專利名稱：轉基因玉米59122品系特異定量pcr精準檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及基因的定量的分析方法。
背景技術：
國際上很多國家對轉基因產品實施限量標識和進口，而我國尚無具體的轉基因產品標識閾值。為了打破歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘，同時彌補和完善我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系，更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權，建立一種新型轉基因玉米59122品系特異定量PCR精準檢測方法已成為必要。目前關于轉基因玉米59122的檢測技術，主要集中在普通定性PCR分析方法和標準，尚無關于擴增檢測轉基因玉米59122及產品的品系特異性某特定位點(基因序列)的定量PCR精準檢測技術。
發明內容
本發明的目的主要是提供一種擴增效率高、準確度高的檢測轉基因玉米59122及產品的品系特異性某特定位點的定量PCR精準檢測技術。本發明通過下述技術方案實現
轉基因玉米59122品系特異定量PCR精準檢測方法，主要包括以下步驟
(1)合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，59122event-F: 5’ -AATTCGCCCTATAGTGAGTCGTA-3’
下游引物序列，59122event-R: 5’ -GATAAACAAACGGGACCATAGAA-3’
熒光探針序列，59122event-P: 5’ -FAM-CGCAATTCAGTACATTAAAAACGTCCGC-TAMRA-3’ ；
(2)制備59122品系的DNA稀釋液；
(3)配制PCR反應體系；
(4)定量PCR檢測。進一步，步驟(I)所述合成的引物及熒光探針的濃度都為lOMfflol/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。為了達到最好的檢測效果，步驟(3)所述的配制PCR反應體系，即將3μ1的DNA稀釋液加入到25μ1反應體系中，所述25μ1的反應體系包括以下組分
Taqman Master mix12. 5μ1
上游引物ιμ
下游引物ιμ
熒光探針0.5 μι
水IOul。作為最優的反應條件，所述PCR反應條件為95°C預變性lOmin，I個循環；95°C變性15s，59。。退火60s, 45個循環。本發明具有以下優點及有益效果1、本發明打破歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘；
2、本發明彌補和完善我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系；
3、本發明提供的檢測技術可更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權；
4、本發明擴增效率高、準確度高。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的 說明，但本發明的實施方式并不限于此。實施例轉基因玉米59122品系特異定量PCR精準檢測方法，主要包括以下步驟
(I)合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，59122event-F: 5’ -AAITCGCCCTATAGTGAGTCGTA-3’
下游引物序列，59122event-R: 5’ -GATAAACAAACGGGACCATAGAA-3’
熒光探針序列，59122event-P: 5’ -FAM-CGCAAITCAGTACAITAAAAACGTCCGC-TAMRA-3’。本實施例引物及熒光探針的合成濃度都為lOMfflol/1。以上引物和熒光探針的核苷酸序列是針對轉基因玉米59122及產品的品系特異性某特定位點，即外源基因與玉米基因組DNA的整合位點設計，通過該設計就可以精準檢測轉基因玉米59122中的轉化事件。(2)制備59122品系的DNA稀釋液；即采用常規的DNA提取手段，從轉基因玉米59122中提取出濃度為50ng/W的DNA稀釋液。(3)配制PCR反應體系；即將3ul制備好的DNA稀釋液加入25ul反應體系中。以上25ul反應體系包括以下組分
Taqman Master mix12. 51^1
上游引物IW
下游引物1耵
熒光探針o. 5 m
水10P1。(4)定量 PCR 檢測。根據上述PCR反應體系，在以下PCR反應條件下對產物進行擴增并檢測，所述PCR反應條件為95°C預變性10min，l個循環；95°C變性15s，59°C退火60s，45個循環。本實施例中采用的是ABI公司生產的7500型熒光定量PCR儀器。對本實施例的方法數據連續重復做16個平行樣品，對該16個樣品進行了檢測，其檢測數據如表I。表I
權利要求
1.轉基因玉米59122品系特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，主要包括以下步驟 (1)合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列，59122event-F: 5’ -AAITCGCCCTATAGTGAGTCGTA-3’ 下游引物序列，59122event-R: 5’ -GATAAACAAACGGGACCATAGAA-3’ 熒光探針序列，59122event-P: 5’ -FAM-CGCAAITCAGTACATTAAAAACGTCCGC-TAMRA-3’ ； (2)制備59122品系的DNA稀釋液； (3)配制PCR反應體系； (4)定量PCR檢測。
2.根據權利要求I所述的轉基因玉米59122品系特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfliol/1，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/W。
3.根據權利要求2所述的轉基因玉米59122品系特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述的配制PCR反應體系，即將3W的DNA稀釋液加入到25W反應體系中，所述25M1的反應體系包括以下組分 Taqman Master mix12. 5M-I上游引物IW下游引物IW熒光探針0. 5 m水IOul。
4.根據權利要求I或3所述的轉基因玉米59122品系特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，所述PCR反應條件為95°C預變性lOmin，I個循環；95°C變性15s，59°C退火60s，45個循環。
全文摘要
本發明屬于生物技術，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉基因玉米59122品系特異定量PCR精準檢測方法。本發明采用設計的特異性上游引物59122event-F、下游引物59122event-R、熒光探針59122event-P、59122品系的DNA稀釋液以及TaqmanMastermix和水配制成PCR反應體系，進行定量PCR檢測。本發明主要建立了一種高擴增效率、高準確度的Taqman定量PCR檢測技術，適用于國內農業轉基因生物及產品監督檢驗、進出境口岸轉基因生物及產品檢驗、企業內部進口原材料含轉基因59122品系生物成分檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102618657SQ201210114359
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者劉勇, 劉文娟, 宋君, 尹全, 常麗娟, 張富麗, 王東, 郭靈安, 雷紹榮 申請人:四川省農業科學院分析測試中心