用MspI鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的試劑盒的制作方法

專利名稱：用MspI鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及鑒定單核苷酸多態性的方法。更具體地，本發明涉及鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的方法。
背景技術：
SNP(單核苷酸多態性)是指單個核苷酸的 改變引起的DNA序列變異，包括單堿基的置換、插入和缺失等形式。SNP現已廣泛用于簡單和復雜疾病的遺傳連鎖分析、關聯分析及疾病易感基因的定位，指導易感基因克隆。聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態(PCR-RFLP)技術是ー種快速、簡便、準確、低成本檢測SNP基因型的經典方法。該方法原理是限制性內切酶是ー類識別DNA特異位點(通常4 6bp)，并在特異位點進行切割的酶類。酶切位點的特異性意味著對特定DNA等位基因的完全消化會產生同樣的片段序列。而堿基的替換或插入、缺失可以產生或消除ー個特定酶切位點，從而改變酶切割后產生片段的大小和數目。這些酶切片段帶型的不同稱為限制性片段長度多態性。如果SNP產生和消除了某個限制性內切酶位點，則可以通過對PCR產物進行酶切、電泳加以檢測。該方法主要優點在于操作簡便，快速，終點判斷準確。主要缺點在于酶切位點的選擇，并不是所有的SNP位點都可以使用該方法來鑒別，且部分內切酶價格昂貴。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是ー種重要的葉酸代謝酶，體內催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為體內最主要的甲基供體5-甲基四氫葉酸，具有重要的生理功能。目前研究發現編碼該蛋白的基因缺陷與動脈硬化性血管阻塞性疾病密切相關，還是胎兒神經管畸形及癌癥發生的遺傳因素。人MTHFR基因定位于染色體1P36. 3，該基因第十二外顯子A/G堿基變異可引起第594位氨基酸變異(Gln/Arg)，文獻中常記為1793A/G多態，該多態可能影響MTHFR的功能。美國國立衛生研究院國立醫學圖書館生物信息技術中心(http://www. ncbi.nlm.nih. gov)可查閱MTHFR基因及其多態序列和相關信息，該多態在SNP數據庫中編號為rs2274976。因此，通常該多態在人群中存在三種MTHFR基因的基因型GG型(人體基因組rs2274976多態位點的兩個等位基因堿基均為G) ,AG型(人體基因組rs2274976多態位點的兩個等位基因堿基分別為G和A)和AA型(人體基因組rs2274976多態位點的兩個等位基因堿基均為A)。目前人MTHFR基因多態rs2274976的鑒定常采用PCR-RFLP方法。目前鑒定人MTHFR基因多態rs2274976時常使用內切酶BsrBI進行鑒定，該內切酶的價格昂貴(關于部分內切酶的參考價格可以參考后面的表I)，影響了實驗的費用，難以在實驗室中普及使用。并且由于傳統PCR-RFLP方法的固有缺陷，本領域技術人員通常難以選擇其他限制性內切酶對人MTHFR基因多態rs2274976進行鑒定。因此，本領域存在對操作簡單，成本低，使用范圍廣的新型檢測SNP的方法的需求。

發明內容
本發明提供了ー種操作簡單，成本低，使用范圍廣的鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的方法，其包括以下步驟a)提供待測人基因組DNA ；b)使用擴增人MTHFR基因多態性rs2274976位點附近序列的正向引物和反向引物，以所述待測人基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應，獲得擴增產物；c)使用限制性內切酶對所述擴增產物進行酶切，獲得酶切產物；以及d)對所述酶切產物進行電泳，以鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976，其中，所述正向引物其3’末端倒數第一位堿基與多態rs2274976堿基相鄰，倒數第二位堿基為錯配堿基C，以便在擴增產物中與多態G等位基因形成CCGG (第一個堿基C為錯配堿基，第三個堿基G為多態等位基因)或ACCGGT (第二個堿基C為錯配堿基，第四個堿基G為多態等位基因)結構，或者與多態A等位基因形成CCAGT (第一個堿基C為錯配堿基，第三個堿基A為多態等位基因)結構。通過本發明的方法可以通過引物上的錯配堿基將SNP附近的序列改變為可被預先確定的限制性內切酶識別的序列，因此，可以克服現有PCR-RFLP方法所存在的需要采用昂貴內切酶的缺陷，進而大大降低了檢測SNP的成本。具體而言，由于在該正向引物序列中倒數第二位堿基C為錯配堿基(該堿基在人MTHFR基因序列中的相應位置為G)，因此，錯配后PCR產物中多態附近序列由AGCGGT或AGCAGT更改為ACCGGT或ACCAGT (其中第二個堿基為錯配堿基，第四個堿基為A/G多態位點)，因此擴增產物中G等位基因片段可被識別CCGG序列的限制性內切酶或者識別ACCGGT序列的限制性內切酶識別(即G等位基因片段可被內切酶切開)。同樣錯配后PCR產物中多態附近序列由GCGGT或GCAGT更改為CCAGT或CCGGT (其中第一個堿基為錯配堿基，第四個堿基為A/G多態位點)，因此擴增產物中A等位基因片段可被識別CCAGT序列的限制性內切酶識別(即A等位基因片段可被內切酶切開)。進而，可以根據片段切開情況來判斷多態基因型。更具體地，經序列分析可知，基因原始序列中A/G多態可由表I中前四種內切酶識別。如通過堿基錯配PCR將多態位點前面第二位堿基G替換為C，則該多態為G等位基因時經PCR擴增后含CCGG序列可被識別CCGG序列的內切酶識別(如MspI、HpaII)，含有ACCGGT序列可被識別ACCGGT序列的內切酶識別(如BsrFI、BsaWI、AgeI)。同樣可被上述內切酶的同裂酶(isoschizomer,來源于不同物種但能識別相同DNA序列的限制性內切酶)識別并切開，而A等位基因不能切開。通過堿基錯配PCR將多態位點前面第二位堿基G替換為C，則當該多態為A等位基因時該多態經PCR擴增后含CCAGT序列可被識別ACTGG序列(互補序列為CCAGT)的內切酶識別(如BsrI)。同樣可被BsrI的同裂酶識別并切開，而G等位基因不能切開。下表I中提供了 NEB公司內切酶價格信息(從http://www. neb-china. com獲取)作為限制性內切酶識別位點和價格的參考。表INEB公司幾種內切酶識別序列及其價格
在本發明的一個實施方案中，正向引物由選自下列的核苷酸序列構成SEQ IDNO 1 (ctttgccctg tggattgacc)和 SEQ NO :11 (tttgccctgtggattgacc)。在本發明的另一個實施方案中，反向引物由選自下列的核苷酸序列構成SEQ ID NO 2(gcagttgtccagtgggaagt ca)、SEQ ID NO 7 (,aatgtgtctt ccaccacctg c)和 SEQ NO 12 (tctcgcattctgggtggg)。正向和反向引物的設計主要考慮引物對PCR擴增的靈敏度、特異度和擴增效率的影響。通常按照堿基互補配對原則設計引物，引物與模板的序列要緊密互補。長度為15-30bp，過短或過長可導致特異性差，過長亦會導致其延伸溫度大于74°C而不利于PCR反應。正向引物的確定必須除了上述原則外必須含有倒數第二位末端錯配堿基C。正向引物在其3’末端倒數第二位含有錯配堿基C，以便在擴增產物中與多態G等位基因形成ACCGGT (第二個堿基C為錯配堿基，第四個堿基G為多態等位基因)結構，與多態A等位基因形成CCAGT (第一個堿基C為錯配堿基，第三個堿基A為多態等位基因)結構。從而可以被相應的內切酶識別。擴增產物的長度主要是由反向引物所決定的(因為正向引物位于多態位點上游附近，其位置大致已確定)，通常擴增產物長度為100-200bp之間，這樣即利于PCR產物擴增，又利于后續的酶切鑒定。否則，如果產物過短則不利于擴增，過長則酶切后片段長度差異較小，不利于分辨。例如，在本發明的一個實施方案中，利用SEQ ID N0:1的核苷酸序列作為正向引物以及SEQ ID NO :2的核苷酸序列作為反向引物的PCR反應可以獲得如下擴增產物ctttRccctR tRRattRacc rgtggggaaa gctgtatgag gaggagtccc cgtcccgcac d0catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac ctggtggaca atgacttccc 120actRRacaac tRC 133 (SEQ ID NO 4)擴增后產物序列中下劃線部分分別為正向、反向引物所對應的序列，21bp處r代表A/G多態即SNP位點β2274976。該擴增產物長度為133bp。經MspI酶切后可出現133bp、114bp (該片段下游序列相比上游序列由于MspI酶切產生粘性末端減少兩個單鏈堿基)、19bp (該片段下游序列相比上游序列由于MspI酶切產生粘性末端增加兩個單鏈堿基)三種片斷(其中19bp電泳圖中不能看到)。酶切后基因型判斷GG為114bp，AG有133bp和114bp兩種片段，AA為133bp。
對于酶切產物的鑒定，通常使用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，基于成本和便利性考慮，使用瓊脂糖凝膠電泳更為常見。在本發明中，對于上述133bp的擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳的條件是將酶切產物在2. 5% -4%瓊脂糖凝膠中3-8V/cm條件下，電泳40-80分鐘，于紫外燈下拍照鑒定。在本發明的另ー個優選實施方案中，所述限制性內切酶選自MspI、HpaII, BsrFI,BsrI、BsaWI、AgeI以及它們的同裂酶，更優選所述限制性內切酶為MspI。這主要是基于成本和切割效率的綜合考慮。在本發明中，PCR擴增反應的條件并不受到特別的限制，只要能夠獲得擴增產物即可。PCR的主要參數-退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶序列的長度。如果PCR退火溫度過低則易出現非特異產物，過高則影響擴增產物產量，最終需要憑實驗確定。PCR延伸時間根據產物長度確定，通常20s-60s即可。為了能夠提高PCR擴增效率，進而進一步提高鑒定效率，在本發明的ー個優選實施方式中，所采用的PCR擴增條件是95°C變性3分鐘；·35個循環95°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸50秒；以及上述35個循環結束后72°C延伸lOmin。對于待測DNA的選擇，本發明并沒有特別的限制。既可以是從人體的體液或者組織獲得基因組DNA，還可以是經過預先降解處理的基因組。為了方便實施，通常優選從血液提取的基因組DNA。其中所述的組織包括人體中含有全部或至少MTHFR基因的組織，而與是否表達該MTHFR基因無關。從體液和/或組織中提取DNA的方法是本領域技術人員公知的，并且可以參考常用的分子生物學手冊，例如《分子克隆》第2版進行。另外，在本發明還提供了用于鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的試劑盒，其包含擴增人MTHFR基因多態性rs2274976位點附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端倒數第一位堿基與rs2274976多態堿基相鄰，倒數第二位為錯配堿基C，以便在擴增產物中與多態G等位基因形成CCGG結構，所述的正向引物為SEQ ID N0:1或者SEQ NO :11，反向引物為SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :7或SEQ NO : 12 ;所述的試劑盒還包括限制性內切酶MspI或HpaII ;并且所述試劑盒還包括用于實施鑒定的說明書。如前所述，該試劑盒操作簡單，成本低，使用范圍廣。在本發明的一個實施方案中，正向引物由選自下列的核苷酸序列構成SEQ IDNO : I (ctttgccctg tggattgacc)和 SEQ NO : 11 (tttgccctgtggattgacc)。在本發明的另一個實施方案中，反向引物由選自下列的核苷酸序列構成SEQ ID NO 2(gcagttgtccagtgggaagt ca)、SEQ ID NO 7 (aatgtgtctt ccaccacctg c)和 SEQ NO 12 (tctcgcattctgggtggg)。在本發明的另ー個實施方案中，所述試劑盒中還包括MspI、HpaII、BsrI、BsrFI、BsaWI、AgeI等限制性內切酶以及它們的同裂酶，這樣可以方便對擴增產物的檢測。進一歩，優選所述限制性內切酶是MspI。這主要是基于限制性內切酶的成本和切割效率的綜合考慮。當然，本領域技術人員可以理解，在試劑盒中還可以包括其他成分，例如用于實施鑒定的說明書等。


圖I描述了實施例I中人MTHFR基因(rs2274976)多態PCR產物經MspI酶切后電泳照片。其中M是DNA分子量標志物；泳道I :GG型樣品的電泳結果；泳道2 AA型的電泳結果；泳道3 :AG型樣品的電泳結果。
具體實施例方式下面通過本發明的具體實施方式
對本發明的技術方案進行詳細描述。其中，需要說明的是，本發明并不以任何方式受限于下面所述的具體實施方式
和實施例。下面利用SEQ ID NO :1的核苷酸序列作為正向引物以及SEQ ID NO :2的核苷酸序列作為反向引物作為例子，對本發明的概念進行詳細地描述。在本發明ー個實施方案中，本發明檢測人MTHFR基因多態rs2274976的方法，步驟是 I、提取待測人基因組DNA模板，所述人基因組DNA模板為人體任何部分取得的人基因組DNA ；2、PCR擴增基因組DNA，對提取的模板基因組DNA進行PCR擴增，獲得含多態附近序列的PCR產物；3、對PCR擴增產物使用限制性內切酶進行酶切反應，得酶切產物；以及4、對酶切后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定人MTHFR基因多態rs2274976。下面對各個主要步驟進行詳細描述(I)引物設計與合成在美國國立衛生研究院國立醫學圖書館生物信息技術中心http://www. ncbi.nlm. nih. gov (NCBI)網站查找MTHFR基因序列和SNP信息，確定MTHFR多態位點堿基變異數據；含MTHFR 多態 rs2274976 的部分基因序列(SEQ ID NO 3)cttccctggg cgagagatca tccagcccac cgtagtggat cccgtcagct tcatgttctg 60gaaggtaaag gagccggggg caagcttgcc ccgcccacct ggaaaaccgt ggggagggat 120tgggaccaag tcccaagcgt gtgctgaagg ccacactgga cccagccttc agggcacacc 180cagctctgac tcacccatgt cactgctgat gcagggtgtt tatttctggg caggggtggg 240aagtgatact ggcagtgggc cttgttctat tccgggaaat gtcctgttga gcagagccct 300tggagagccc tgttaatctt gcctctgtgt gtgtgtgcat gtgtgcgtgt gtgcgggggt 360atgtgtgtgt aggacgaggc ctttgccctg tggattgagc rgtggggaaa gctgtatgag 420gaggagtccc cgtcccgcac catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac 480ctggtggaca atgacttccc actggacaac tgcctctggc aggtggtgga agacacattg 540gagcttctca acaggcccac ccagaatgcg agagaaacgg aggctccatg accctgcgtc 600ctgacgccct gcgttggagc cactcctgtc ccgccttcct cctccacagt gctgcttctc 660ttgggaactc cactctcctt cgtgtctctc ccaccccggc ctccactccc ccacctgaca 720atggcagcta gactggagtg aggcttccag gctcttcctg g761基因序列中401bp處r代表A/G多態即SNP位點rs2274976 ；根據上述序列設計引入錯配堿基的引物，根據序列情況確定正向和反向引物的位置與長度，具體如下
正向引物序列為5’ -CTTTGCCCTGTGGATTGACC-3’ (SEQ ID NO :1)，反向引物序列為5’ -GCAGTTGTCCAGTGGGAAGTCA-3’ (SEQ ID NO 2)；其中正向引物序列中倒數第二位堿基C為錯配堿基(該堿基在原序列中應為G)，錯配后PCR產物中多態附近序列由AGCGGT或AGCAGT(其中第四個堿基為A/G多態)更改為ACCGGT或ACCAGT，因此擴增產物中G等位基因片段可被識別CCGG序列的限制性內切酶或者識別ACCGGT序列的限制性內切酶識別(即G等位基因片段可被內切酶切開)。同樣錯配后當該多態為A等位基因時PCR擴增后含CCAGT (第三個堿基A為多態)序列可被識別ACTGG序列(互補序列為CCAGT)的內切酶識別。根據片段切開情況判斷多態基因型；按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，合成所述弓I物可以使用本領域中公知的方法，例如固相合成法，也可以委托生物工程公司合成并檢測正向和反向引物。將合成的正向、反向引物稀釋為ΙΟμπιοΙ/L濃度備用；(2)制備PCR擴增產物PCR擴增使用15-100 μ I的反應體系為2XPCR MIX用量為PCR擴增反應體系體積的一半即7. 5-50μ l、50-2000ng所述待檢測人基因組DNA和10 μ mol/L正向、反向引物各O. 1-10 μ 1，用滅菌雙蒸水補充至15-100 μ 1，混勻，即得PCR擴增反應體系；其中，所述的2XPCR MIX是2倍濃度的PCR反應用的混合液制成；將PCR擴增反應體系在94-95 V預變性3_5分鐘后；進行30_35個如下循環94-95°C 變性 20-60s，50-65°C 退火 20_60s，72°C 延伸 20_60s ;30-35 個循環結束后 72°C 延伸5-10min，即得PCR擴增產物，其位置相對應含MTHFR多態rs2274976的部分基因序列中喊基 381bp_513bp 處；擴增后產物序列為(SEQ ID NO 4)ctttRccctR tRRattRacc rgtggggaaa gctgtatgag gaggagtccc cgtcccgcac 60catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac ctggtggaca atgacttccc 120actRRacaac tRC133bp 序列 擴增后產物序列中下劃線部分為正向、反向引物所對應的序列，21bp處r代表A/G
多態即SNP位點rs2274976。(3)酶切反應將PCR擴增產物在10-30 μ I酶切體系中進行酶切反應，所述的10_30 μ I酶切體系為2-15 μ I的PCR擴增產物、識別CCGG序列或者識別ACCGGT序列或者識別CCAGT序列的限制性內切酶1-10U和IOX酶切緩沖液占總體積的1/10，滅菌雙蒸水補充至10-30 μ 1，混勻，得酶切體系，將酶切體系于37°C水浴4-16小吋，即得酶切產物；所述識別CCGG序列的限制性內切酶為內切酶MspI、HpaII及其同裂酶；所述識別ACCGGT序列的限制性內切酶為內切酶BsrFI、BsaffI.Agel及其同裂酶；所述識別CCAGT序列的限制性內切酶為內切酶BsrI及其同裂酶；根據價格因素選擇MspI或HpaII進行酶切鑒定;
該多態位點含有G等位基因時PCR產物酶切后可形成切開片段114bp (該片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列減少兩個堿基)序列(SEQ ID N05)crgtggggaa agctgtatga ggaggagtcc ccgtcccgca ccatcatcca gtacatccac 60gacaactact tcctggtcaa cctggtggac aatRacttcc cactRRacaa CtRC 114
酶切后切開片段114bp序列中下劃線部分為反向引物所對應的序列，2bp處代表A/G 多態即 SNP 位點 rs2274976 ；該多態位點含有G等位基因時PCR產物酶切后可形成切開片段19bp (該片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列増加兩個堿基)序列(SEQ ID N06)ctttgccctg tggattgac 19。(2)瓊脂糖凝膠電泳，確定基因多態性將酶切產物在3%瓊脂糖凝膠中3-8V/cm條件下，電泳40_80分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，對于不同的基因型，MTHFR位點擴增后出現133bp片 斷，經酶切后電泳會出現133bp、114bp、19bp三種片斷，依據133bp和114bp片段的有無判斷來判斷基因型GG型為114bp ー個片段，AG型有133bp和114bp兩種片段，AA型為133bp —個片段；經測序鑒定，測序結果和使用現有技術檢測所得的結果完全相同。下面是實施本發明的若干實施例。實施例II材料與方法I. I主要試劑及儀器試劑2XPCR mix (MBI公司)，限制性內切酶MspI (MBI公司)，瓊脂糖(BBI公司)，引物由上海Sangon公司合成。儀器9600型 PCR 儀(PE 公司)，微型電泳槽(Pharmacia Biotech, EPS1000), GelDoc 2000凝膠成像儀(Bio-RAD公司)。PCR產物測序由上海生エ生物工程有限公司完成。I. 2序列查找及引物設計在NCBI網站查找MTHFR基因序列和SNP信息，結合有關文獻確定MTHFR多態位點堿基變異信息，設計引物，具體如下正向引物序列為5’ -CTTTGCCCTGTGGATTGACC-3’ (SEQ ID NO 1),反向引物序列為5’ -GCAGTTGTCCAGTGGGAAGTCA-3’ (SEQ ID NO :2)。I. 3從全血標本提取DNA作為待測DNAEDTA抗凝管采集人外周血全血血樣300 μ 1，使用TIANGEN公司RelaxGene RloodDNA System血液基因組DNA提取系統(主要成分為細胞裂解液CL、蛋白酶K、緩沖液FG、洗脫緩沖液TB)提取全血基因組DNA為待測人基因組DNA模板300 μ I外周血轉移至離心管，加入750 μ I細胞裂解液CL，顛倒混勻5次;10，000r/min離心20秒，倒棄上清液；在離心管中加入150 μ I的緩沖液混合液，緩沖液混合液是由緩沖液FG與蛋白酶K以體積比100 I混合制成，渦旋混勻器混勻至溶液無團塊；然后,在65°C水浴IOmin,其間顛倒混勻5次；加入質量濃度為99. 9%的異丙醇150 μ 1，顛倒充分混勻至出現絲狀或簇狀基因組 DNA ；10，000r/min離心3分鐘，倒棄上清液，將離心管倒置在干凈的吸水紙上，確保DNA
沉淀物在管中；加入質量濃度為70%こ醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10, 000r/min離心3分鐘，倒棄上清液后，再加入質量濃度為70%こ醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10，000r/min離心3分鐘，倒棄上清液；將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留5分鐘，確保DNA沉淀物在管中；將離心管在室溫下靜置，干燥至所有的液體揮發干凈(至少5分鐘)；再加入200 μ I洗脫緩沖液TB，渦旋振蕩5秒，65°C加熱10分鐘至I小時，加熱時，輕彈數次助溶，即得全血基因組DNA。I. 4PCR擴增及酶切鑒定人基因組DNAlOOng (制備方法如上所述),姆個引物O. 2 μ mol/L, I XPCRmix,滅菌雙蒸水補足25 μ I反應體系。PCR反應條件為首先94°C預變性5min，然后94°C變性30s，根據引物Tm值取59°C退火20s，72°C延伸20s，共30個循環后72°C延伸IOmin。PCR擴增后，取PCR產物10 μ 1，加入5U內切酶和2 μ I IOX酶切緩沖液和滅菌雙蒸水組成20 μ I反應體系，37°C水浴中酶切8h后，電泳后于凝膠成像儀觀察成像，結果示于圖I中。2 結果2. I酶切結果上述酶切產物在3%瓊脂糖凝膠8V/cm條件下，電泳40分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，MTHFR位點擴增后出現133bp片斷(以上游序列為準，以下同)，經MspI酶切后可出現133bp、114bp (下游序列相比上游序列由于MspI酶切產生粘性末端減少兩個單鏈堿基)、19bp (下游序列相比上游序列由于MspI酶切產生粘性末端增加兩個單鏈堿基)三種片斷(其中19bp電泳圖中不能看到)。如圖I所不。酶切后基因型判斷GG型為114bp，AG型有133bp和114bp兩種片段，AA型為133bp。2. 2MTHFR基因多態結果鑒定檢測結果發現MTHFR出現GG型、AG型和AA型三種基因型。另外，對MTHFR多態各類型PCR產物進行測序鑒定，測序結果與預期結果完全一致。實施例2外周血全血標本測定人MTHFR基因rs2274976多態與實施例I的步驟基本相同，只是PCR反應所采用的正向引物是SEQ ID NO: 1，反向引物是SEQ ID NO :7，退火溫度為59 °C，并且所采用的限制性內切酶是HpaII (NEB公司)。結果所獲得的擴增產物序列如下(159bp，SEQ ID NO 8)ctttgccctg tggattgacc rgtggggaaa gctgtatgag gaggagtccc cgtcccgcac 60catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac ctggtggaca atgacttccc 120actggacaac tgcctctggc aggtggtgga agacacatt159MTHFR多態含G等位基因時酶切后可形成140bp產物(SEQ ID NO :9)，序列如下crgtggggaa agctgtatga ggaggagtcc ccgtcccgca ccatcatcca gtacatccac 60gacaactact tcctggtcaa cctggtggac aatgacttcc cactggacaa ctgcctctgg 120
caggtggtgg aagacacatt140MTHFR多態含G等位基因時酶切后可形成19bp產物(SEQ ID N0:10，其與SEQ IDNO 6的序列一致)，序列如下ctttgccctg tggattgac19上述酶切產物在3%瓊脂糖凝膠6V/cm條件下，電泳50分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，MTHFR位點擴增后出現159bp片斷，經酶切、電泳出現159bp、140bp、19bp三種片斷，基因型判斷依據159和140bp片段的有無判斷GG型為140bp，AG型有159bp和140bp兩種片段，AA型為159bp。實施例3外周血血凝塊標本測定人MTHFR基因rs2274976多態與實施例I的步驟基本相同，只是采用下面的方法從外周血血凝塊標本提取DNA作為待測DNA。另外,PCR反應所采用的正向引物是SEQ NO 11 (tttgccctgt ggattgacc),反向引物是SEQ NO 12 (tctcgcattc tgggtggg),退火溫度是58で。限制性內切酶為MspI (NEB公司)。提取DNA:普通采血管采集人外周血400 μ 1，使用TIANGEN公司RelaxGene Rlood DNASystem血液基因組DNA提取系統提取外周血血凝塊中基因組DNA為待測人基因組DNA模板；
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待采血管內血清析出后分離血清，然后按下列步驟進行將上述采血管中凝血塊研磨為勻衆狀后置于離心管中，加入750 μ I細胞裂解液CL，顛倒混勻5次；10, 000r/min離心20秒,倒棄上清液；加入150μ I緩沖液混合液，緩沖液混合液是由緩沖液FG與蛋白酶K以體積比100 I混合制成，渦旋混勻器混勻至溶液無團塊；然后，在65°C水浴lOmin，其間顛倒混勻6次；加入質量濃度為99. 9%的異丙醇150 μ 1，顛倒充分混勻至出現絲狀或簇狀基因組 DNA ；10，OOOr/min離心3分鐘，倒棄上清液，將離心管倒置在干凈的吸水紙上，確保DNA
沉淀物在管中；加入質量濃度為70%的こ醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10, OOOr/min離心3分鐘，倒棄上清液后，再加入質量濃度為70%的こ醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10，OOOr/min離心3分鐘,倒棄上清液；將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留至少5分鐘，確保DNA沉淀物在管中；將離心管在室溫下靜置，干燥至所有的液體揮發干凈(至少5分鐘)；加入200 μ I洗脫緩沖液TB，渦旋振蕩5秒，65°C加熱10分鐘至I小時，加熱時，輕彈數次助溶，即得外周血血凝塊中基因組DNA。結果所獲得的擴增產物序列如下(192bp, SEQ ID NO :13)tttgccctgt ggattgaccr gtggggaaag ctgtatgagg aggagtcccc gtcccgcacc 60atcatccagt acatccacga caactacttc ctggtcaacc tggtggacaa tgacttccca 120ctggacaact gcctctggca ggtggtggaa gacacattgg agcttctcaa caggcccacc 180cagaatgcga ga192MTHFR多態含G等位基因時酶切后可形成174bp產物(SEQ ID N0:14)，序列如下crgtggggaa agctgtatga ggaggagtcc ccgtcccgca ccatcatcca gtacatccac 60gacaactact tcctggtcaa cctggtggac aatgacttcc cactggacaa ctgcctctgg 120
caggtggtgg aagacacatt ggagcttctc aacaggccca cccagaatgc gaga174MTHFR多態含G等位基因時酶切后可形成18bp產物(SEQ ID NO : 15)，序列如下
tttgccctgt ggattgac18上述酶切產物在3%瓊脂糖凝膠5V/cm條件下，電泳60分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，MTHFR位點擴增后出現192bp片斷，經酶切、電泳出現192bp、174bp、18bp三種片斷，基因型判斷依據192和174bp片段的有無判斷GG型為174bp，AG型有192bp和174bp兩種片段，AA型為192bp。實施例4人肺組織標本測定人MTHFR基因rs2274976多態與實施例I的步驟基本相同，只是采用下面的方法從肺組織標本提取DNA作為待測 DNA。使用手術切除肺組織，酚-氯仿法提取肺組織基因組DNA為待測人基因組DNA模板將肺組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取O. lg，玻璃勻漿器研磨碎肺組織后放入I. 5ml的第一個離心管中；在第一個離心管中加入Iml DNA提取緩沖液(lOmmol/Ltris .Cl2,0. lmol/L EDTA,20 μ g/ml胰RNA酶，0. 5 %的十二烷基硫酸鈉)混勻，再加入50 μ I質量濃度為10 %的十二烷基硫酸鈉，濃度為20mg/ml的蛋白酶K5. O μ 1，充分混勻后，于56°C保溫5h，每2h搖I次；放置到室溫,加入飽和酹500 μ I,顛倒混勻，10000r/min離心IOmin,分離水相和有機相，吸取上層含核酸的水相置于I. 5ml的第二個離心管中；在第二個離心管中加入與管內的含核酸的水相等體積的酚氯仿異戊醇的混合液，其中，酚氯仿異戊醇的混合液是由酚氯仿異戊醇以體積比25 : 24 : I混合制成，顛倒混勻，10000r/min離心10分鐘，取上層液體轉移到I. 5ml第三個離心管中；第三個離心管中，加入與管內液體等體積的氯仿異戊醇以體積比24 I混合制成的混合液，顛倒混勻，10000r/min離心10分鐘,取上層清液到I. 5ml第四個離心管中； 在第四個離心管中加入管內清液2. 5倍體積的-20°C預冷的無水こ醇，沉淀DNA，得DNA沉淀物；將DNA沉淀物，12000r/min離心10分鐘，棄こ醇；再加入_20°C的質量濃度為75%的こ醇洗滌，10000r/min離心5分鐘，去こ醇，在55°C下干燥，得干燥的DNA沉淀物；加入100 μ I滅菌雙蒸水溶解干燥的DNA沉淀物，_20°C保存，即得肺組織基因組DNA，備用。結果所得酶切產物在3%瓊脂糖凝膠4V/cm條件下，電泳70分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，MTHFR位點擴增后出現133bp片斷，經酶切、電泳出現133bp、114bp、19bp三種片斷，基因型判斷依據133bp和114bp片段的有無判斷GG型為114bp —個片段，AG型有133bp和114bp兩種片段，AA型為133bp —個片段；經測序鑒定，測序結果和使用現有技術檢測所得的結果完全相同。從上述實施例可以看出，本發明針對使用PCR-RFLP鑒定MTHFR多態rs2274976的 缺點，即必須使用識別原多態附近序列的內切酶，內切酶選擇余地小，價格昂貴等因素。本發明通過設計包含酶切位點的錯配引物來克服該缺點。該方法可認為是PCR-RFLP的特殊應用，其原理是根據單堿基突變位點的堿基替代情況設計PCR引物，其中一條引物根據突變位點鄰近序列設計，人為引入錯配堿基，使得引物3'端和單堿基突變的ー種突變型在PCR擴增后形成一個酶切位點，其PCR產物可用類似PCR-RFLP的方法進行分析。由于這種方法應用了引物3'端錯配技木，PCR產物進行酶切電泳后即可進行基因型的鑒定工作，因此在實際運用中具有很大的靈活性，且檢測方法簡單易行，成本低，酶切結果易分辨，是ー種進行基因型鑒定的較好方法。本發明通過改進實驗方法，重新設計新的引物擴增該多態序列，使擴增產物中該基因多態附近序列改變，能夠應用其他內切酶進行鑒定，從而可以選擇更為廉價的內切酶完成檢測。 已經對本發明進行了詳細地描述，要指出的是，上述僅是本發明的實施例而已，并 非對本發明作任何形式上的限制，本領域技術人員在不脫離本發明技術方案范圍內，當可利用上述公開的技術內容作出修改獲得等同的技術效果，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，進而仍屬于本發明技術方案的范圍內。
權利要求
1.一種用于鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的試劑盒，包含擴增人MTHFR基因多態性rs2274976位點附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向弓I物在其3’末端倒數第一位堿基與rs2274976多態堿基相鄰，倒數第二位為錯配堿基C，以便在擴增產物中與多態G等位基因形成CCGG結構，所述的正向引物為SEQ ID NO :1或者SEQ N0:11，反向引物為SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :7或SEQ NO :12 ;所述的試劑盒還包括限制性內切酶MspI或HpaII ;并且所述試劑盒還包括用于實施鑒定的說明書。
2.根據權利要求I的試劑盒，其中限制性內切酶為MspI。
3.根據權利要求I的試劑盒，其中所述的正向引物為SEQID N0:1，反向引物為SEQ IDNO :2。
4.根據權利要求I的試劑盒，其中所述的正向引物為SEQID N0:1，反向引物為SEQ IDNO :7。
5.根據權利要求I的試劑盒，其中所述的正向引物為SEQID NO :11，反向引物為SEQID NO 12o
全文摘要
用MspI鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的試劑盒，包含擴增人MTHFR基因多態性rs2274976位點附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端倒數第一位堿基與rs2274976多態堿基相鄰，倒數第二位為錯配堿基C，以便在擴增產物中與多態G等位基因形成CCGG結構，所述的正向引物為SEQ ID NO1或者SEQ NO11，反向引物為SEQ ID NO2、SEQ ID NO7或SEQ NO12；所述的試劑盒還包括限制性內切酶MspI或HpaII；并且所述試劑盒還包括用于實施鑒定的說明書。該試劑盒操作簡單，成本低，使用范圍廣。
文檔編號C12Q1/68GK102676655SQ20121009022
公開日2012年9月19日 申請日期2009年12月24日 優先權日2009年12月24日
發明者姚武, 楊永利, 王威 申請人:鄭州大學