專利名稱：一種食甲醇芽孢桿菌及其生物轉化阿魏酸生產天然香蘭素的方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵領域，具體地涉及一種食甲醇芽孢桿菌及其生物轉化阿魏酸生產天然香蘭素的方法。
背景技術：
香蘭素(Vanillin)，又名香草醛、香蘭醛等，是香莢蘭豆中的主要成分，化學名為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，相對分子量為152. 15。香蘭素外觀為白色至微黃色針狀結晶或粉末，呈香莢蘭豆特有的香氣，微甜，在潮濕的空氣中緩慢氧化為香蘭酸。
香蘭素是世界上產量最大、用途最廣的香料之一，被譽為“香料之王”，廣泛應用于巧克力、冰淇淋、糖果等食品以及香煙、飲料和高檔化妝品中。它不僅可以用作增香劑和定香劑，還在食品中用作防腐劑、保鮮劑和抗氧化劑。香蘭素的世界年消費量約I. 2萬噸，而天然香蘭素的產量僅為1800噸，因此遠不能滿足需求。目前常用的香蘭素生產方法有植物原料提取法和化學合成法。香蘭素在香莢蘭豆中含量約為15_20g/kg。香莢蘭種植受地域和氣候環境的限制產量極少，且在種植過程中需要對花朵進行人工授粉、勞動強度大，難以進行大規模栽種，遠遠不能滿足市場的需求。目前市場上絕大多數的香蘭素產品是通過化學合成的，常用合成底物包括丁香酚、木質素、乙醛酸和愈創木酚等。國內常用的是采用愈創木酚和烏洛托品反應的亞硝化工藝，該方法路長，分離過程復雜，收率低，環境污染嚴重，原料消耗高，國外早已被淘汰。國外主要采用愈創木酚和乙醛酸縮合工藝，該工藝設備簡單，產物純度高，原料來源廣泛，但是存在嚴重的缺陷，比如環境污染嚴重，產品香氣單一，易摻雜質，合成香蘭素的安全性也受到質疑。香蘭素的生物合成方法主要有微生物發酵、酶工程、細胞工程等，與化學合成相t匕，生物法合成香蘭素具有反應條件溫和，副產物少，提取步驟簡單，生產清潔，環境污染低，產品安全可靠等優點。但是綜合考慮技術可行性、經濟性、安全性等因素，微生物發酵法被認為是目前最實際的天然香蘭素制取方法。許多天然物質如阿魏酸、1，2_二苯乙烯酚、丁香酚、木質素、異丁香酚等都可以作為生物轉化生產香蘭素的前體物質。關于用多種微生物發酵法將阿魏酸轉化為香蘭素已有報道。如1996年Rabenhorst 報道 Streptomyces setonii ATCC39116 和 1998 年 A. Muheim 報道的Amycolatopsis sp. HR167,香蘭素濃度分別達到12g/L和11. 5g/L,且培養基成分較為復雜,生產成本較高,副產物較多包括香蘭酸、香蘭醇和愈創木酚等,給產品分離提取帶來了相當的困難。
發明內容
本發明提供了一種食甲醇芽孢桿菌，該菌株名為Bacillus methylotrophicusVJ4-1，于2012年I月16日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC M2012004，其生物學特征是是革蘭氏陽性菌，能在10% NaCl中生長，有精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶活性，能產酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水楊素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麥芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸鹽、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸組氨酸、檸檬酸鹽為碳源的培養基上生長，其16S rRNA序列與Bacillusmethylotrophicus的16S rRNA序列比對相似性達到100*%。本發明利用食甲醇芽孢桿菌在是生物轉化阿魏酸生產天然香蘭素的方法，其方法涉及的步驟如下(I)斜面培養將食甲醇芽抱桿菌 Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC M2012004接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，在25 35°C、pH5 9條件下，靜置培養24 72小時后,置于冰箱中；(2)制備種子培養液用步驟(I)所得的斜面培養物，接種到種子培養基，在25 35°C條件下，100 150rpm振蕩培養24h 72h，連續轉接I 4次，制得種子培養液； (3)發酵使用步驟(2)所得的種子培養基，按體積百分比2 20%的接種量接入發酵培養基，在30 40°C條件下，100 200rpm振蕩培養24 72h ；(4)轉化使用步驟(3)所得的發酵液，加入5 13. 3g/L的阿魏酸，在30 40°C條件下，100 200rpm避光振蕩培養6 12天后停止。進一步，所述斜面培養基馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L ;種子液培養基組成為麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。再進一步，所述發酵培養基的組成為碳源谷殼5 20g/L，氮源豆柏I 3g/L，氯化鈉0. 5 I. 5g/L，七水硫酸亞鐵0. 01 0. 05g/L,磷酸氫二鉀0. 5 I. 0g/L、七水硫酸鎂0.5 1.0g/L，調節 pH 至 6 10。再進一步，所述碳源為淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、麥芽浸粉、麩皮和谷殼任選其一，所述碳源優選谷殼。(I)不同碳源發酵生產天然香蘭素的產量以高氏一號培養基為基礎培養基，固定氮源和無機鹽，分別以淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、麥芽浸粉、麩皮和谷殼作為碳源，濃度均為20g/L。由圖I可知，不同碳源與麩皮比較發酵生產香蘭素的產量，由高到低依次是谷殼、麩皮、鹿糖、淀粉、麥芽浸粉、麥芽糖、葡萄糖和果糖。緩效碳源比速效碳源更易于香蘭素的產生，緩效碳源中的谷殼由于其中含有生長因子而比單一碳源更易于香蘭素的產生。再進一步，所述氮源為酵母粉、黃豆餅粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、動物蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨和豆柏任選其一，所述氮源優選谷殼。(2)不同氮源發酵生產天然香蘭素的產量以高氏一號培養基為基礎培養基，碳源和無機鹽不變，分別以酵母粉、黃豆餅粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、動物蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨和豆柏作為氮源，濃度均為lg/L。由圖2可知，不同氮源對香蘭素產量的影響有高到低依次是豆柏、黃豆餅粉、牛肉膏、蛋白胨(Arg)、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨。由圖2可看出無機氮源不利于香蘭素的產生，有機氮源更利于香蘭素的產生。以豆柏作為氮源比其他氮源產生的香蘭素更多。再進一步，所述pH優選為10。(3)不同發酵培養基初始pH值下天然香蘭素產量使用優化后的培養基碳、氮、無機鹽組成，配制成pH值為3. 0至11. 0九種培養基，篩選出產香蘭素濃度最高的發酵培養基pH值。由圖3可以看出，pH值3. 0,4. 0,11. 0時，由于強酸性和強堿性影響，香蘭素產量較低；在堿性條件下，PH值在8. 0至10. 0之間都具有相對較高的產量，說明該菌在堿性條件下更適合阿魏酸轉化為香蘭素。其中在PH值為10. 0
時香蘭素的產量最高。 再進一步，所述發酵溫度優選為40°C。(4)不同發酵溫度下天然香蘭素的產量使用優化后的培養基，pH調至10. 0，選擇溫度為30°C至40°C之間進行優化。由圖4可以看出，當溫度在30°C至40°C之間時，香蘭素的產量逐漸升高，當發酵溫度為40°C時香蘭素的產量最高，此溫度下適宜菌體酶活與菌種生長。再進一步，發酵轉速優選為lOOrpm。(5)不同發酵培養轉速下生產天然香蘭素的產量以優化后的最佳培養基組成、初始pH值、發酵溫度、接種量、底物添加量和底物添加時間為基礎，選擇發酵轉速為lOOrpm、150rpm、200rpm三種轉速進行比較。根據圖5可以看出，當轉速在IOOrpm至200rpm之間時，隨著轉速的增加，香蘭素的產量和轉化率降低。所以當發酵轉速為IOOrpm時,香蘭素的產量最高。再進一步，發酵過程優選為光照條件。(6)發酵過程光照/避光生產天然香蘭素的產量通過對比在光照和避光條件下香蘭素的濃度來確定光照對菌種轉化阿魏酸生成香蘭素的影響。根據圖6可以看出，在光照條件下香蘭素的產量較高。不同發酵培養條件下生產天然香蘭素的產量(I)接種量、底物添加量和底物添加時間對香蘭素產量的影響以優化得到的培養基為基礎，pH調至10. 0，培養溫度為40°C。用正交試驗來優化接種量、底物添加量和底物添加時間，選取L9(34)正交表，其因素和水平設計見表3，試驗結果見表4。由表4的結果及方差分析可見，三個因素對香蘭素產量的影響順序為阿魏酸加入量 > 阿魏酸加入時間> 接種量，即阿魏酸加入量的對香蘭素產量影響最大，接種量對香蘭素產量影響最小。根據表I的結果可知最佳組合為A1B3C3 :接種量5mL，底物添加量20mL，底物添加時間24h。表I.正交設計因素和水平表
水平接種量(％)阿魏酸加入時間阿魏酸加入量 _(h)_(g/L)_I10722.7
220 48 5
_3_2_24__表2.正交設計實驗表和結果分析
權利要求
1.一種食甲醇芽孢桿菌，該菌株名為Bacillus methylotrophicus VJ4-1,保藏編號CCTCC NO :M2012004，食甲醇芽孢桿菌 Bacillus methylotrophicus CCTCC NO M 2012004的生物學特征是是革蘭氏陽性菌，能在10% NaCl中生長，有精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶活性，能產酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水楊素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麥芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸鹽、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸組氨酸、朽1檬酸鹽為碳源的培養基上生長，其16S成應序列與1^0；[11118 methylotrophicus的16S rRNA序列比對相似性達到100%。
2.一種食甲醇芽孢桿菌生物轉化阿魏酸生產天然香蘭素的方法，其方法涉及的步驟如下 (1)斜面培養將食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus CCTCC M2012004接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，在25 35°C、pH5 9條件下，靜置培養24 72h ； (2)制備種子培養液用步驟(I)所得的斜面培養物，接種到種子培養基，在25 35°C條件下，100 150rpm振蕩培養24h 72h，連續轉接I 4次，制得種子培養液； (3)發酵使用步驟(2)所得的種子培養基，按體積百分比2 20%的接種量接入發酵培養基，在30 40°C條件下，100 200rpm振蕩培養24 72h ； (4)轉化使用步驟(3)所得的發酵液，加入5 13.3g/L的阿魏酸，在30 40°C條件下，100 200rpm振蕩培養6 12天后停止。
3.根據權利要求2所述的一種食甲醇芽孢桿菌在是生物轉化阿魏酸生產天然香蘭素的方法，其特征在于所述斜面培養基馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L ;種子液培養基組成為麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。
4.根據權利要求2所述的一種食甲醇芽孢桿菌在是生物轉化阿魏酸生產天然香蘭素的方法，其特征在于所述發酵培養基的組成為碳源5 20g/L，氮源I 3g/L，無機鹽0. 5 I. 5g/L，七水硫酸亞鐵0. 01 0. 05g/L,磷酸氫二鉀0. 5 I. 0g/L、七水硫酸鎂0.5 I. 0g/L，調節 pH 至 6 10。
5.根據權利要求4所述的發酵培養基，其特征在于所述碳源為淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、麥芽浸粉、麩皮和谷殼任選其一。
6.根據權利要求5所述的碳源，其特征在于所述碳源為谷殼。
7.根據權利要求4所述的發酵培養基，其特征在于所述氮源為酵母粉、黃豆餅粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、動物蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨和豆柏任選其一。
8.根據權利要求7所述的氮源，其特征在于所述氮源為谷殼。
9.根據權利要求4所述的發酵培養基，其特征在于所述pH為10，發酵溫度為40°C，發酵轉速為IOOrpm，發酵過程為光照條件。
全文摘要
本發明公開了一種食甲醇芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1，該菌株名為Bacillus methylotrophicus VJ4-1，于2012年1月16日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，其保藏編號CCTCC NOM 2012004，利用該菌株生物轉化阿魏酸生產天然香蘭素的方法。本發明的優點產量較高，方法工藝過程簡單，反應條件溫和，環境污染小，產物濃度較高，提取步驟簡單，生產清潔，產品環境友好，安全可靠。主要原料來源廣泛，成本極為低廉，具有天然性和工業化生產前景。
文檔編號C12N1/20GK102747008SQ20121011390
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者喻林, 宋旭艷, 李丹, 王潔, 羅誠浩, 陳勇, 魏敏 申請人:湖北中煙工業有限責任公司