專利名稱：對嗜肺軍團菌O5型的wzt基因特異的核苷酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種核苷酸及其應用，尤其涉及一種對嗜肺軍團菌血清型5型 (Legionella pneumophila serogroup 05)的 wzt (LPS O-抗原的 ABC 轉運子，ABC transporter of LPS 0-antigen,以下簡稱wzt)基因特異的核苷酸及其應用。
背景技術：
軍團菌最初是在美國發現的，是一種的無芽胞革蘭氏陰性桿菌，對自然環境因素抵抗力較強，主要是引起呼吸道傳染疾病，可通過氣溶膠的方式在空氣中散布，人類會因為吸入含菌的氣溶膠而感染，引起軍團病(Legionnaires disease, LD)。目前已知軍團菌有52個種70多個血清型，能引起人類疾病的約有20種。常見的有嗜肺軍團舊(XegionellapneumophiIa，LP )、米氏軍團鬼{Legionella micdadei )> 博氏軍團菌QLegionella bozemanii)、菲氏軍團菌QLegionellafeeleii)、杜莫夫軍團菌 (.Legionella)和長灘軍團菌(Z6^io/ <977a Iongbeachae')等。其中嗜肺軍團菌與人類疾病關系最為密切。根據O-抗原的不同，嗜肺軍團菌可分為15個血清型。其中大約有70%的軍團菌感染是由嗜肺軍團菌01引起的，20-30%是由其它血清型引起的，非嗜肺軍團菌導致約5-10%的軍團菌感染。嗜肺軍團菌為需氧革蘭陰性桿菌，兼性胞內寄生菌，無莢膜，不產酸，不產氣，有一根至數根側鞭毛或端鞭毛，可運動，菌體長2-50 μ m，寬0.5-1 μ m。該菌生長營養要求較高，生長時需要半胱氨酸，甲硫氨酸和鐵離子等，在活性炭-酵母浸出液瓊脂(BCYE)培養基上可生長，在GVPC平板上呈灰白色，邊緣有紫藍色光澤，挑起有拉絲；在含2.5 % -5.0 %的CO2環境中生長很好，厭氧條件下不生長。最適溫度為35 V - 36°C，具有一定的耐酸性和耐熱性菌落顏色一般呈灰白色、紫色、藍色或綠色，但在普通血平板、普通瓊脂或巧克力瓊脂上不生長。嗜肺軍團菌在普通自來水中可存活400天以上，在60°C左右甚至在火山口附近的水塘里都能發現軍團菌的蹤跡。我國報告的病例多是嗜肺軍團菌血清01型、05型、06 型。在歐美各國嗜肺軍團菌肺炎占肺炎病例中的2. 4 %-8.4 %。隨著分子技術特別是PCR技術的發展，許多分子生物學方法被用于軍團菌分子分型和流行病學研究。目前已用于軍團菌分型的4種常用分子分型技術為隨機擴增多態性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、脈沖場凝膠電泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE)、擴增片段長度多態性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)、核酸測序分型(Sequence-based typing, SBT)。由于其一次即可分離出大量DNA片段，且具有操作簡便，重復率好等優勢，先后用于軍團菌分子分型和流行病學調查。聚合酶鏈式反應技術(Polymerase chain reaction,簡稱PCR技術)作為微生物檢測的技術目前正在得到認同和推廣，該技術相對于傳統的方法有高通量、檢測速度快、特異性強、靈敏度高等優點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備細菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導下的PCR過程中擴增目標序列，達到檢測樣品中是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴增過程僅需2個小時。這對檢驗檢疫部門和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。
發明內容
本發明的目的在于提供一種對嗜肺軍團菌血清型05型的wzt基因特異的核苷酸， 所述核苷酸為
O SEQ ID NO: I所示的核苷酸和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸；
2)與I)所示的核苷酸互補的核苷酸。上述核苷酸可以用于制備檢測嗜肺軍團菌血清型05型的wzt基因的PCR試劑盒、 基因芯片或微陣列；所述嗜肺軍團菌血清型05型可以取樣于自來水、礦泉水、空調冷卻水的培養物的粗提液，或是嗜肺軍團菌血清型05型的純培養物的粗提液等。其中所述取樣于自來水、礦泉水、空調冷卻水培養物的嗜肺軍團菌血清型05型粗提液指的是采用常規方法制備獲得。其中所述嗜肺軍團菌血清型05型的純培養物的粗提液指的是采用常規方法制備獲得。本發明還提供一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述 PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物優選為如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸。SEQ NO: I ATAATAAAGCAAGCCTTGAT特異擴增嗜肺軍團菌血清型05型的基因上游引物
SEQ NO: 2 TTCTGGATGAAAACCAGTC特異擴增嗜肺軍團菌血清型05型的wzt基因下游
引物
上述多重PCR檢測試劑盒可以包括如下試劑10 mM dNTP 20 μ L ; 10X酶特異性反應緩沖液50 μ L ;5 U/μ L耐熱DNA聚合酶8 μ L ;引物各10 μ L ;陽性對照品10 μ L，陰性對照 Ftn 10 μ L ； ddH20 5mL。上述針對嗜肺軍團菌血清型05型的PCR試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預處理一擴增一電泳檢測結果。引物和PCR反應體系所需要的試劑已預先加入擴增管中，使用者只需將預處理后的樣本加入擴增管啟動擴增反應即可，簡單快速的完成檢測工作。本發明還提供一種基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸優選為如SEQ ID N0:1和/ 或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。本發明還提供一種微列陣，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸優選為如SEQ ID NO: I和/或SEQ ID NO: 2所示的核苷酸。由上述的技術方案可見，本發明建立的一種PCR反應體系，可檢測嗜肺軍團菌血清型05型，該試劑盒有如下優點
(I)方法簡便，周期短、速度快、可操作性強本發明所配制的PCR試劑盒配制方法簡便，檢測速度快、周期短，可操作性強，易于產業化生產，而檢測成本卻較低，市場應用前景廣。本發明PCR試劑盒若用嗜肺軍團菌5型的菌懸液進行PCR擴增，與經提取得到的DNA
4作為模板擴增所得結果一致，且敏感度和特異性無差別，可省去模板DNA的提取步驟，使操作方法得以簡化。同時，相比常規生化檢測方法而言，本方法所采用的待測樣品可以直接是臨床樣品培養液，或者對檢測樣品進行簡單分離培養就可進行檢測，因而節省了物力人力。(2)檢測靈敏度高本發明提供的PCR檢測試劑盒及其檢測方法敏感性高，檢測精度高，可以檢測到Ing/μ L的DNA模板。對常見致病菌可以進行全面、系統、準確的檢測與鑒定。(3)檢測成本相對較低可以推廣應用于食品衛生監督、環境監測、商品檢驗檢疫等領域，并為其他不同致病菌檢測組合提供技術模式。(4)準確性高本發明根據嗜肺軍團菌05型的wzt基因的特異核苷酸序列，設計出引物。從而利用弓I物組合成復合PCR檢測體系，能夠直接將嗜肺軍團菌血清型05型和其他近源菌分開。
圖I為本發明的試劑盒檢測結果圖，其中1為待測樣品，檢測到病原菌；Ρ為陽性對照品；Ν為陰性對照品；Μ為DL2000 DNA marker ；
圖2為本發明試劑盒檢測嗜肺軍團菌其他血清型標準菌株電泳結果圖，其中1，嗜肺軍團菌05型G3408 ;2，嗜肺軍團菌02型G2773 ;3，嗜肺軍團菌03型G2772 ;4，嗜肺軍團菌 04型G2781 ;5，嗜肺軍團菌01型G2756 ;6，嗜肺軍團菌06型G2771 ;7，嗜肺軍團菌07型 G3410 ;嗜肺軍團菌08型G2820 ;9，嗜肺軍團菌09型G2774 ;10，嗜肺軍團菌010型G2818 ； 11，嗜肺軍團菌011型G2824 ;12，嗜肺軍團菌012型G2822 ; 13，嗜肺軍團菌013型G2819 ； 14，嗜肺軍團菌 014 型 G2817 ;15，嗜肺軍團菌 015 型 G2829 ；M, DL2000 DNA marker ；
圖3為本發明試劑盒檢測軍團菌屬非嗜肺軍團菌電泳結果圖，其中1，嗜肺軍團菌05 M G3408 ；2, Legionella anisa ；3, Legionella longbeachae ；4, Legionella micdadei ； 5, Legi onella wal ter si i ；6, Legi onella s tei gerwal ti i ；7, Legi onella bozemani i ；8, Legionella gormanii ；M, DL2000 DNA marker ；
圖4為本發明檢測軍團菌屬臨床菌株電泳結果圖，其中1，嗜肺軍團菌05型G3408; 2，嗜肺軍團菌05型G2765 ;3，嗜肺軍團菌I型G2759 ;4，嗜肺軍團菌I型G2760 ;5，嗜肺軍團菌2型G2761 ;6，嗜肺軍團菌3型G2762 ;7，嗜肺軍團菌7型G2763 ;8，嗜肺軍團菌7型 G2764 ；M, DL2000 DNA marker ；
圖5為本發明試劑盒檢測其它種屬近源菌種標準菌株電泳結果圖，其中1，嗜肺軍團菌 05 型 G3408 ；2, Salmonella ；3, Shigella. Dysenteriae ；4, Staphylococcus aureus ； 5, Yersinia en terocoli tica ；6, Pseudomon asaeruginosa ； 7, Aeromonas hydrophila ；M, DL2000 DNA marker
具體實施例方式
為保證本發明的上述和其它目的特征和優點更明白易懂，下面特舉較佳實施例，同時結合說明書附圖及具體實例對本發明進一步詳細描述。實施例I :
基因組的提取
(I)在超凈工作臺中，從菌種保藏管中吸取少量菌液，劃線接種到軍團菌BCYE生長平板上，37。C，5. 0% CO2 培養 5-7 天；(2)向BCYE生長平板中加入2mL無菌水，用無菌圓頭玻璃棒輕輕刮起菌苔，然后將菌懸液吸到I. 5mL離心管中，8000rpm離心5分鐘,棄上清,重復洗一次；
(3)加入250μ L 50mM Tris-HCl緩沖液(ρΗ8· O)重懸，12000rpm離心5分鐘，棄上清；
(4)加入250 μ L 50mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ8· O)重懸，再加 10 μ L O. 45Μ EDTA (ρΗ8. O)，充分懸浮，37°C溫浴20分鐘；
(5)加入10μ L 20mg/mL溶菌酶，37°C溫浴20分鐘；
(6)加入1.5yL20mg/mL蛋白酶K，輕柔混勻；
(7)加入15μ L 10%SDS, 50°C水浴2小時至溶液澄清，期間輕輕顛倒混勻若干次；
(8)力口2 μ L 20mg/mL RNAse，65°C水浴 30 分鐘；
(9)用剪去尖頭的槍頭將上述溶液移到新的潔凈離心管中；
(10)在通風櫥中加入250μ L苯酚氯仿:異戊醇(25 24 :1)，充分混勻，12000rpm，4°C 離心10分鐘，上清液轉移到新的離心管，重復一次；
(11)在通風櫥中加入250μ L氯仿:異戊醇(24 :1)，充分混勻，12000rpm，4°C離心10分鐘，上清液轉移到新的離心管；
(12)加入2.5倍體積的提前預冷的無水乙醇，輕搖，于_80°C沉淀DNA。12000rpm，4°C 離心15min ；
(13)用lmL70%冰乙醇洗滌DNA沉淀，然后在65°C，IOmin烘干；
(14)用30 μ L TE溶解，并于-20 ° C冰箱備用。用I. O %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，同時用NanoDrop2000 OD儀測量 DNA的純度和濃度。實施例2
引物的設計
嗜肺軍團菌血清型05型的O抗原基因簇序列是本實驗室自測的，通過比對分析，選取 wzt基因作為該菌的特異靶基因，針對嗜肺軍團菌05型的wzt基因的特異區設計引物；如表I所示，上游引物是5’- ATAATAAAGCAAGCCTTGAT _3’，見序列SEQ ID NO: I ;下游引物是 5’ - TTCTGGATGAAAACCAGTC _3’，見序列 SEQ ID NO: 2。表I嗜肺軍團菌血清型05型的特異引物序列
I腦稱引輕|編號SEQ IDmmi do_軍團菌05 I 型P-INO: IATMTAMGCMCCCTTCATP-2NO: 2TTCTCGATGMMCCAGTC
實施例3
特異引物的篩選
收集了 I株嗜肺軍團菌05型標準菌株，14株嗜肺軍團菌其它血清型的標準菌株、7株軍團菌屬其他菌株、I株嗜肺軍團菌05型臨床分離株、6株軍團菌屬其它血清型臨床分離株以及6株近緣菌驗證引物的特異性，菌株編號和來源見下表2。表2供試的標準菌株
權利要求
1.一種對嗜肺軍團菌血清型05型的WZt基因特異的核苷酸，其特征在于所述核苷酸具有1)SEQ ID NO :I所示的核苷酸和/或SEQ ID NO :2所示的核苷酸；2)與I)所示的核苷酸互補的核苷酸。
2.—種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物為如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。
3.權利要求I所述的試劑盒，其中的SEQNO: I ATAATAAAGCAAGCCTTGAT為特異擴增嗜肺軍團菌血清型05型的wzt基因上游引物；SEQ NO:2 TTCTGGATGAAAACCAGTC為特異擴增嗜肺軍團菌血清型05型的wzt基因下游引物。
4.權利要求I所述的試劑盒，還包括如下試劑10mM dNTP 20 μ L ；10Χ酶特異性反應緩沖液50yL;5 U/μ L耐熱DNA聚合酶8 μ L ;引物Pl和Ρ2各10 μ L ;陽性對照品 10 μ L,陰性對照品 10 μ L ;ddH20 5mL。
5.一種基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。
6.權利要求I所述PCR試劑盒在制備用于檢測嗜肺軍團菌血清型05型方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種對嗜肺軍團菌血清型O5型的wzt基因特異的核苷酸及其應用，所述核苷酸為SEQIDNO:1所示的核苷酸和/或SEQIDNO:2所示的核苷酸；與上述的核苷酸互補的核苷酸。這些核苷酸可用于制備檢測嗜肺軍團菌血清型O5型的PCR試劑盒、基因芯片或微陣列。本發明的對嗜肺軍團菌血清型O5型的wzt基因特異的核苷酸及包含該核苷酸的PCR試劑盒、基因芯片或微陣列的實用性強，PCR試劑盒配制方法簡便，檢測周期短、速度快，可操作性強，易于商品化生產，而檢測成本卻相對較低；準確性高；靈敏度高。
文檔編號C12Q1/68GK102604945SQ201210105278
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者馮露, 周光朋, 姚芳芳, 曹勃陽, 王磊, 高旗利 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心, 天津生物芯片技術有限責任公司