ml細胞保養液稀釋備用，取100 ill送檢，或自檢。本發明的改進，降低了能耗，降低了生產成本，節省了原材料，改進了工藝。使用方法較以前更為簡單，減少了操作步驟，更加方便了臨床使用。原有的骨髓、臍帶血細胞分離試劑盒是由三種液體A液、B液、C液組成，本發明只用兩種試劑。采用本發明提取分離的干細胞通過以下實驗驗證
I、細胞總數檢測，用血球計數儀或血球計數板在顯微鏡下計算出細胞總數。正常IOOml骨髓血、臍帶血或外周血分離提取的細胞總數不應少于5. 9 X IO7個細胞(血球計數儀打印出的是濃度0. 59-1. 18X10VL)。2、細胞存活率檢測，采用苔盼藍檢測法檢測細胞存活率，常規細胞存活率> 98%。3、細胞收集率檢測，細胞分離前用血細胞分析儀或顯微鏡手工計算有核細胞總數(A)，分離后用同樣的方法測定出有核細胞的總數(B)。回收率=B/AX100%。常規細胞回收率> 90%
4、由于用本發明所分離的有核細胞中包含成體干細胞，所以可以用流式細胞儀檢測干細胞。常見干細胞的含量⑶34 < 2%，⑶38 < I. 5%，⑶133 < 1.0%等等。本發明能夠分離骨髓血、也能分離臍帶血和外周血，試劑盒臨床使用按要求在無菌條件下操作，實驗室潔凈級別整體10000級(類似歐盟標準B級)，局部100級(類似歐盟標準A級)，以保證分離過程不會污染。本發明與原有技術相比第一從試劑盒生產制備角度來比較，節省33%的原料、輔料和包裝材料；節省了1/3的生產耗能。第二減輕了 1/3的運輸重量，降低了運輸成本。第三由于方法簡單了，縮短了細胞分離提取的時間，大大方便了臨床醫生的使用，提高了工作效率。第四由于縮短了體外分離的時間，簡化了步驟能有效提高細胞存活率兩個百分點，這一個百分點就是IXlO6個細胞，這在臨床治療中有非常重要的意義。第五由于減少分離的步驟，從而減少了細胞丟失的幾率，以及存活率的提高，相應細胞收集率也提高到90%，這是非常有意義的結果。第六由于減少一個試劑，減少了分離的步驟降低了操作過程的污染幾率，增強了臨床使用的安全性。
具體實施例方式實施例I :試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6.0%的羥乙基淀粉和0.45%的氯化鈉的水溶液，用10%的氫氧化鈉和1%的稀鹽酸調整pH值至7.4±0. I,用0. 22iim過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為10%泛影酸鈉和3%聚蔗糖400#(SIGMA公司產品的商品名HIST0PAQUE1077)的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，pH值7. 2-7. 3，用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試彡0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法取上述合格出廠的試劑盒一個，再取IOOml骨髓血(或臍帶血，或外周血)，嚴格按無菌操作原則，將IOOml骨髓血加到試劑I的瓶子里邊，混勻后靜置30分鐘，收取上清液，以2000轉/分鐘(IlOOxg)的速度離心5分鐘，棄上清液。收取濃縮液，用移液器加到含有試劑2的離心管中，進行密度梯度離心30分鐘，離心力控制在720xg(轉速大約1500轉/分)。離心完成吸取有核細胞層，然后再離心清洗I 3次。最后一次離心清洗前將有核細胞溶解至50ml取100 ill細胞懸液做檢測。清洗完成后按臨床醫生的要求將細胞溶解至所需體積的注射用生理鹽水中，送臨床醫生立即使用。試劑盒檢測方法I、細胞總數檢測，用血球計數儀或血球計數板在顯微鏡下計算出細胞總數。正常IOOml骨髓血、臍帶血或外周血分離提取的細胞總數不應少于5. 9 X IO7個細胞(血球計數儀打印出的是濃度0. 59-1. 18X10VL)。
2、細胞存活率檢測，采用苔盼藍檢測法檢測細胞存活率，常規細胞存活率> 98%。3、細胞收集率檢測，細胞分離前用血細胞分析儀或顯微鏡手工計算有核細胞總數(A)，分離后用同樣的方法測定出有核細胞的總數(B)。回收率=B/AX100%。常規細胞回收率> 90%4、由于用本發明所分離的有核細胞中包含成體干細胞，所以可以用流式細胞儀檢測干細胞。常見干細胞的含量⑶34 < 2%，⑶38 < I. 5%，⑶133 < 1.0%等等。實施例2 試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6.0%的羥乙基淀粉和0.45%的氯化鉀的水溶液，用10%的氫氧化鈉和1%的稀鹽酸調整pH值至7.4±0. I,用0. 22iim過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為10%泛影酸鈉和3%右旋糖酐的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，pH值7. 2-7. 4，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試彡0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。實施例3 試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6.0%的羥乙基淀粉和0.20%的氯化鈉的水溶液，用10%的氫氧化鈉和1%的稀鹽酸調整PH值至7.4±0. I,用0. 22iim過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為6-8%珀庫爾(Percoll 二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮膠體)的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，PH值7. 2-7. 4，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試彡0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。實施例4 試劑盒組成
I、試劑I配制濃度為I. 0-6. 0%羧甲基淀粉和0. 30%的氯化鈉的水溶液，用10%的氫氧化鈉和I %的稀鹽酸調整PH值至7. 4±0. I,用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為10%泛影酸鈉和3%聚蔗糖400#(SIGMA公司產品的商品名HIST0PAQUE1077)，的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，pH值7. 2-7. 3，用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌 檢測合格，內毒素含量測試彡0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。實施例5 試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6. 0%羧甲基淀粉和I. 0%的氯化鈉的水溶液，用10%的氫氧化鈉和I %的稀鹽酸調整pH值至7. 4±0. I,用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為10%泛影酸鈉和3%右旋糖酐的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，PH值7. 2-7. 4，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試彡0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。實施例6 試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6. 0%羧甲基淀粉和0. 2%的氯化鉀的水溶液，用10%的氫氧化鈉和I %的稀鹽酸調整PH值至7. 4±0. I,用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為6-8%珀庫爾(Percoll 二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮膠體)的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，pH值7. 2-7. 4，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試彡0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。實施例I 試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6. 0%甲基纖維素和0. 30%的氯化鉀的水溶液，用10%的氫氧化鈉和I %的稀鹽酸調整PH值至7. 4±0. I,用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為10%泛影酸鈉和3%聚蔗糖400#(SIGMA公司產品的商品名HIST0PAQUE1077)，的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，PH值7. 2-7. 3，用
0.22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。
上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試< 0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。實施例8 試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6. 0%甲基纖維素和I %的氯化鉀的水溶液，用10%的氫氧化鈉和I %的稀鹽酸調整PH值至7. 4±0. I,用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。
2、試劑2配制濃度為10%泛影酸鈉和3%右旋糖酐的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，PH值7. 2-7. 4，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試彡0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。實施例9 試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6. 0%甲基纖維素和0. 45%的氯化鈉的水溶液，用10%的氫氧化鈉和I %的稀鹽酸調整PH值至7. 4±0. I,用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為6-8%珀庫爾(Percoll 二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮膠體)的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，PH值7. 2-7. 4，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試彡0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。實施例10 試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6. 0%琥珀酰明膠和0. 45%的氯化鈉的水溶液，用10%的氫氧化鈉和I %的稀鹽酸調整PH值至7. 4±0. I,用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為10%泛影酸鈉和3%聚蔗糖400#(SIGMA公司產品的商品名HIST0PAQUE1077)，的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，pH值7. 2-7. 3，用
0.22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試彡0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。實施例11 試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6. 0%琥珀酰明膠和0. 45%的氯化鈉的水溶液，用10%的氫氧化鈉和I %的稀鹽 酸調整PH值至7. 4±0. I,用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為10%泛影酸鈉和3%右旋糖酐的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，PH值7. 2-7. 4，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試< 0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。實施例12 試劑盒組成I、試劑I配制濃度為I. 0-6. 0%琥珀酰明膠和0. 45%的氯化鈉的水溶液，用10%的氫氧化鈉和I %的稀鹽酸調整PH值至7. 4±0. I,用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。2、試劑2配制濃度為6-8%珀庫爾(Percoll 二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮膠體)的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，PH值7. 2-7. 4，用0. 22 y m過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。上述兩種試劑經無菌檢測合格，內毒素含量測試< 0. 5EU/ml，試劑I、試劑2各一瓶裝入試劑盒，為合格產品出廠。試劑盒使用方法和檢測方法同實施例I。
權利要求
1.一種優化的有核細胞體外分離試劑盒，由兩種試劑組成，試劑I由紅細胞沉淀劑、氯化鈉或氯化鉀構成；試劑2由泛影酸鈉加聚蔗糖400#，或者泛影酸鈉加右旋糖酐，或者珀庫爾(Percoll)構成，其密度在I. 076-1. 090之間；紅細胞沉淀劑是羥乙基淀粉、甲基纖維素、羧甲基淀粉、琥珀酰明膠中的一種。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述紅細胞沉淀劑的重量濃度為I.0-6. 0% ;氯化鈉或氯化鉀的重量濃度為0. 2-1. 0%。
3.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述泛影酸鈉加聚蔗糖400#是重量濃度為10%泛影酸鈉和3%聚蔗糖400#的水溶液，主要技術指標是密度在I. 076-1. 090，PH值7. 2-7. 3，用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。
4.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述泛影酸鈉加右旋糖酐是重量濃度為10%泛影酸鈉和3%右旋糖酐的水溶液，主要技術指標是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7. 4，用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝，或是瓶裝后121°C高壓滅菌。
5.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述珀庫爾(Percoll)是重量濃度為6-8 %二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮膠體的水溶液，密度在I. 076-1. 090，pH值7. 2-7. 4，用0. 22 iim過濾消毒后分瓶灌裝,或是瓶裝后121°C高壓滅菌。
6.如權利要求I所述的試劑盒的使用方法，取IOOml人類骨髓血、或臍帶血或外周血，直接加入到200ml試劑I液體中靜置10-30分鐘，收取上清液，以2000轉/分鐘(IlOOxg)的速度離心5分鐘，棄上清液，余物加入到裝有試劑2液體的離心管中，進行密度梯度離心30分鐘，轉速控制在1500轉/分，吸取有核細胞層，然后再離心清洗I 3次，再用50ml細胞保養液稀釋備用，取100 Ul送檢，或自檢。
全文摘要
一種優化的有核細胞體外分離試劑盒，由兩種試劑組成，試劑1由紅細胞沉淀劑、氯化鈉或氯化鉀構成；試劑2由泛影酸鈉加聚蔗糖400#，或者泛影酸鈉加右旋糖酐，或者珀庫爾(Percoll)構成，其密度在1.076-1.090之間。使用方法取100ml人類骨髓血、或臍帶血或外周血，直接加入到200ml試劑1液體中靜置10-30分鐘，收取上清液，以2000轉/分鐘(1100xg)的速度離心5分鐘，棄上清液，余物加入到裝有試劑2液體的離心管中，進行密度梯度離心30分鐘，轉速控制在1500轉/分，吸取有核細胞層，然后再離心清洗1～3次，再用50ml細胞保養液稀釋備用，取100μl送檢，或自檢。
文檔編號C12N5/078GK102643781SQ20121012601
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年2月23日
發明者王懷林 申請人:寧夏中聯達生物有限公司