專利名稱：建鯉GAPDH基因含內含子的部分序列的克隆方法及其realtimePCR方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種建鯉管家基因GAPDH基因含內含子的部分序列的克隆方法及其real time PCR方法。
背景技術：
在實時定量PCR(real time PCR)中，目標基因的相對表達量是通過內參基因的均一化來確定。理想的內參基因應該是它的表達量在不同的組織中恒定，而且不受實驗處理條件的影響。大量的研究表明，目前還沒有通用的內參基因符合這一條件，最好的選擇就是內參基因表達量在自己所研究的樣品中變化較小。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是糖酵解反應中的一個酶，由 4 個30 40kDa的亞基組成，分子量146kDa。該基因幾乎在所有組織中都高水平表達，在同種細胞或者組織中的蛋白質表達量一般是恒定的，且不受含有的部分識別位點、佛波脂等誘導物質的影響而保持恒定，故被廣泛用作real time PCR實驗操作的管家基因。在用TriZoI提取的RNA樣品中，不可避免的會有少量的DNA殘留，反轉錄后，cDNA中還是含有DNA，而DNA同樣會作為模板和cDNA —起被擴增，這必然會影響擴增效率，從而影響到實驗結果的準確性。為了消除DNA的污染，通常需要將RNA樣品進行DNAse酶處理，但這會增加樣品被染污的機率，同時也會減少RNA的得率，導致表達量很低的基因甚至無法檢測出。最直接的方法就是通過設計跨越內含子的引物來消除DNA的污染，優化反應條件，使樣品中的大片段DNA不能被擴增。建鯉(Cyprinuscarpio var. jian)是本中心培育出的遺傳性狀穩定的鯉魚新品種，具有生長快、體型佳、肉質好等優良的經濟性狀，已遍及我國27個省。本研究通過克隆建鯉GAPDH含內含子的部分序列，設計一對跨越內含子的定量引物，建立基于SYBR GreenI染料技術的建鯉GAPDH real time PCR方法，從而為GAPDH作為內參基因，在利用realtime PCR對建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。
發明內容
發明目的本發明目的之一在于克隆出建鯉GAPDH基因含內含子的部分序列；本發明目的之二是基于獲得的序列，設計一對跨越內含子的定量引物，建立基于SYBR GreenI染料技術的建鯉GAPDH real time PCR方法，從而為GAPDH作為內參基因，在利用realtime PCR對建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。技術方案基于現有技術中存在的問題，本發明提供一種建鯉GAPDH基因含內含子的部分序列的克隆方法，按照以下步驟實現建鯉血液基因組DNA提取，設計引物、PCR擴增，產物純化，轉入載體，藍白斑篩選，質粒測序；其中所設計的引物序列為正向CCGTTCATGCTATCACAGCTACACA
反向GGAAGCAGGATCTTACCATGTGAC用此方法克隆所得建鯉GAPDH基因含內含子的部分序列如SEQ ID中No. I所述。作為本發明的進一步改進，PCR擴增的反應條件如下95°C 3min、30循環(94°C30s,57°C 30s,72°C lmin)、72°C延長 8min，4°C度保存。本發明還提供一種real time PCR擴增圖I中所示建鯉GAPDH基因含內含子的部分序列的方法，按如下步驟實現抽提總RNA,以Oigo dT Primer和Random 6 mers為引物進行RT反應，然后以此RT液為模板進行real time PCR，熒光染料為SYBR Green I，其中real time PCR中的建鯉引物為跨越內含子的定量引物，其序列為正向AGCTCAATGGCAAGCTTACTGG
反向GTGGATACCACCTGGTCCTCTG作文本發明的進一步改進,real time PCR擴增的反應條件為94°C 3min,然后40個循環 94°C 5sec，62°C 20sec，最后 72°C 3min，4°C保存。有益效果為檢驗反應的特異性，在real time PCR后進行融解曲線分析，以確定得到的產物是否為目的產物。擴增溫度以0. 2°C的增幅從65°C緩慢遞增到95°C，連續測定樣品的熒光強度以獲取融解曲線。結果見圖2，其Tm溫度為84. 8°C，只有一個特異峰，表明無引物二聚體以及非特異性產物擴增，表明設計的一對跨越內含子的引物特異性強，擴增效率高，反轉錄的cDNA產物中含有的DNA未被擴增，消除了樣品中的DNA污染，real time PCR條件得到了較好的優化。本發明通過克隆建鯉GAPDH含內含子的部分序列，然后設計跨越內含子的引物，優化擴增反應條件，來消除DNA的污染，從而增加了擴增的效率。這樣，可為GAPDH作為內參基因，在利用real time PCR對建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。
圖I建鯉GAPDH基因含內含子的部分序列，其中外顯子以大寫字母表示，內含子以斜體小寫字母表示，定量PCR引物以下劃線表示圖2GAPDH溶解曲線
圖3GAPDH標準曲線
具體實施例方式實施例I建鯉GAPDH基因含內含子的部分序列的擴增建鯉來自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心宜興養殖基地，根據GenBank上公布的鯉GAPDH基因cDNA序列以及斑馬魚GAPDH基因的DNA序列設計一對引物，能擴增建鯉GAPDH基因內含子，見表I。表I擴增建鯉GAPDH的引物
權利要求
1.一種建鯉GAPDH基因含內含子的部分序列的克隆方法，按照以下步驟實現建鯉血液基因組DNA提取，設計引物、PCR擴增，產物純化，轉入載體，藍白斑篩選，質粒測序，其特征在于所設計的引物序列為 正向CCGTTCATGCTATCACAGCTACACA 反向GGAAGCAGGATCTTACCATGTGAC 用此方法克隆所得建鯉GAPDH基因含內含子的部分序列為如SEQ ID中No. I所述。
2.根據權利要求I所述克隆方法，其特征在于所述PCR擴增的反應條件為95°C3min ；30 循環 94°C 30s、57°C 30s,72°C lmin ;72°C延長 8min ;4°C度保存。
3.—種real time PCR擴增權利要求I中所述建鯉GAPDH基因含內含子的部分序列的方法，按如下步驟實現抽提總RNA,以Oigo dT Primer和Random 6 mers為引物進行RT反應，然后以此RT液為模板進行real time PCR，熒光染料為SYBR Green I，其特征在于real time PCR中的建鯉引物為跨越內含子的定量引物，其序列為 正向AGCTCAATGGCAAGCTTACTGG 反向GTGGATACCACCTGGTCCTCTG。
4.根據權利要求3中所述realtime PCR擴增方法,其特征在于,所述real time PCR擴增的反應條件為94°C 3min，然后40個循環94°C 5sec，62°C 20sec，最后72°C 3min，4°C保存。
全文摘要
本發明通過克隆建鯉GAPDH含內含子的部分序列，然后設計跨越內含子的引物，優化擴增反應條件，來消除DNA的污染，從而提高擴增效率。這樣，可為GAPDH作為內參基因，在利用realtimePCR對建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。
文檔編號C12N15/10GK102643799SQ201210120450
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月23日 優先權日2012年4月23日
發明者俞菊華, 唐永凱, 李建林, 李紅霞, 董在杰 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心