專利名稱：一種膜培養篩選鳥苷高產菌的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，具體來說是一種鳥苷(Guanosine)高產菌篩選的方法。
背景技術：
鳥苷又名鳥嘌呤核苷或9-( P -D-呋喃核糖基)鳥嘌呤(9-(3 -D-Ribofuranosyl)guanine 鳥嘌呤-9-0 -D-呋喃核糖苷(Guanine-9-0 -D-ribofuranoside)。鳥苷的用途十分廣泛，可用于合成食品增鮮劑一5’ -鳥苷酸二鈉、呈味核苷酸二鈉以及作為醫藥產品的重要中間體，可形成一系列的下游醫藥產品，包括核苷類抗病毒藥物如利巴韋林、阿昔洛韋等，也是用于制造無環鳥苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC)、三磷酸鳥苷鈉(GTP)等藥物的主要原料。小西等人，通過解除MP脫氫酶的反饋抑制，選育的抗8-氮鳥嘌呤等突變株，把肌苷生產株變為具有產鳥苷能力的突變株；松井等人由枯草芽孢桿菌為出發菌株，誘導具 有甲硫氨酸亞砜突變株，進一步提高鳥苷的產量；Hiroshi Matsui等人進一步篩選出具有阿洛酮糖素抗性和德夸菌素抗性的突變株，增大了鳥苷的積累。但由于鳥苷生產菌是缺陷性生產菌株，在保藏，生產，傳代過程中鳥苷高產菌株不可避免的發生負變，造成鳥苷的產量下降，必須進行定期的篩選和復壯。但傳統的稀釋涂平板法但從菌落形態上很難分辨出高產和負變菌株，初篩很盲目，增大了工作量，而準確度不高，造成篩選周期長，重復工作等弊病。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術而提出一種膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，該方法可以應用在鳥苷的大規模工業生產中，快速準確地進行鳥苷高產菌的篩選和復壯。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是一種膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，包括有以下步驟
1)將待篩選和復壯的鳥苷生產菌加入滅菌蒸餾水，置振蕩器上，混合均勻，制成稀釋度為KT2-KT7的菌懸液；
2)將菌懸液接種至膜培養系統中，靜置培養；
3)根據膜培養系統中鳥苷生產菌的菌落大小和形態進行判斷，初篩出鳥苷高產菌株和負變菌株。按上述方案，所述的膜培養系統由三部分組成，培養皿的底層為步驟I)所述的菌懸液混勻的營養成分不豐富的瓊脂培養基，中層為微孔濾膜，上層為浸潤了營養豐富的培養液的滅菌濾紙。按上述方案，所述的微孔濾膜孔徑為0. 02 ii m,直徑為V85mm的聚碳酸酯微孔濾膜。按上述方案，所述的營養成分不豐富的瓊脂培養基為雙酶糖30±5 g/L，蛋白胨1±0.5 g/L，磷酸二氫鉀4±0.5 g/L，硫酸銨6±2g/L，氯化鈉1±0. 5 g/L，碳酸鈣20±5g/L和硫酸鎂3±2 g/L。按上述方案，所述的營養成分豐富的的培養液為酵母粉35±5 g/L，酵母膏10±5g/L和玉米漿10±2 g/L。按上述方案，靜置培養條件為28°C -38 °C，培養時間為30 h_44 h。按上述方案，膜培養系統的制備方法為待培養皿的底層的營養成分不豐富的瓊脂培養基凝固，培養6 h-8 h后，在其上置一層滅菌的聚碳酸酯微孔濾膜，其上層再布置浸潤了營養豐富的培養液的滅菌濾紙，于28°C -38°C繼續培養22 h_36 h。按上述方案，步驟3)中的判斷方法是膜培養系統中同樣條件下生長快，菌落大而潤澤的單菌落，為負變菌株，產苷量較低；生長較慢，菌落小而干燥的單菌落，為高產菌株。
按上述方案，初篩后還包括進一步復篩，通過將篩選出的高產菌株和負變菌株接入搖瓶，28°C-38°C，轉速200 rpm-300 rpm，培養30 h_48 h，取離心后，清液采用HPLC法，準確測定鳥苷的產量。本發明的有益效果在于通過此方法篩選到的鳥苷高產菌，搖瓶培養產苷達18-20g/L。該方法新穎，實施簡便，篩選準確率遠高于傳統篩選方法，對于工廠高產菌株日常的分離，篩選工作起到了提高效率，增加準確率和減少工作量的優化作用。
圖I為膜培養系統的結構示意 圖2為應用實施例I鳥苷甘油保藏菌膜培養法篩選結果；
圖3為應用實施例2鳥苷斜面保藏菌膜培養法篩選結果；
圖4為應用實施例3鳥苷發酵菌液膜培養法篩選結果；
圖5為應用實施例4鳥苷誘變后的菌株培養法篩選結果。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步詳細的說明，但是此說明不會構成對本發明的限制。鳥苷的初篩
將待篩選的鳥苷生產菌加入一定量的滅菌培養基，置振蕩器上，混合均勻，制成一定濃度梯度菌懸液，在培養皿的底層注入用菌懸液混勻的營養成分不豐富的瓊脂培養基，待凝固后，接種至培養基中，靜置培養6 h-8 h。再在培養基上層置一層滅菌的0.02 pm的聚碳酸酯微孔濾膜，濾膜的上層置浸潤了營養豐富的培養液的滅菌濾紙，28°C -38°C，繼續培養至30 h-44 h。根據培養系統中鳥苷生產菌的菌落大小和形態，初篩出鳥苷高產菌。膜培養系統中同樣條件下生長快，菌落大而潤澤的單菌落，為負變菌株，產苷量較低；生長較慢，菌落小而干燥的單菌落，為高產菌株。鳥苷的復篩
為了準確確定選出菌株的鳥苷生產能力，對初篩出的菌株進行進一步復篩，特征如下將篩選出的高產菌株和負變菌株接入搖瓶，28°C-38°C，轉速200 rpm-. 300 rpm，培養30h-48 h。取離心后，清液采用HPLC法檢測，HPLC法條件如下安捷倫HPLC (1100型)工作站(HP Chem station),色譜條件C18 柱(4. 6X 250mm, 10 u m);流動相乙腈-水(3:97),柱溫30°C，流速I mL/min，進樣量15iiL ;檢測波長為260 nm。準確測定鳥苷的產量。并確定采用膜培養系統方法篩選的準確率。實施例I :
一種膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，包括有以下步驟將待篩選和復壯的鳥苷生產菌加入滅菌蒸餾水，置振蕩器上，混合均勻，制成稀釋度為10_5的菌懸液；將菌懸液接種至膜培養系統中進行靜置培養，靜置培養條件為37°C，培養時間為40h ;根據膜培養系統中鳥苷生產菌的菌落大小和形態，初篩出鳥苷高產菌株和負變菌株，判斷標準是膜培養系統中同樣條件下生長快，菌落大而潤澤的單菌落，為負變菌株，產苷量較低；生長較慢，菌落小而干燥的單菌落，為高產菌株。本發明所述的膜培養系統由三部分組成，如圖1，培養皿的底層為菌懸液混勻的
營養成分不豐富的瓊脂培養基1，中層為微孔濾膜2，上層為浸潤了營養豐富的培養液的滅菌濾紙3，所述的微孔濾膜為孔徑為0. 02 u m，直徑為u/85_的聚碳酸酯微孔濾膜，所述的營養成分不豐富的瓊脂培養基為雙酶糖30±5 g/L，蛋白胨1±0.5 g/L，磷酸二氫鉀4±0.5 g/L，硫酸銨6±2g/L，氯化鈉1±0. 5 g/L，碳酸鈣20±5 g/L和硫酸鎂3±2 g/L,所述的營養成分豐富的的培養液為酵母粉35±5 g/L，酵母膏10±5 g/L和玉米漿10±2g/L，其制備方法如下待培養皿的底層的營養成分不豐富的瓊脂培養基凝固，培養7h后，在其上置一層滅菌的聚碳酸酯微孔濾膜，濾膜的上層再布置浸潤了營養豐富的培養液的滅菌濾紙，于30°C繼續培養30 h。初篩后還需進行進一步復篩，即將篩選出的高產菌株和負變菌株接入搖瓶，30°C，轉速200 rpm-300 rpm,培養40h，取離心后，清液采用HPLC法，HPLC法條件如下安捷倫HPLC (1100 型)工作站(HP Chem station),色譜條件C18 柱(4. 6X 250mm, 10 y m);流動相乙腈-水(3:97)，柱溫30°C，流速I mL/min，進樣量15iiL ;檢測波長為260 nm，準確測定
鳥苷的產量。下面結合實施例1，對其作出具體應用實施例。應用實施例I 將鳥苷甘油保藏菌采用膜培養法進行篩選
將保藏半年的鳥苷甘油保藏菌制成10-2-10-7菌懸液，接入膜培養系統進行初篩，在37°C下靜置培養40 h。根據菌落形態挑選出可能的負變菌和高產菌，接入搖瓶，37°C，轉速200 rpm-300 rpm，培養40 h。取離心后清液，采用HPLC法，準確測定鳥苷的產量。搖瓶檢測鳥苷產量低于4g/L的為負變菌，鳥苷產量大于15 g/L的為高產菌，計算該篩選方法對負變菌和高產菌識別的準確率。結果見圖2。識別負變株6株，平均產苷率3. 15 g/L，準確率75. 00% ;識別高產株9株，平均產苷率16. 36 g/L，準確率100. 00 %。應用實施例2 將鳥苷斜面保藏菌采用膜培養法進行篩選
將保藏一個月的鳥苷斜面保藏菌制成10_2-10_7菌懸液，接入膜培養系統進行初篩，在37°C下靜置培養40 h。根據菌落形態挑選出可能的負變菌和高產菌，接入搖瓶，37°C，轉速200 rpm-300 rpm，培養40 h。取離心后清液，采用HPLC法，準確測定鳥苷的產量。搖瓶檢測鳥苷產量低于4g/L的為負變菌,鳥苷產量大于15 g/L的為高產菌,計算該篩選方法對負變菌和高產菌識別的準確率。結果見圖3。識別負變株10株，平均產苷率3.03 g/L，準確率100. 00 %;識別高產株6株，平均產苷率15. 92 g/L，準確率85. 71 %。
應用實施例3將鳥苷發酵菌液采用膜培養法進行篩選
將發酵48小時的鳥苷發酵液制成10_2_10_7菌懸液，接入膜培養系統進行初篩，在37°C下靜置培養40 h。根據菌落形態挑選出可能的負變菌和高產菌，接入搖瓶，37 °C，轉速200rpm-300 rpm，培養40 h。取離心后清液，采用HPLC法，準確測定鳥苷的產量。搖瓶檢測鳥苷產量低于4g/L的為負變菌，鳥苷產量大于15g/L的為高產菌，計算該篩選方法對負變菌和高產菌識別的準確率。結果見圖4。識別負變株3株，平均產苷率3.57 g/L，準確率60. 00 %;識別高產株7株，平均產苷率17. 37 g/L，準確率77. 78 %。應用實施例4將鳥苷誘變后的菌株采用采用膜培養法進行篩選
將鳥苷用NTG誘變后的菌株制成10_2-10_7菌懸液，接入膜培養系統進行初篩，在37°C下靜置培養40 h根據菌落形態挑選出可能的負變菌和高產菌，接入搖瓶，37°C，轉速200rpm-300 rpm,培養40h。取離心后清液，采用HPLC法，準確測定鳥苷的產量。搖瓶檢測鳥苷產量低于4g/L的為負變菌,鳥苷產量大于15g/L的為高產菌，計算該篩選方法對負變菌和高產菌識別的準確率。結果見圖5。識別負變株6株，平均產苷率3.23 g/L，準確率75. 00 %;識別高產株9株，平均產苷率18. 21 g/L，準確率87. 50 %。膜培養篩選鳥苷高產菌和負變菌的準確率
傳統的鳥苷生產菌的分離篩選方法為稀釋涂平板法，平板上長出的菌株形態差別不大，隨機選擇數株，并將挑選出的菌株接入搖瓶培養后，采用HPLC法檢測鳥苷的精確含量，并計算出篩選方法的準確率。采用傳統法對鳥苷甘油保藏菌和鳥苷斜面保藏菌進行篩選，篩選結果見下表I :
表I傳統法篩選鳥苷生產菌的準確性
權利要求
1.一種膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，包括有以下步驟 1)將待篩選和復壯的鳥苷生產菌加入滅菌蒸餾水，置振蕩器上，混合均勻，制成稀釋度為KT2-KT7的菌懸液； 2)將菌懸液接種至膜培養系統中，靜置培養； 3)根據膜培養系統中鳥苷生產菌的菌落大小和形態進行判斷，初篩出鳥苷高產菌株和負變菌株。
2.根據權利要求I中所述膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，其特征在于所述的膜培養系統由三部分組成，培養皿的底層為步驟I)所述的菌懸液混勻的營養成分不豐富的瓊脂培養基，中層為微孔濾膜，上層為浸潤了營養豐富的培養液的滅菌濾紙。
3.根據權利要求2中所述膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，其特征在于所述的微孔濾膜孔徑為0. 02 V- m,直徑為V 85mm的聚碳酸酯微孔濾膜。
4.根據權利要求2或3中所述膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，其特征在于所述的營養成分不豐富的瓊脂培養基為雙酶糖30±5 g/L，蛋白胨1±0.5 g/L，磷酸二氫鉀4±0.5g/L，硫酸銨6±2g/L，氯化鈉1±0. 5 g/L，碳酸鈣20±5 g/L和硫酸鎂3±2 g/L。
5.根據權利要求2或3中所述一種膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，其特征在于所述的營養成分豐富的的培養液為酵母粉35±5 g/L，酵母膏10±5 g/L和玉米漿10±2 g/L。
6.根據權利要求I中所述膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，其特征在于靜置培養條件為28°C -38 °C，培養時間為 30 h-44 h。
7.根據權利要求2中所述膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，其特征在于膜培養系統的制備方法為待培養皿的底層的營養成分不豐富的瓊脂培養基凝固，培養6 h-8 h后，在其上置一層滅菌的聚碳酸酯微孔濾膜，其上層再布置浸潤了營養豐富的培養液的滅菌濾紙，于280C -38°C繼續培養 22 h_36 h。
8.根據權利要求I中所述膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，其特征在于步驟3)中的判斷方法是膜培養系統中同樣條件下生長快，菌落大而潤澤的單菌落，為負變菌株，產苷量較低；生長較慢，菌落小而干燥的單菌落，為高產菌株。
9.根據權利要求8中所述膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，其特征在于初篩后還包括進一步復篩，通過將篩選出的高產菌株和負變菌株接入搖瓶，28°C -38°C，轉速200 rpm-300rpm，培養30 h-48 h，取離心后，清液采用HPLC法，準確測定鳥苷的產量。
全文摘要
本發明涉及一種鳥苷高產菌篩選的方法，包括有以下步驟1)將待篩選和復壯的鳥苷生產菌加入滅菌蒸餾水，置振蕩器上，混合均勻，制成稀釋度為10-2-10-7的菌懸液；2)將菌懸液接種至膜培養系統中，靜置培養；3)根據膜培養系統中鳥苷生產菌的菌落大小和形態進行判斷，初篩出鳥苷高產菌株和負變菌株。本發明的有益效果在于通過此方法篩選到的鳥苷高產菌，搖瓶培養產苷達18-20g/L。該方法新穎，實施簡便，篩選準確率遠高于傳統篩選方法，對于工廠高產菌株日常的分離，篩選工作起到了提高效率，增加準確率和減少工作量的優化作用。
文檔編號C12N1/02GK102757898SQ20121009086
公開日2012年10月31日 申請日期2012年3月31日 優先權日2012年2月15日
發明者戶業麗, 程波 申請人:武漢工程大學