專利名稱：一種高效提取桑樹根圍土壤微生物總dna的方法
技術領域：
本發明涉及分子生態學技術領域，具體涉及ー種桑園土壌微生物總DNA的提取方法。
背景技術：
長期以來，有關土壤微生物的多祥性研究是通過分離培養來實現的。然而，絕大多數微生物種群尚不能實現純培養，這成為土壤微生物多祥性研究的一個限制性因素。隨著土壌微生物群落結構研究的不斷深入，借助現代分子生物學技術的研究方法如PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-DGGE等避免了傳統研究方法不能全面獲取土壤微生物多樣性信息的缺陷，可以通過土壤微生物DNA表現出的多樣性，真實地反映土壤微生物種群結構情況，而土壤微生物群落基因組總DNA的高效、高品質提取，是從分子生物學水平對土壤微生物群落結構進行研究的前提條件。由于土壤理化成分復雜，常含有腐殖酸、酚類化合物、重金屬離子等影響DNA分子操作的物質，土壤樣品處理和實驗條件較復雜，耗時長，以致從土壤環境中獲得高純度微生物基因組DNA具有一定難度，DNA提取技術創新因此備受關注。目前已經報道了多種土壤微生物總DNA提取方法。從土壤提取微生物總DNA的方法大致分為兩類直接提取法和間接提取法。間接法提取的DNA純度高，但其缺點是得到的細菌只占總菌群的25% 50%，而直接法提取的DNA超過細菌總DNA的60%。直接法由于能夠提取到較全的細菌DNA、省力、DNA產量高，因而發展很快。Tsai等使用SDS和溶菌酶裂解細胞提取總DNA，Tiedje等使用PVP (聚こ烯吡咯烷酮)和CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)去除腐殖酸，效果很好，Bourrain等人采用該方法從活性污泥中提取了 DNA，Reddy等人從堆肥中提取了 DNA。桑園土壤微生物的多祥性及生命活動與桑園土壤結構的形成和改良、土壌肥力演變、桑樹根部病害的發生、桑樹營養物質供給和植株生長發育等密切相關，但目前尚未見應用免培養法研究桑園土壤微生物多祥性的報道。
發明內容
本發明是基于建立桑樹根圍土壌微生物群落結構的分子生態學試驗技術體系，借鑒已有的土壌微生物總DNA的提取方法，提供一種高效的可直接用于PCR分析的桑園土壤微生物總DNA提取方法。為實現上述目的，本發明公開了如下的技術方案一 .材料選擇供試土壤于2011年3月7日采自湖北省農業科學院經濟作物研究所生產桑園(東經114° 19'，北緯30° 29'，海拔29m)的桑樹根圍，桑樹品種為湖桑32號。采集土壤為黃粘土，采樣深度為5 IOcm表土層，按5點法取樣，混勻后放入無菌袋中，4°C保存，24h內完成土壌微生物基因組總DNA的提取。ニ.試劑選擇
本發明采用的主要試劑中十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚こ烯吡咯烷酮K30(PVP K30)、聚こニ醇8000 (PEG8000)、脲、去離子甲酰胺均購自華美生物工程有限公司；溶菌酶、蛋白酶均購自Sigma公司；硝酸銀購自中國人民解放軍第九五零九エ廠；ADNA/HindIII digest DNA Marker,2000DL DNA Marker 和 Taq HS 均購自大連寶生物工程有限公司；16SrDNA通用引物由上海英駿生物工程有限公司合成；土壤提取試劑盒 E.Z.N.A. Soil DNA Kit (50)購自 Omega 公司。三.土壤微生物總DNA直接裂解方法方法一 CTAB-蛋白酶-SDS-反復凍融法取5g 土樣，向其中加入 13. 5mL DNA 提取液 I (Tris-HCl I OOmmo I/L, EDTAIOOmmoI/L, Na3PO4 IOOmmoI/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB ；pH 8. O)和少許石英砂，漩渦振蕩器振蕩3min ;再加入20mg/mL蛋白酶K15 μ L，混勻，37°C、230r/min搖床中溫育Ih ;加入
I.5mL 10% SDS,65°C水浴Ih ;反復凍融3次,8500r/min離心IOmin ;取上清液,加入等體積的酹/氯仿/異戍醇(體積比25 : 24 : I)抽提，8500r/min離心IOmin ;取上清液,カロ入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24 I)再次抽提，8500r/min離心lOmin，取上清液，備用。方法ニ PVP預處理-CTAB-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反復凍融法取5g 土樣加入20g/L偏磷酸鈉緩沖液(含10g/L PVP-K30 ；pH 8. 5) 30mL,搖床振蕩15min,8500r/min離心5min,取沉淀，重復洗漆3次；取沉淀，加入13. 5mL DNA提取液 I (Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L，Na3PO4 100mmol/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB ；pH 8. O)和少許石英砂，漩渦振蕩器振蕩3min ;加入100mg/mL溶菌酶150 μ L，混勻，37°C、230r/min搖床中溫育Ih ;再加入20mg/mL蛋白酶K15 μ L，混勻，37°C水浴Ih ;加入I. 5mL10% SDSJS1O水浴Ih ;反復凍融3次,8500r/min離心IOmin ;取上清液,加入等體積的酹/氯仿/異戍醇(體積比25 24 I)抽提，8500r/min離心IOmin ;取上清液,加入等體積的氯仿/異戍醇(體積比24 I)再次抽提，8500r/min離心IOmin,取上清液,備用。方法三PVP預處理-CTAB、CaCl2, BSA-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反復凍融法取5g 土樣加入20g/L偏磷酸鈉緩沖液(含10g/LPVP-K30 ；pH 8. 5) 30mL,搖床振蕩15min,8500r/min離心5min,取沉淀，重復洗漆3次；取沉淀,加入13. 5mL DNA提取液II (Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L，Na3PO4 100mmol/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB,2% CaCl2,1 μ g/mL BSA ；pH 8. 0)和少許石英砂，漩渦振蕩器振蕩3min。后續操作與方法ニ相同。方法四CTAB、PVP、CaCl2、BSA_溶菌酶、蛋白酶-SDS-反復凍融法取5g 土樣，加入 13. 5mL DNA 提取液 III (Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L,Na3PO4 IOOmmoI/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB, 2% CaCl2,1 μ g/mL BSA,2% PVP ；pH 8. 0)和少許石英砂，鏇潤振蕩器震蕩3min ;加入150 μ L 100mg/mL溶菌酶、15 μ L 20mg/mL蛋白酶K，混勻，37°C、230r/min搖床中溫育lh。后續操作與方法二相同。方法五CTAB、CaCl2, BSA-溶菌酶、蛋白酶_SDS、PVP-反復凍融法取5g 土樣，加入 13. 5mL DNA 提取液 II (Tris-HCl IOOmmoI/L, EDTA IOOmmoI/L, Na3PO41OOmmoI/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB, 2% CaCl2,1 μ g/mL BSA ；pH 8. 0)和少許石英砂，鏇潤振蕩器振蕩3min ;加入100mg/mL溶菌酶150 μ L、20mg/mL蛋白酶K15 μ L,混勻，37°C、230r/min 搖床中溫育 Ih ;加入 I. 5mL 10% SDS 和 O. 3g PVP，混勻，65°C水浴 Ih ;反復凍融3次。后續操作與方法二相同。方法六試劑盒法采用Omega公司的土壤提取試劑盒E.Z.N.A. Soil DNA Kit (50)進行提取。四.土壤微生物總DNA沉淀方法方法一異丙醇沉淀法在上清液中加入O. 7倍體積異丙醇和O. I倍體積NaAc，_20°C放置過夜，8500r/min,4°C離心20min,沉淀用70%こ醇洗漆，12500r/min離心IOmin,沉淀室溫晾干，加入200 μ LTE溶解沉淀，_20°C保存。方法ニ PEG8000沉淀法在上清液中加入O. 5倍體積25% PEG 8000和O. I倍體積5mol/LNaCl，4°C放置過夜,8500r/min, 4°C離心20min,沉淀用70 %こ醇洗漆，12500r/min離心IOmin,沉淀室溫晾干，加入200 μ LTE溶解沉淀，_20°C保存。五.土壤微生物總DNA的質量檢測I. DNA的純度和定量檢測用紫外分光光度計測量DNA溶液的D (230nm)、D (260nm)、D(280nm)值，根據公式dsDNA = D(260nm) X稀釋的倍數X50計算DNA的質量濃度(ng/μ L)，換算出每克土提取的 DNA 量，且根據 D (260nm) /D (230nm)、D (260nm) /D (280nm)檢測DNA的純度。同時用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。2. 16SrDNAV3片段PCR 以提取的桑園土壤微生物總DNA為模板直接進行PCR。正、反向引物分別為GC-F341(5' -CGCCCGCCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGGGCACGGGGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3/ )和 R518(5' -ATTACC GCG GCT GCTGG-3')。反應體系10XPCR buffer(*Mg2+)3yL，2.5mmol/L dNTPs 2. 4 μ L，10 μ mol/L 上、下游引物各
O.6 μ L，Taq 酶 1U，模板 DNA 30ng，最后加 ddH20 至 30 μ し PCR程序:94°C預變性 5min ；94°C變性lmin,退火Imin, 72 °C延伸Imin, 36個循環(退火溫度從65 °C 55 °C,姆ー循環降低
O.5°C，隨后15個循環保持55°C ) ;72°C最終延伸7min。PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。重復三次。3.變性梯度凝膠電泳分離16SrDNA V3片段PCR產物應用JY-TD331變性梯度凝膠電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)分離PCR產物。取15yL PCR產物，加入
10μ L6X loading buffer進行變性梯度凝膠電泳(DGGE),電泳條件8%聚丙烯酰胺，電泳緩沖液為1XTAE，50% 80%變性劑(尿素和去離子甲酰胺)，溫度60°C，電壓100V，電泳時間17h。電泳結束后銀染顯色。六.結果分析I.桑樹根圍土壤微生物總DNA提取方法的初步篩選采用5種不同的細胞裂解方法和2種DNA沉淀方法進行組合，從而得到8種不同的直接提取桑樹根圍土壤微生物總DNA的方法，并以試劑盒法提取的桑樹根圍土壤微生物總DNA為參照，利用紫外分光光度法測定其D (230nm)、D (260nm)、D (280nm)值。以D (260nm) /D (280nm)代表DNA的純度與質量，以D (260nm)/D (230nm)代表DNA中腐殖酸污染的程度。表I數據顯示了不同提取方法的效果。 方法2以CTAB-蛋白酶-SDS-反復凍融裂解細胞，獲得DNA產率較高，但是腐殖酸污染嚴重；方法3、4、5、6在方法2的基礎上均采用2%偏磷酸鈉緩沖液(含1% PVP-K30 ；PH8. 5)預洗滌，使微生物從土壤中充分釋放，以期提高DNA產率，但方法3、6并未達到理想效果，方法4、5效果較好，且對去除腐殖酸則起到了一定作用。其中，方法4和方法5在方法2的基礎上進一步采用BSAXaCl2去除腐殖酸，使得DNA的純度有所提高，腐殖酸的污染程度有所降低。方法8、9省去了 PVP預處理，PVP在其后的裂解步驟中加入，但影響并不大。試劑盒提取的DNA純度高，腐殖酸污染程度低，但是，DNA產率低，且試劑盒價格昂貴。由圖I可知，不同方法提取的DNA的分子質量都在23kb以上，是基因組DNA，且DNA未被打斷，均為大片段DNA，可用于后續的分子生物學分析。綜合考慮DNA純度與質量、腐殖酸污染程度和產率，方法4、5、8、9結合物理、化學、生物3種方法裂解細胞，在DNA提取液中添加PVP、BSA、CaCl2進ー步去除腐殖酸，省去繁瑣的預洗滌步驟，獲得的DNA產率高于
11.2 μ g/g, D (260nm) /D (230nm)大于 2. ll，D(260nm)/D(280nm)大于 I. 71，在純度和腐殖酸污染程度上都達到了直接進行PCR的要求。表I幾種桑樹根圍土壤微生物總DNA提取方法的比較
權利要求
1.一種高效提取桑樹根圍土壌微生物總DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟 采用CTAB、PVP、CaCl2、BSA-溶菌酶、蛋白酶-SDS-反復凍融法；取5g桑樹根圍土樣，カロ入13. 5mL DNA提取液III和少許石英砂,鏇潤振蕩器震蕩3min ;加入150 μ L 100mg/mL溶菌酶、15yL 20mg/mL蛋白酶K,混勻，37°C、230r/min搖床中溫育Ih ;再加入20mg/mL蛋白酶K 15μ L，混勻，37°C水浴Ih ;加入I. 5mL 10% SDS，65°C水浴Ih ;反復凍融3次，8500r/min離心IOmin ;取上清液，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提，酚/氯仿/異戊醇體積比25 : 24 : l,8500r/min離心IOmin ;取上清液,加入等體積的氯仿/異戍醇再次抽提,氯仿/異戊醇體積比24 l,8500r/min離心lOmin，取上清液；在上清液中加入O. 5倍體積25% PEG 8000 和 O. I 倍體積 5mol/L NaCl，4°C放置過夜，8500r/min，4°C離心 20min，沉淀用70%こ醇洗滌，12500r/min離心lOmin，沉淀室溫晾干，加入200 μ L TE溶解沉淀，-20°C保存；即獲得桑樹根圍土壌微生物總DNA。所述 DNA 提取液 III 成分為 Tris-HCl IOOmmoI/L, EDTA IOOmmoI/L, Na3P04 IOOmmoI/ L，NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB,2% CaCl2,1 μ g/mL BSA,2% PVP ；pH 8. O ；pH 8. O 所述的土樣，采自采樣桑樹根圍土壤深度為5 IOcm表土層,按5點法取樣,混勻后放入無菌袋中，4°C保存。
2.如權利要求I所述的提取DNA的方法的用途，其特征在于該方法在進行16SrDNA的擴增及DGGE圖譜分析，與RDP數據庫中已有的序列進行比對，或通過建立新的序列探針識別未知菌，從而確定微生物群落結構組成、結構多樣性及其生態功能。
全文摘要
本發明公開了一種高效提取桑樹根圍土壤微生物總DNA的方法，利用CTAB、溶菌酶、蛋白酶和SDS共同作用以裂解細胞的同時對其反復凍融，獲得了良好的細胞裂解效果，利用PVP、CaCl2、BSA去除腐殖酸，PEG8000沉淀DNA，獲得的DNA純度高。所用方法簡單方便，不經純化即可用于后續的PCR分析和DGGE分析。提取的DNA純度達到直接進行后續分子生物學研究的需要，提取的DNA片段可進行16SrDNA的擴增及DGGE圖譜分析，并可對DGGE譜帶的特異條帶切膠回收、堿基測序，與RDP數據庫中已有的序列進行比對，或通過建立新的序列探針識別未知菌，從而確定微生物群落結構組成，為今后研究桑樹根圍土壤微生物群落結構多樣性與生態功能奠定基礎。
文檔編號C12N15/10GK102643796SQ20121009683
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月5日 優先權日2012年4月5日
發明者于翠, 葉楚華, 彭波, 李勇, 熊超, 胡興明, 鄧文 申請人:湖北省農業科學院經濟作物研究所