專利名稱：利用酒糟發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻和轉(zhuǎn)化生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以酒糟為原料，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻和轉(zhuǎn)化生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
食品添加劑產(chǎn)業(yè)是現(xiàn)代食品工業(yè)的核心組成，在食品工業(yè)的產(chǎn)業(yè)升級(jí)中發(fā)揮著極其重要的作用。目前，全球各類食品添加劑的總消費(fèi)量已接近1000萬噸，品種有25000多種，而香精和香料則是其中用量最大、種類最多的一類食品添加劑。目前，在人們對(duì)食品添加劑營養(yǎng)、健康、安全性的強(qiáng)烈要求下，采用工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)綠色、安全的香精香料等食品和飼料添加劑已成為該行業(yè)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑，對(duì)于催生我國高效、安全、健康、天然的香精香料產(chǎn)業(yè)，帶動(dòng)我國食品行業(yè)整體水平的發(fā)展，具有極其重要的意義。乙偶姻，即3-羥基-2-丁酮，天然存在于乳品、黃油、干酪、酒類、玉米、葡萄、蘋果、草莓、可可等各類食品中，是一種應(yīng)用廣泛的食用香料，其具有明顯的奶酪香、脂香特征，主要用于奶油、乳品、酸奶等香料的生產(chǎn)。國家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-86規(guī)定其為容許食用的香料，美國食品和萃取協(xié)會(huì)(FEMA)安全號(hào)為2008。此外，乙偶姻作為一種平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化工、IT等行業(yè)。乙偶姻的生產(chǎn)方法主要分為兩類化學(xué)合成法與生物合成法?；瘜W(xué)法生產(chǎn)乙偶姻存在著產(chǎn)品收率低、高能耗、高污染、且產(chǎn)品質(zhì)量難以達(dá)到食用香料的要求。生物合成法生產(chǎn)的乙偶姻，有效地避免了上述問題，產(chǎn)品綠色天然、反應(yīng)條件溫和、污染少、能耗低，是一種十分具有發(fā)展前景的合成方法。目前有應(yīng)用微生物采用合成培養(yǎng)基液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻的方法，但是存在原料成本高，發(fā)酵廢液處理等問題。至今還沒有采用酒糟等作為原料培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻的報(bào)道。四甲基吡嗪，是吡嗪環(huán)碳原子上均連接甲基的含氮雜環(huán)化合物。四甲基吡嗪具有烘烤、花生、榛子、可可香氣，被廣泛用于烘烤食品、冷飲、肉類、乳制品、卷煙等香精的調(diào)配；同時(shí)，四甲基吡嗪作為中藥材川芎根莖的主要活性生物堿成分，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板集聚等藥理作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、腎小球疾病等的治療。四甲基吡嗪的生產(chǎn)方法可分為生物合成轉(zhuǎn)化法、直接從植物中提取法和化學(xué)合成法三種。其中，直接萃取法存在原料供應(yīng)問題，化學(xué)法存在較嚴(yán)峻的環(huán)保問題，反應(yīng)條件一般較劇烈，對(duì)設(shè)備要求較高，且產(chǎn)品不屬于‘天然’或‘生物合成’范疇。隨著人們對(duì)綠色產(chǎn)品需求的日益提高，利用生物工程的手段生產(chǎn)四甲基吡嗪具有產(chǎn)品綠色天然、成本低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)而廣受消費(fèi)者關(guān)注。目前有報(bào)道采用大豆來固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法，但是該法不但所用原料為糧食性作物，而且具有較高的原料成本；并且該法中需要添加大量的前體乙偶姻，由于乙偶姻屬于較為昂貴的生物香料，因此通過添加外源前體乙偶姻的方法經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)水平。2011年中國白酒產(chǎn)量1055萬噸，產(chǎn)生酒糟四千多萬噸。酒糟中含有大量的淀粉(10%)，粗蛋白(7%-10%)和微生物，氨基酸，有機(jī)酸，離子等營養(yǎng)成分。當(dāng)前酒糟的處理方式是直接用來做飼料，但是該應(yīng)用的附加值極低，其中大部分的營養(yǎng)成分均未有效開發(fā)與利用。因此，有效開發(fā)利用酒糟，生產(chǎn)高附加值物質(zhì)，不僅能減少酒糟對(duì)環(huán)境的污染，還能帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。目前報(bào)道的利用酒糟的技術(shù)主要有烘干去稻殼直接生產(chǎn)飼料；經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料；進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)酶類飼料添加劑；厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣；也有利用酒糟的水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的報(bào)道，但這屬于液態(tài)發(fā)酵，且需要對(duì)酒糟進(jìn)行水解，該過程不但復(fù)雜，而且液態(tài)發(fā)酵也存在廢水污染等問題等。而對(duì)于利用酒糟為原料直接固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物香料入乙偶姻和四甲基吡嗪的報(bào)道目前沒有報(bào)道。由于四甲基吡嗪可由前體物乙偶姻和銨鹽反應(yīng)生成，因此可通過在發(fā)酵產(chǎn)物中是否添加銨鹽來有選擇的控制生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的生產(chǎn)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容
I)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供了一種以酒糟為原料生產(chǎn)生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的方法；本發(fā)明提供的另一個(gè)技術(shù)問題是提供了一種通過是否添加銨鹽來有選擇的生產(chǎn)乙偶姻或四甲基吡嗪的方法。(2)本發(fā)明的技術(shù)方案 乙偶姻的發(fā)酵生產(chǎn)
培養(yǎng)基的制作新鮮酒糟加入O. 1-lmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)酸度為O 5，補(bǔ)充葡萄糖O 100g/kg酒糟。菌株種子培養(yǎng)物枯草芽孢桿菌UaciBw1S subtilis、Q￡K￡ NO M208157和地衣芽孢桿菌licheniformis ) CGMCC 3961，CGMCC 3962，CGMCC 3963 中任一株，以液體或固體麩皮培養(yǎng)基，挑取一環(huán)菌株接種，37°C培養(yǎng)16 48h。所述枯草芽抱桿菌{Bacillus subtil is、CCTCC NO M 208157已在申請(qǐng)?zhí)?00810235366. 1，申請(qǐng)日2008年12月8日，發(fā)明名稱“一株高產(chǎn)四甲基吡嗪的枯草芽孢桿菌及其發(fā)酵生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法”中公開。所述地衣芽孢桿菌UaciBw1S licheniformis) CGMCC 3961，CGMCC 3962，CGMCC3963已在申請(qǐng)?zhí)?01010238685. 5，申請(qǐng)日2010年7月28日，發(fā)明名稱“一種生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法及其生產(chǎn)菌株”中公開。液體種子培養(yǎng)基以白酒釀造所用的原料為培養(yǎng)基成分，原料選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取液體種子培養(yǎng)基，制作方式為原料樣品經(jīng)粉碎后，與水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷卻后加入糖化酶10 50單位/g原料，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，調(diào)節(jié)糖度為1(Γ 5°Βχ，調(diào)節(jié)pH為4 6。固體種子培養(yǎng)基選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取固體種子培養(yǎng)基，制作方式為原料樣品經(jīng)粉碎后，與水按I : 0.5 2 (w/v)的比例混合后,80 10CTC 蒸煮 30min。乙偶姻的固體酒糟發(fā)酵條件液體種子培養(yǎng)基按2% 10%(v/w)接種,或固體種子培養(yǎng)基按2% 10% (w/w)接種，37°C培養(yǎng)I 3d，即可大量發(fā)酵產(chǎn)生乙偶姻。四甲基吡嗪的發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基的制作新鮮酒糟加入O. 1-lmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)酸度為O 5，補(bǔ)充葡萄糖O 100g/kg酒糟菌株種子培養(yǎng)物枯草芽孢桿菌(CCTCC NO M208157)和地衣芽孢桿菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株，以液體或固體麩皮培養(yǎng)基，挑取一環(huán)菌株接種，37°C培養(yǎng)16 48h。液體種子培養(yǎng)基以白酒釀造所用的原料為培養(yǎng)基成分，原料選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取液體種子培養(yǎng)基，制作方式為原料樣品經(jīng)粉碎后，與水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷卻后加入糖化酶10 50單位/g原料，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，調(diào)節(jié)糖度為1(Γ 5°Βχ，調(diào)節(jié)pH為4 6。固體種子培養(yǎng)基選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取固體種子培養(yǎng)基，制作方式為原料樣品經(jīng)粉碎后，與水按I : 0.5 2 (w/v)的比例混合后,80 10CTC 蒸煮 30min。四甲基吡嗪的固體酒糟發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件液體種子培養(yǎng)基按2% 10%(v/w)，或固態(tài)種子培養(yǎng)基2% 10% (w/w)接種，接種后，37°C培養(yǎng)I 3d后；補(bǔ)加銨鹽10 30g/kg酒糟，包括磷酸氫二銨、磷酸銨、磷酸二氫銨、檸檬酸銨、硫酸銨、碳酸氫銨中的一種，四甲基吡嗪轉(zhuǎn)化生產(chǎn)條件為30 90°C反應(yīng)I 3d。上述所述的酒糟為釀造廢棄的黃酒酒糟或白酒酒糟。酒糟發(fā)酵產(chǎn)生的乙偶姻的提取方法
固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物按照I : I 2 (w/v)加入水或乙醇，再于60°C水浴中超聲保持lh，浸出液離心或過濾，所得上清液經(jīng)減壓蒸餾，控制溫度為50-80°C，除去不揮發(fā)性雜質(zhì)；收集餾分經(jīng)50 80°C二次減壓蒸餾除去水分，得到液態(tài)乙偶姻產(chǎn)物。酒糟發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的四甲基吡嗪的提取方法
固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物，按照I : I 2 (w/v)加入水或乙醇，再于60°C水浴中超聲保持lh，浸出液離心或過濾，所得上清液經(jīng)減壓蒸餾，控制溫度為50-80°C，除去不揮發(fā)性雜質(zhì)；收集餾分經(jīng)低溫冷卻，產(chǎn)物析出，得到四甲基吡嗪濕晶體，在冷凍干燥得到粉末狀四甲基吡嗪結(jié)晶。(3)本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明以酒糟為原料發(fā)酵生產(chǎn)生物香料乙偶姻或四甲基吡嗪，具有以下的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)(I)可通過是否添加銨鹽來有選擇的控制生產(chǎn)乙偶姻或四甲基吡嗪，在生物香料的生產(chǎn)方面具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基中除了添加葡萄糖外，不需要額外添加其它營養(yǎng)成分，能夠盡可能充分的有效利用酒糟中的營養(yǎng)成分，對(duì)于資源的有效回收利用具有重要的價(jià)值；(3)利用酒糟發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻或四甲基吡嗪，能夠有效提高酒糟的附加值；(4)利用酒糟固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻或四甲基吡嗪，相對(duì)于液態(tài)發(fā)酵酒糟具有節(jié)省能源、減少廢水污染的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明生產(chǎn)的乙偶姻濃度能夠達(dá)到13.42g/kg酒糟；生產(chǎn)四甲基吡嗪的濃度能夠達(dá)到3. 02 g/kg酒糟。
圖I.枯草芽孢桿菌CCTCC NO :M208157利用白酒糟發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻轉(zhuǎn)化生產(chǎn)四甲基吡嗪的時(shí)間曲線圖。圖2.地衣芽孢桿菌CGMCC 3961利用白酒糟發(fā)酵生產(chǎn)并提純的產(chǎn)物乙偶姻和四甲基吡嗪的氣相色譜圖。圖3.乙偶姻的離子碎片圖。圖4.四甲基吡嗪的離子碎片圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I.黃酒糟發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻
培養(yǎng)基的制作新鮮酒糟加入NaOH溶液調(diào)節(jié)酸度為O 5，補(bǔ)充葡萄糖O 100g/kg。 菌株種子培養(yǎng)物枯草芽孢桿菌(CCTCC NO M208157)和地衣芽孢桿菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株，以液體或固體麩皮培養(yǎng)基，挑取一環(huán)菌株接種，37°C培養(yǎng)16 48h。液體種子培養(yǎng)基以白酒釀造所用的原料為培養(yǎng)基成分，選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方，制取原料液體培養(yǎng)基，制作方式為原料樣品經(jīng)粉碎后，與水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷卻后加入糖化酶10 50單位/g原料，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，調(diào)節(jié)糖度為1(Γ 5°Βχ，調(diào)節(jié)pH為4 6。固體種子培養(yǎng)基選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方，制作方式為原料樣品經(jīng)粉碎后，與水按I : O. 5 2 (w/v)的比例混合后，80 100°C蒸煮30mino乙偶姻的固體酒糟發(fā)酵條件液體種子培養(yǎng)基按2% 10%(v/w)，或固態(tài)種子培養(yǎng)基2% 10% (w/w)接種，接種后，37°C培養(yǎng)I 3d，即可發(fā)酵產(chǎn)生乙偶姻13. 42g/kg。實(shí)施例2白酒糟發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)四甲基吡嗪
培養(yǎng)基的制作新鮮酒糟加入NaOH調(diào)節(jié)酸度為O 5，補(bǔ)充葡萄糖O 100g/kg。菌株種子培養(yǎng)物枯草芽孢桿菌(CCTCC NO M208157)和地衣芽孢桿菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株，以液體或固體麩皮培養(yǎng)基，挑取一環(huán)菌株接種，37°C培養(yǎng)16 48h。液體種子培養(yǎng)基以白酒釀造所用的原料為培養(yǎng)基成分，選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方，制取原料液體培養(yǎng)基，制作方式為原料樣品經(jīng)粉碎后，與水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷卻后加入糖化酶10 50單位/g原料，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，調(diào)節(jié)糖度為1(Γ 5°Βχ，調(diào)節(jié)pH為4 6。固體種子培養(yǎng)基選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方，制作方式為原料樣品經(jīng)粉碎后，與水按I : 0. 5 2 (w/v)的比例混合后，80 100°C蒸煮30mino四甲基吡嗪的固體酒糟發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件液體種子培養(yǎng)基按2% 10%(v/w)，或固態(tài)種子培養(yǎng)基2% 10% (w/w)接種，接種后，37°C培養(yǎng)I 3d后，補(bǔ)加銨鹽20g/kg酒糟，包括磷酸氫二銨、磷酸銨、磷酸二氫銨、檸檬酸銨、硫酸銨、碳酸氫銨中任一種，四甲基吡嗪轉(zhuǎn)化生產(chǎn)條件為55°C反應(yīng)I 3d，生成四甲基吡嗪3. 02g/kg酒糟。
實(shí)施例3白酒糟發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻的提取 Ikg固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物，按照I: I 2 (w/v)加入蒸餾水，置于60°C水浴中超聲lh，浸出液SOOOrpm離心lOmin，所得上清液經(jīng)70°C減壓蒸餾除去不揮發(fā)性雜質(zhì)；收集餾分經(jīng)80°C二次減壓蒸餾除去水分，得到液態(tài)乙偶姻產(chǎn)物9. 6mL。實(shí)施例4四甲基吡嗪提取方式
Ikg固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物，按照1:1 2 (w/v)加入水或乙醇，再于60°C水浴中超聲保持lh，浸出液SOOOrpm離心lOmin，所得上清液經(jīng)80°C減壓蒸餾除去不揮發(fā)性雜質(zhì)；收集餾分經(jīng)4°C低溫冷卻，產(chǎn)物析出，得到四甲基吡嗪濕晶體，8000rpm，4°C離心lOmin，收集固體在冷凍干燥得到粉末狀四甲基吡嗪結(jié)晶2. Og。
權(quán)利要求
1.一種以酒糟為原料有選擇的控制發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻或轉(zhuǎn)化生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法，其特征在于新鮮酒糟加入O. 1-lmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)酸度為O 5，補(bǔ)充葡萄糖O 100g/kg酒糟，加入菌株種子培養(yǎng)物發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻；在發(fā)酵產(chǎn)物中另外補(bǔ)充銨鹽10 30g/kg酒糟，轉(zhuǎn)化反應(yīng)生產(chǎn)四甲基吡嗪； 所述的菌株種子培養(yǎng)物為枯草芽孢桿菌subtil is) CCTCC NO :M208157、地衣芽抱桿 1MiBacillus licheniformis') CGMCC 3961,地衣芽抱桿舊 QBacilluslicheniformis) CGMCC 3962,地衣芽抱桿菌 CfeciBw1S Iicheniformis) CGMCC 3963 中任一株，以液體或固體麩皮培養(yǎng)基，挑取一環(huán)菌株接種，37°C培養(yǎng)16 48h ； 液體種子培養(yǎng)基以白酒釀造所用的原料為培養(yǎng)基成分，原料選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取液體種子培養(yǎng)基，制作方式為原料樣品經(jīng)粉碎后，與水w/v按I : I 4的比例混合后,蒸煮l-5h,冷卻后加入糖化酶10 50單位/g原料,于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，調(diào)節(jié)糖度為1(Γ 5°Βχ，調(diào)節(jié)pH為4 6 ; 固體種子培養(yǎng)基選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取固體種子培養(yǎng)基，制作方式為原料樣品經(jīng)粉碎后，與水w/v按I : O. 5 2的比例混合后，80 10CTC 蒸煮 30min ； 乙偶姻發(fā)酵生產(chǎn)條件為液體種子培養(yǎng)基按2% 10% v/w接種，或固體種子培養(yǎng)基按2% 10% w/w接種，37 °C培養(yǎng)I 3d ; 轉(zhuǎn)化反應(yīng)生產(chǎn)四甲基吡嗪的條件為30 90°C反應(yīng)I 3d ; 所述補(bǔ)充銨鹽包括磷酸氫二銨、磷酸銨、磷酸二氫銨、檸檬酸銨、硫酸銨、碳酸氫銨中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所用酒糟為釀造廢棄的黃酒酒糟或白酒酒糟。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于發(fā)酵生產(chǎn)的乙偶姻的提取方法為，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物，按照I : I 2 w/v加入水或乙醇，再于60°C水浴中超聲保持lh，浸出液離心或過濾，所得上清液經(jīng)減壓蒸餾，控制溫度為50 80°C，除去不揮發(fā)性雜質(zhì)；收集餾分經(jīng)50 80°C二次減壓蒸餾除去水分，得到液態(tài)乙偶姻產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的四甲基吡嗪的提取方法為，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物，按照I : I 2 w/v加入水或乙醇，再于60°C水浴中超聲保持lh，浸出液離心或過濾，所得上清液經(jīng)減壓蒸餾，控制溫度為50 90°C，除去不揮發(fā)性雜質(zhì)；收集餾分經(jīng)低溫冷卻，產(chǎn)物析出，得到四甲基吡嗪濕晶體，經(jīng)冷凍干燥得到粉末狀四甲基吡嗪結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明公開了以酒糟為原料，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在經(jīng)酸度調(diào)節(jié)的新鮮酒糟中補(bǔ)充適量葡萄糖0～100g/kg，加入枯草芽孢桿菌(CCTCCNOM208157)或地衣芽孢桿菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株培養(yǎng)的種子培養(yǎng)物后37℃發(fā)酵1～3天，能夠大量產(chǎn)生生物香料乙偶姻。在此基礎(chǔ)上，還可通過向上述發(fā)酵產(chǎn)物中添加銨鹽來轉(zhuǎn)化生產(chǎn)另一種生物香料四甲基吡嗪。本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)是利用酒糟為原料，通過是否添加銨鹽來有選擇的控制生產(chǎn)生物香料乙偶姻或四甲基吡嗪的方法，既可有選擇的獲得不同高附加值的生物香料，又防止了酒糟污染環(huán)境，提升了酒糟的利用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P17/12GK102618587SQ20121008961
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者吳群, 徐巖 申請(qǐng)人:江南大學(xué)