專利名稱：兔源性纖維成分熒光定量pcr定性檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，具體的說，是一種兔源性纖維成分熒光定量PCR定性檢測方法。
背景技術：
兔毛、狐貍皮草是秋冬市場上的寵兒。皮草以其保暖、舒適、美觀在國際市場上長盛不衰。除此以外，市場上還存在兔絨、狐絨織物制品。一般情況下，狐貍毛要比兔毛長密而柔軟，加之飼養成本也較高，狐貍皮草的價格要遠高于兔毛制品。近年隨著品種的改良，兔毛也逐漸具備細長柔軟的特性，比如安哥拉兔、獺兔等，給皮草的鑒別增加了難度。兔毛狐貍毛都有髓質層，極少數部分的細毛無毛髓，顯微鏡下呈現出小格狀空腔。我國現行的標準FZ/T01057-2007中對兔毛纖維的縱面形態描述為“鱗片較小與纖維縱向呈傾斜狀，髓腔有單列、雙列、多列”，有經驗的人根據髓腔的排列和形狀可以對纖維的種屬進行判別。一般檢測機構主要根據顯微鏡下的纖維形態特征來判斷纖維的種屬，見圖I。圖I為顯微鏡下的兔毛(左)和狐貍毛(右)。而在一般的光學顯微鏡下，鱗片并不是很清晰，檢測起來費時費力。
發明內容
本發明是一種基于物種自帶的DNA序列來定性判別兔毛狐貍毛的方法，以克服現有技術所存在的上述缺點和不足。本發明的目的在于，提供一種兔源性纖維成分熒光定量PCR的定性檢測方法。本發明的另一目的在于，提供一種兔源性纖維成分的檢測試劑盒，以及試劑盒的用途。本發明的再一目的在于，提供一種兔源性纖維成分熒光定量PCR的引物和探針。本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現作為本發明的第一方面，一種兔源性纖維成分熒光定量PCR的定性檢測方法，包括以下步驟步驟一、兔毛的DNA為模板，進行PCR擴增；步驟二、檢測擴增產物的熒光信號；其特征在于，用于PCR擴增的反應體系中含有擴增兔源性纖維成分特異性引物對和兔源性纖維成分特異性探針。其中，所述擴增兔源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示。其中，所述兔源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述方法還包括步驟在聚合酶鏈式反應過程中或之后，檢測兔源性纖維成分特異性探針發出的熒光信號。所述PCR擴增的條件如下
反應體系ABITaqman universal PCR master mix (2X) 10 μ I,DNA模板2 μ I,弓I物 I. 2 μ I (10 μ Μ)，probe 2 μ I (2 μ Μ)，ddH20 4. 8 μ I ；反應的條件為:95。〇，51^11;951，158，611，458，40個循環。作為本發明的第二方面，一種兔源性纖維成分的檢測試劑盒，含有以下試劑(a)擴增兔源性纖維成分特異性引物對；(b)兔源性纖維成分特異性探針。進一步，所述試劑盒還包括(c)標準參照物。 其中，所述標準參照物是兔源性纖維成分DNA，或含有兔源性纖維成分擴增目的片段的質粒DNA，或兔毛。其中，所述擴增兔源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示。其中，所述兔源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述兔源性纖維成分特異性探針發出的熒光信號。作為本發明的第三方面，一種兔源性纖維成分的檢測試劑盒的應用，用于檢測在皮草中是否存在兔源性纖維成分。作為本發明的第四方面，一種如權利要求I所述的兔源性纖維成分熒光定量PCR的特異性引物和特異性探針，其特征在于，所述兔源性纖維成分特異性引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2所示；所述兔源性纖維成分特異性探針的序列如SEQ ID NO 3所示。本發明的有益效果I、可簡便、快速的檢測和鑒定皮草中是否存在兔源性、狐源性纖維成分。2、本發明基于牦牛線粒體12SrRNA基因的序列，設計特異性引物和特異性探針的特異性好。3、檢測方法靈敏度假，可檢測到配比為1% (wt)的兔毛、狐貍毛。
圖I :顯微鏡下的兔毛(左)和狐貍毛(右)。圖2 :兔源性引物探針序列與相對應的狐序列的blast結果。圖3 :狐源性引物探針序列與相應的兔序列的blast結果。圖4 :兔源性成分的實時熒光PCR結果。圖5 :狐源性成分的實時熒光PCR結果。圖6 :兔源性成分10倍梯度稀釋實時熒光PCR檢測情況。圖7 :兔源性成分不同配比實時熒光PCR檢測情況。圖8 :狐源性成分10倍梯度稀釋實時熒光PCR檢測情況圖9 :狐源性成分不同配比實時熒光PCR檢測情況。圖10 :被檢測樣品外形及常規方法檢測結果。圖11 :兔源性成分驗證及檢測結果。圖12 :被檢測產品外形其常規方法檢測結果。
圖13 :微量兔源性成分驗證及檢測結果。圖14 :被檢測產品外觀。圖15 :狐源性纖維成分驗證及檢測結果。
具體實施方式
以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗室手冊》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或廠商提供的條件進行。以下實施例中所涉及的“％”，除特別說明外，均為重量百分比。實施例II、探針和引物的設計市場上常見的毛用狐貍品種有北極狐、紅狐，兼顧兩者線粒體基因12srRNA序列的相同部分，與兔的序列進行比較，選取合適的序列進行引物探針設計。針對兔源性成分的產物大小為68bp。引物和探針序列如下RabF :5，-CGAACCCTAAAAAGGAGCAAAA-3，(SEQ ID NO 1)RabR :5’ -GGGCTACACCTTGACCTAACGT-3’ (SEQ ID NO 2)Prab :FAM-AAGCTCAATTACCACCGTAA-MGB(SEQ ID NO 3)針對狐源性成分的產物大小為70bp。引物和探針序列如下FoxF :5，-ACAAAACAATTCGCCAGAGAACT-3’ (SEQ ID NO 4)FoxR :5，-GGATATAAAGCACCGCCAAGTC-3’ (SEQ ID NO 5)Pfox FAM-TAGCAACAGCTTAAAACT-MGB (SEQ ID NO :6)針對羊源性成分的產物大小為61bp。引物和探針序列如下YangF :5，-GCCAGAGTACTACCGGCAACA-3’ (SEQ ID NO 7)YangR :5，-GGCTCCTCTAGAAGGGTATAAAGCA-3’ (SEQ ID NO 8)Pyang :FAM-CGAAACTCAAAGGACTTGG-MGB (SEQ ID NO 9)其中，FAM表示熒光報告基團，MGB表示淬滅基團。本發明采用熒光探針法，其檢測原理是利用熒光標記特異性探針來識別模板。與現有技術中SYBR染料法相比，本發明熒光標記特異性探針的特異性更強。2、反應體系的優化分別取家兔毛、北極狐毛511^,剪碎,用？1'0〖61]^毛發抽提試劑盒抽提0嫩,5(^ I洗脫液洗脫DNA。反應體系除ABI Taqman universal PCR master mix (2X) 10 μ I,DNA 模板 2 μ I以外，其他成分如表1、2所示。引物的濃度為10 μ Μ，探針的濃度為2 μ Μ。反應條件反應的條件為95°〇，51^11;951，158，611，458，40個循環。表I、兔源性成分測定優化反應體系中其他成分的用量(單位μ I)
權利要求
1.一種兔源性纖維成分熒光定量PCR的定性檢測方法，包括以下步驟 步驟一、以兔毛的DNA為模板，進行PCR擴增； 步驟ニ、檢測擴增產物的熒光信號； 其特征在于，用于PCR擴增的反應體系中含有擴增兔源性纖維成分特異性引物對和兔源性纖維成分特異性探針。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述擴增兔源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述兔源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的條件如下 反應體系ABI Taqman universal PCR master mix(2X) 10 μ I, DNA 模板 2 μ I,引物I. 2 μ I (10 μ Μ)，probe 2 μ I (2 μ Μ)，ddH20 4. 8 μ I ； 反應的條件為95°C,5min ;95°C，15s，61°C，45s，40 個循環。
5.一種兔源性纖維成分的檢測試劑盒，含有以下試劑 (a)擴增兔源性纖維成分特異性引物對； (b)兔源性纖維成分特異性探針。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括 (C)標準參照物。
7.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述擴增兔源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
8.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述兔源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。
9.如權利要求5 8中任ー項的試劑盒的應用，用于檢測在皮草中是否存在兔源性纖維成分。
10.一種如權利要求I所述的兔源性纖維成分熒光定量PCR的特異性引物和特異性探針，其特征在干， 所述兔源性纖維成分特異性引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2所示； 所述兔源性纖維成分特異性探針的序列如SEQ ID N0:3所示。
全文摘要
本發明公開了一種兔源性纖維成分熒光定量PCR的定性檢測方法，包括步驟一、兔毛的DNA為模板，進行PCR擴增；步驟二、檢測擴增產物的熒光信號；其中，用于PCR擴增的反應體系中含有擴增兔源性纖維成分特異性引物對和兔源性纖維成分特異性探針。本發明的方法可簡便、快速的檢測和鑒定紡織品中是否存在兔源性纖維成分，設計的特異性引物和特異性探針的特異性好，靈敏度佳，可檢測到配比為1％(wt)的狐貍毛。
文檔編號C12N15/11GK102634584SQ201210114158
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者劉錦瑞, 葉尚華, 唐敏峰, 楊娟, 王小平, 費靜, 陸維明, 高友軍 申請人:上海出入境檢驗檢疫局工業品與原材料檢測技術中心, 中華人民共和國新疆出入境檢驗檢疫局, 河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心