一種檢測水貂源性成分的擴增引物的制作方法

專利名稱：一種檢測水貂源性成分的擴增引物的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及特種經濟動物水貂源性成分的檢測，尤其涉及水貂基因檢測方法的特異性引物和試劑盒。
背景技術：
水貂在動物分類學中屬于哺乳綱、食肉目、鼬科、鼬屬(Mustela)，在野生狀態下有美洲水紹(Mestela vision)和歐洲水紹(Mustela Iutreola) 2種，目前世界各國人工飼養用于獲取皮毛的水貂均為美洲水貂的后裔(王繼遠，1990)。我國開展毛皮動物相關飼養技術研究始于上世紀50年代，特種經濟動物以其獨特的資源特性、重要的經濟價值和日益增長的市場需求而成為我國農業的新興特色產業。我國是特種經濟動物飼養大國，僅毛皮動物存欄就達3. 28億只。水貂皮、狐皮和波斯羔皮早已成為國際裘皮貿易的三大支柱產品。目前，食品安全問題引起了各國政府和消費者的高度關注，尤其是肉食品、動物飼料安全性等關系人民健康、百姓切身利益的問題得到了廣泛重視。瘋牛病、禽流感、狂犬病、犬瘟熱等在世界各地的蔓延和傳染給人類的事也有發生，目前畜禽肉食品的動物源性成分的鑒別檢測已涉及到肉食品的エ業、進出口貿易、市場及餐飲業等領域。檢驗檢疫部門對檢測高新技術進步的需求日益強烈，在飼料貿易、進出口防疫檢查、肉制品消費市場監瞀等方面表現尤為突出。貂肉作為養殖業的附屬品，常被不法商販用作飼料及肉制品，甚至未經過檢驗檢疫程序，一旦攜帯致病因子，極大地危害了消費者的健康，擾亂了畜產品及肉制品市場秩序。同時，裘皮制品消費市場屬于高端消費項目，在利益驅動，裘皮制品市場以次充好、以假亂真的現象時有發生，有的仿制裘皮產品，用肉眼或者普通方法很難鑒定真偽，由此謀取暴利。水貂作為特種經濟動物的ー種，貂皮是生產各類高檔裘皮制品的原材料，貂心可以入藥，對于治療風濕性心臟病有一定的功效，目前已經有產品如利心丸等市場銷售，此外貂肉一般用作動物飼料，近年來也有加工成食品使用。針對市場上存在以下幾種現象，有必要開發ー種水貂源性成分鑒定的快速、有效方法。隨著裘皮加工手段及毛皮硝染技術的進步，依據感官目測已經很難辨別毛皮真偽，利益驅動下，以人造皮毛、其他廉價的動物皮毛冒充水貂皮毛的現象時有發生；此外，貂心入藥時候，也有不法商家以雞心、兔心等冒充貂心的現象；近年來，羊肉卷市場比較混亂，很多壓制的羊肉卷中摻雜著貂肉、狐貍肉、貉子肉以及其他肉類，從感官上難以去分辨，因此，本研究著重從鑒定水貂源性成分的角度出發，開發研制出ー種分子水平上的檢測試劑盒，具有靈敏度高、特異性好、易操作等優點。研究出一種準確、快速、可靠的鑒別畜禽類動物源性成分，包括鑒定特種經濟動物水貂源性成分的方法，就非常有必要。目前，為了確定食物及飼料的真實成分，已經開發了很多對動物源性成分鑒別的方法，有物理、化學、免疫學和分子生物學等方法。在分子生物學方法中，分子標記技術以其快速、準確、穩定、高效等優點顯示出巨大的開發潛力和廣闊的應用前景。日前在動植物源性成分鑒別檢測中應用的分子標記主要包括核DNA，RNA、線粒體DNA(mtDNA)、和蛋白質分、子標記等。PCR分子標記鑒別檢測技術，具有特異性高、針對性強、靈敏度高、簡便快速、對檢測樣品要求較低，比如無論是經過遠途運輸或低溫保存多年的陳舊樣本，或者經過一定壓力、溫度加工后，只要能夠提取基因組核酸，就都可以用于PCR反應。哺乳動物和禽類mtDNA在遺傳上相對獨立，是雙鏈的超螺旋環狀分子，具有基因組小(約16kb)、沒有重復序列、生物個體內無組織特異性、每個細胞中含有大量線粒體基因組(哺乳動物約1000-2300個拷貝)等特點。因此，用mtDNA分子標記鑒別畜禽肉食品及飼料動物源性成分與核DNA分子標記相比，具 有靈敏度高、精確度好、快速、降解小(加工過程中mtDNA保持較完整)、穩定易操作等優勢。基于動物mtDNA的PCR分子標記技術的上述特點，因此在動物源性成分鑒別檢測中的應用具有廣闊的前景。國外已對牛、綿羊、豬、雞的源性成分進行了研究報道，國內對牛、綿羊、豬、雞、驢、馬、鹿屬、獅、虎、豹等源性成分鑒定進行了研究報道。在用分子生物學方法鑒定檢測動物源性成分的研究上，對水貂源性成分鑒別檢測的研究很少，張麗華等人利用酶切的方法研究了貂心線粒體mtDNA鑒定及特征分析，采用DNA限制性內切酶片段長度多態性(mtDNA-RFLP)分析技術和聚合酶鏈反應(PCR)擴增細胞色素b基因部分序列片段。結果表明新鮮的貂心組織可提取完整的mtDNA，并能擴增出310bp大小的Cytb基因，與雞心臟mtDNA限制性內切酶酶切圖譜有差異。RFLP方法有其優點但是要選取價格低廉有效適合的酶。涂劍鋒等人從當動物種屬分類的角度研究了水貂12SrRNA基因序列測定及鼬屬動物的系統進化關系。張洪海等人對鼬科動物線粒體DNA控制區結構分析，并未進一歩做源性成分的檢測。由干物種特異性PCR方法的簡單性、物種特異性和高度靈敏性，該方法的使用極大地改善和方便了食物、飼料和中藥材中動物源性成分的檢測。與其他分子生物學技術如序列分析、PCR-RFLP或RAPD(RandomAmplified Polymorphic DNA)相比，物種特異性PCR更加便宜、更加快速、更加適合于大多數樣品的常規檢測。基于上述優點，近幾年來研究人員越來越傾向于使用該技術。

發明內容
本發明提供一種檢測水貂源性成分的擴增引物。本發明采取的方案是檢測水貂源性成分的擴增引物核苷酸序列為正向引物5'-CTTCAACCTCAACATCATCACC-3'；反向引物5'-GACATACATTGTATTCATTCTAAGCG-3'。本發明擴增引物與水貂基因組進行PCR擴增反應時，其擴增產物的核苷酸序列如SEQ ID No. I 所述。本發明所述的檢測水貂源性成分的擴增引物用于制備試劑盒。本發明采用擴增引物對水貂DNA樣品進行PCR擴增，并檢測擴增產物。本發明檢測水貂源性成分的方法，具有擴增產物的核苷酸序列如SEQ ID No. I所述的樣品為水貂樣品。本發明檢測水貂源性成分的方法，其PCR反應程序為預變性94°C，3min ;進入循環94°C變性60s，66°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min ;4°C保存
反應產物。
本發明的優點是具有物種特異性PCR方法的簡單性、物種特異性和高度靈敏性，該方法的使用極大地改善和方便了食物、飼料和中藥材中動物源性成分的檢測。與其他分子生物學技術如序列分析、PCR-RFLP 或 RAPD (RandomAmplified Polymorphic DNA)相比，本發明更加便宜、更加快速、更加適合于大多數樣品的常規檢測。


圖I是基因組DNA的電泳檢測結果圖；圖中M marker, I :水貂2 :藍狐3 :銀狐4 :貉子5 :豬6 :雞7 :狗8 :羊；圖2是6對引物分別與水貂基因組PCR擴增結果圖；圖中M marker, 1-6 marker I -mar ker 6分別與水紹基因組進行PCR反應，電泳檢測結果；圖3是特異性引物針對水貂等基因組PCR擴增產物電泳圖；圖中M marker, I :水貂2 :藍狐3 :銀狐4 :貉子5 :豬6 :雞7 :狗8 :羊圖4是靈敏度檢驗試驗電泳圖；圖中M marker, I :水貂基因組原濃度；2_6 :濃度依次稀釋50 %，10 %，I %，0. 5%,0. 1%。
具體實施例方式實施例I水貂源性成分DNA的PCR檢測試劑盒及檢測方法的建立一、水貂源性DNA的PCR檢測弓丨物的設計從GenBank檢索到食肉目鼬科動物線粒體序列相關信息39條，包含鼬屬、貂屬、水獺屬等，本研究參考GenBank中公布的紫貂、貂熊、日本貂、藍狐、銀狐、貉等動物線粒體基因組序列，將序列進行blast序列比對，根據紫貂的物種保守序列、分析特異性位點，利用引物設計軟件primer5. 0設計出鑒別檢測水貂源性成分的PCR特異性引物即只能擴增出水貂DNA特異性片段，擴增不出其它動物DNA限制性片段。I、實驗前期，基于上述原則，設計了六對引物，分別命名minkOl至mink06,并且將設計引物與GenBank中羊、豬、雞線粒體序列進行比對，初歩判斷所設計引物是只針對貂具有特異性，引物委托上海英俊公司代理合成。F(Forward):代表正向引物，R(Reverse):代表反向引物。引物名稱引物序列
MinkOlFCTCCGAGTGATACAAGCGC
MinkOlR_CGTACTGGGAGAAGTTGCTG _
mink02F_TTAACTCCTGAACCCGCC _
mink02R_TGATAGTTGTAATAA AGTTGATGGC _
mink03F_GTGCCTCAATACTATAAATTCATTG_2、引物合成后進行了一系列引物特異性驗證擴增試驗，摸索適宜擴增溫度和反應體系條件，最終確定特異性最好的一條引物，作為試驗用水貂源性檢驗的引物。水貂血液樣本基因組提取，采用blood Genome DNA Pxtraction Kit試劑盒進行基因組DNA的提取,購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D9081。將6對引物分別與水貂基因組進行PCR擴增反應，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，見圖2。實驗結果表明，第5對引物有較強的特異性，可以作為水貂源性成份檢測的特異性引物。引物序列如下正向引物MinkF (22bp)5' -CTTCAACCTCAACATCATCACC-3';反向引物 MinkR(25bp) :5' -GACATACATTGTATTCAT
TCTAAGCG-3';將PCR擴增產物送至上海生エ生物工程有限公司進行序列測定，擴增序列長度為343bp，序列結果如SEQ ID No. I所述。將該序列與Genbank下載序列進行blast比對，對應序列相似度達99%，進ー步說明該擴增片段是水貂源性特異性序列。ニ、水貂源性DNA的PCR檢測試劑盒的構建在獲得的上述特異性引物對的基礎上，設計用于水貂DNA的PCR檢測的試劑盒，試劑盒包括檢測溶液，該檢測溶液中含IOXPCR緩沖液、IOu mol/L正向引物10umol/L反向引物IOu mol/L dNTP :5U/uLTaqDNA聚合酶；其中，所述的正向引物序列為MinkF(22bp) :5' -CTTCAACCTCAACATCATCACC-3';反向引物 MinkR(25bp) :5' -GACATACATTGTATTCATTCTAAGCG-3'；三、水貂源性DNA的PCR檢測方法的建立I、DNA樣品的制備本實施例的DNA樣品制備方法參考《DNA及RNA基本實驗技術》(科學出版社，A.J.哈伍德主編，盛小禹等譯)，具體為(I)樣品制備肌肉樣品稱取約IOOg水貂的肌肉組織切碎，于120°C烘烤過夜，用組織研磨器研磨成粉末狀。血液樣品血液樣品加入2%こニ胺四こ酸ニ鈉(EDTA)抗凝，冷凍保存。飼料粉末樣品可直接用于DNA的提取。
⑵DNA提取血液類試驗樣品，采用blood Genome DNA Pxtraction Kit試劑盒進行基因組DNA的提取，購自寶生物上程(大連)有限公司，貨號D9081。其它組織類和骨粉類樣品采用動物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒進行提取，購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號DP323-03。基因組DNA電泳檢驗見圖I :1 :水貂2 :藍狐3 :銀狐4 :貉子5 :豬6 雞7 :狗8:羊2、PCR 反應(I)反應體系取2ul待測樣品DNA溶液，加入用于水貂DNA的普通PCR檢測的試劑盒中的溶液6. 2ul，再加入滅菌超純水至總體積25uL ;將以上各組分加入至0. 2mL PCR反應管中，5000r/min，離心IOs ;然后按下列條件參數進行PCR擴增。(2)反應條件預變性94°C，3min;進入循環94°C變性60s，66°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;4°C保存反應產物。3、結果判斷擴增產物電泳結果見(圖2),以D2000bp marker對比,在400多bp的位置大小處出現特異性擴增條帶為陽性，沒有特異性擴增條帶為陰性。原理(I)模板DNA的變性模板DNA經加熱至94°C 5min后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下ー輪反應做準備；(2)模板DNA與引物的復性模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至57°C，引物模板DNA單鏈的互補序列配對結合；(3)引物的延伸DNA模板ー引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列DNA序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性ー復性一延伸三個過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下一次循環的模板。4、擴增水貂DNA產物測序序列將水貂PCR擴增產物進行純化后送上海生エ生物工程有限公司進行測序。PCR特異性擴增產物的測序結果如下，測序結果經與GenBank比對分析表明，該序列片段與已發表的紫紹mt-DNA的D-Ioop環區段同源性達到99%。水貂PCR產物測序序列結果如SEQ ID No. I所述。實施例2水貂DNA的PCR檢測方法對肉類和血液樣品中貂源性成分DNA的特異性檢測實驗針對市場中會出現的以水貂肉類冒充羊肉卷的現象，本試驗從特異性弓I物擴增片 段的角度檢測水貂源性成分，以期能夠為檢測羊肉卷中是否摻雜了水貂肉提供一種檢測手段，為質檢部門提供ー種分子檢測手段。市場中購買了羊肉、牛肉、雞肉并提取了基因組備用。肌肉組織提取DNA采用前面提到的試劑盒完成。采用實施例I的含有特異性引物的檢測試劑盒及檢測方法檢測水貂DNA樣品。同時檢測藍狐、貉等其它毛皮動物DNA樣品，以此方法的特異性進行評估。試驗結果表明本發明所設計引物只對水貂DNA的特異性擴增引物，對于試驗中涉及的羊、牛、藍狐、貉子、雞等源性成分基因組DNA沒有特異性擴增條帯，能夠達到檢測水貂源性成分的效果。實施例3水貂源性成分的PCR檢測方法對毛皮中DNA的特異性實驗裘皮制品是高檔消費品，在利益驅使下，不乏有人以次充好甚至使用假冒人造毛皮冒充水貂毛皮，或者以兔皮、狗皮等充當水貂皮，經過一系列加工普通肉眼很難辨認清 楚，唯有通過進一歩的實驗手段能夠有效鑒別區分。本實驗設計如下，選取幾種動物毛皮，采用毛皮中提取基因組DNA的方法提取DNA，分別獲取了貂皮、狐貍皮、貉子皮、狗皮以及兔皮基因組DNA，采用實施例I中的試劑盒和方法進行特異性條帶檢驗，實驗結果表明上述結果可證明弓I物僅對水貂特異。實施例4水貂DNA的PCR檢測方法靈敏度實驗將制備的水貂基因組DNA進行梯度稀釋，分別稀釋至100%，50%，10%，1 %，
0.5%,0. I %，按照實施例I中的試劑盒和方法對該稀釋的溶液DNA用于進行檢測靈敏度分祈。按照實施例I提供的PCR擴增條件進行試驗，結果如圖4所示。實驗結果表明，分析檢出限為5ng。
權利要求
1.一種檢測水貂源性成分的擴增引物，其特征在于，其核苷酸序列為 正向引物5' -CTTCAACCTCAACATCATCACC-3'； 反向引物5' -GACATACATTGTATTCATTCTAAGCG-3'。
2.如權利要求I所述的檢測水貂源性成分的擴增引物，其特征在于，與水貂基因組進行PCR擴增反應時，其擴增產物的核苷酸序列如SEQ ID No. I所述。
3.含有權利要求I所述的檢測水貂源性成分的擴增引物的試劑盒。
4.一種檢測水貂源性成分的方法，其采用權利要求I所述的擴增引物對水貂DNA樣品進行PCR擴增，并檢測擴增產物。
5.如權利要求4所述的檢測水貂源性成分的方法，其特征在干，具有擴增產物的核苷酸序列如SEQ ID No. I所述的樣品為水貂樣品。
6.如權利要求4或5所述的檢測水貂源性成分的方法，其特征在于PCR反應程序為預變性94°C，3min ;進入循環94°C變性60s，66°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min ;4°C保存反應產物。
全文摘要
本發明涉及一種檢測水貂源性成分的擴增引物，屬于特種經濟動物水貂源性成分的檢測。其核苷酸序列為正向引物5′-CTTCAACCTCAACATCATCACC-3′；反向引物5′-GACATACATTGTATTCATTCTAAGCG-3′。具有物種特異性PCR方法的簡單性、物種特異性和高度靈敏性，該方法的使用極大地改善和方便了食物、飼料和中藥材中動物源性成分的檢測。與其他分子生物學技術相比，本發明更加便宜、更加快速、更加適合于大多數樣品的常規檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102643912SQ20121010545
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月11日 優先權日2012年4月11日
發明者劉晗璐, 孫偉麗, 張海華, 李光玉, 王夕國, 蔣清奎, 趙家平 申請人:中國農業科學院特產研究所