專利名稱：一種蘿卜為原料制作適宜惡疫霉菌產生孢子囊的培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物保護領域中ー種植物病原菌惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)
產孢子囊的培養基。
背景技術：
惡疫霉(Phytophthora cactorum Schroet),屬卵菌門疫霉屬病原菌,是全世界范圍內廣泛分布的重要植物病原菌，能侵染約60個科、50個屬中的約200種植物。惡疫霉菌通常以菌絲體和卵孢子在病殘體和土壌中越冬。翌年條件適合時菌絲直接侵染寄住，或形成大量游動孢子囊傳播到地上部侵染莖葉。孢子囊在該病的傳播和蔓延中起著非常重要的作用。通常，在室內進行致病力測定或其它相關生物學特性研究均需要制備孢子懸浮液。目前，誘導惡疫霉產生孢子囊的方法主要采用菌絲水培法，主要方式有(I)將培養好的菌絲體置于裝有消毒土壌浸出液或滅菌蒸餾水的皮氏培養液中，再將培養皿置于熒光燈下照射3天，每天振蕩皿液3次，第三次補充液體，并在8°C下培養2小時使游動孢子釋放。(2)從菌落邊緣切取菌絲塊放入15ml 10% V6培養液的培養皿中，置于25°C、黑暗中培養3d，然后將菌絲挑入倒有15ml滅菌蒸餾水的培養皿內，置于25°C下光照3d，每天換水I次。孢子囊產生后將盛有大量孢子囊的培養皿放入4°C冰箱中15min后，移至25°C下靜置20min，誘使大量游動孢子產生。各種水培法在實施過程中試驗步驟較多，稍微操作不當就會被雜菌污染，影響試驗進程。因此，迫切需要一種篩選出一種培養基，使惡疫霉能在該培養基上產生大量孢子囊用于相關研究。
發明內容
本發明的目的是提供ー種使惡疫霉菌產生孢子囊的培養基。本發明克服了目前利用惡疫霉菌菌絲水培法誘導產生孢子囊容易被雜菌污染的缺點，提供了ー種直接在培養基上培養產生孢子囊的方法。本發明的技術方案是利用蘿卜(Raphanus sativus L.)為原料制作培養基用于惡
疫霉產生孢子囊。以蘿卜為原料制作適宜惡疫霉菌產生孢子囊的培養基，具體制作方法為，取100-200克蘿卜，切碎后于0. 5L水中煮沸30分鐘過濾，濾液中加入15g瓊脂，加熱使瓊脂融化后定容至I升，分裝后以0. 103MPa、121C、高壓蒸氣滅菌20min ;將滅菌培養基到入滅菌的9cm直徑培養皿中制成平板，冷卻后用直徑5mm的打孔器在已培養3d的菌落邊緣打取菌塊接種于培養基上。將接種后的培養皿置于25°C下黑暗培養10天后便產生大量孢子嚢。本發明的有益效果是直接在蘿卜培養基上培養就能產生大量孢子囊，減少了利用水培法誘導產生孢子囊的操作過程中污染的幾率。另外，該培養基原材料成本低廉且容 易獲取，培養基的制作和孢子囊產生的程序簡單易學，且這種方法可以用于孢子囊形態的鑒定、惡疫霉菌致病力測定或抗藥性突變體篩選中孢子懸浮液的制備等相關的研究，具有較高的實際應用價值。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例一蘿卜瓊脂培養基與其它培養基產孢子囊能力差異比較I、培養基制作(I)蘿卜培養基(100g/L):取IOOg蘿卜，切碎后于0.5L水中煮沸30分鐘過濾，濾液中加入15g瓊脂粉，加熱使瓊脂融化后定容至I升。(2)蘿卜培養基(150g/L):取150g蘿卜，切碎后于0.5L水中煮沸30分鐘過濾，濾液中加入15g瓊脂粉,加熱使瓊脂融化后定溶至I升。(3)蘿卜培養基(200g/L):取200g蘿卜，切碎后于0. 5L水中煮沸30分鐘過濾，濾液中加入15g瓊脂粉,加熱使瓊脂融化后定溶至I升。 (4)白云豆培養基白云豆粉60g，于0. 5L水中煮沸30分鐘過濾，濾液中加入15g瓊脂粉，加熱使瓊脂融化后蒸餾水定容至1L。(5)胡蘿卜培養基(CA)培養基取胡蘿卜200g，于0. 5L水中煮沸30分鐘過濾，濾液中加入15g瓊脂粉，加熱使瓊脂融化后蒸懼水定各至1L。(6)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA):取馬鈴薯200g，于0. 5L水中煮沸30分鐘過濾，濾液中加入葡萄糖6g、瓊脂粉15g,蒸懼水定容至1し將上述培養基分別分裝后于0. 103MPa, 121 °C，高壓蒸氣滅菌20min。冷卻至50°C左右制作培養基平板。2、不同培養基產孢能力差異測定用直徑5mm的打孔器在已培養3d的菌落邊緣打取菌塊，置于上述6種不同培養基平板上25°C下培養下黑暗培養，培養后5d、10d、13d、15d和18d調查培養基上孢子囊產生量。姆個培養基重復三次。姆次調查從培養皿中用五點法取五塊Icm2大小的培養基,顯微鏡下計數每平方厘米培養基上產生的孢子囊數量，統計分析不同培養基產生孢子囊能力的差異。惡疫霉菌在蘿卜培養基上直接培養產孢子囊的能力顯著高于胡蘿卜、馬鈴薯和白云豆培養基(表I)。另外，蘿卜培養基中不同量的蘿卜對產孢量也有影響，其產孢量蘿卜培養基(150g/L) >蘿卜培養基(200g/L) >蘿卜培養基(100g/L)。表I蘿卜培養基與其他常用培養基產孢子囊能力差異比較
權利要求
1.ー種蘿卜為原料制作適宜惡疫霉菌產生孢子囊的培養基，其特征在于，具體制作方法為，取100-200克蘿卜，切碎后于0. 5L水中煮沸30分鐘，過濾，濾液中加入15g瓊脂，加熱使瓊脂融化后定容至I升，分裝后以0. 103MPa、121C、高壓蒸氣滅菌20min ;將滅菌培養基倒入滅菌的培養皿中制成平板。
全文摘要
本發明公開了一種以蘿卜為原料制作適宜惡疫霉菌產生孢子囊的培養基，具體制作方法為，取100-200克蘿卜，切碎后于0.5L水中煮沸30分鐘過濾，濾液中加入15g瓊脂，加熱使瓊脂融化后定容至1升，分裝后以0.103MPa、121C、高壓蒸氣滅菌20min；將滅菌培養基到入滅菌的9cm直徑培養皿中制成平板，冷卻后用直徑5mm的打孔器在已培養3d的菌落邊緣打取菌塊接種于培養基上。將接種后的培養皿置于25℃下黑暗培養10天后便產生大量孢子囊。減少了利用水培法誘導產生孢子囊的操作過程中污染的幾率。該培養基原材料成本低廉且容易獲取，培養基的制作和孢子囊產生的程序簡單易學。
文檔編號C12N3/00GK102643776SQ20121009125
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月31日 優先權日2012年3月31日
發明者何霞紅, 宋冬冬, 廖靜靜, 張紅驥, 朱書生, 朱有勇, 李成云, 楊敏, 梅馨月, 祁蕾 申請人:云南農業大學