專利名稱：一種重組大米過敏原與突變體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組大米過敏原與突變體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大米含有豐富的維生素類物質(zhì)特別是B族維生素和維生素E、以及礦物質(zhì)、低糖， 是一個(gè)優(yōu)秀的碳水化合物來源。世界上大部分人，特別是生活在亞洲南部和東部的人們以大米作為主食。近年來，過敏反應(yīng)性疾病得到社會(huì)各界的重視，大米過敏越來越受到關(guān)注。 在日本、泰國等以大米為主食的國家也發(fā)現(xiàn)大米過敏病例，從嬰幼兒到成年人均可發(fā)病。大米過敏的臨床癥分為局部和全身反應(yīng)。局部反應(yīng)為風(fēng)團(tuán)、瘙癢、面部潮紅、紅暈伴丘疹、水泡等；全身反應(yīng)，包括蕁麻疹、哮喘、鼻炎、嘔吐、血管性水腫以及嬰兒小腸結(jié)腸炎綜合癥等，嚴(yán)重影響了患者的健康和生活質(zhì)量。目前，治療過敏性疾病主要方法有1)利用抗組胺藥物以及類固醇藥物可以緩解癥狀，但是不能徹底根除并且還有可能會(huì)帶來副作用。2)特異性免疫治療，被認(rèn)為是過敏性疾病唯一針對(duì)病因的治療方法，已得到普遍共識(shí)。而目前進(jìn)行特異性免疫治療主要是采用過敏原浸提液，如此一來另一個(gè)問題卻異常突出由于提取物成分復(fù)雜，而且還含有大量非特異性抗原，致使標(biāo)準(zhǔn)化困難，嚴(yán)重影響了治療效果和臨床應(yīng)用規(guī)范；同時(shí)，由于過敏原性的存在，即使是采用單純的標(biāo)準(zhǔn)化過敏原進(jìn)行免疫治療也有一定的風(fēng)險(xiǎn)。采用生物化學(xué)分離和純化技術(shù)可以獲得較純過敏原，但是這種方法純化工藝復(fù)雜且產(chǎn)量低，要消耗大量人力和財(cái)力，因此其廣泛應(yīng)用受到了較大的限制。相比較而言，利用基因工程技術(shù)，通過定點(diǎn)突變的方法獲得低過敏原性或無過敏原性的重組大米過敏原的突變體，在一定程度上可從源頭上降低治療過程中的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)能夠保留大米過敏原的生物學(xué)活性。另外，重組過敏原的生產(chǎn)條件穩(wěn)定，且標(biāo)準(zhǔn)化程序簡單，有利于廣泛應(yīng)用于臨床的診斷和治療。因此，重組弱化過敏原將是一種很好的替代方法，有廣闊的發(fā)展前景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述存在的問題及天然大米過敏原提取液的不足，在克隆表達(dá)重組大米過敏原的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)軟件分析大米過敏原的抗原表位，突變一個(gè)或多個(gè)抗原性高的位點(diǎn)，從而獲得低過敏原性的大米過敏原突變體，期望能夠安全高效地應(yīng)用于過敏性疾病的治療。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼上述重組大米過敏原及其突變體的基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有上述基因的重組質(zhì)粒載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有上述基因轉(zhuǎn)化的重組表達(dá)宿主。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述重組大米過敏原及其突變體的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組大米過敏原用作藥物或者診斷試劑的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明的重組大米過敏原，是天然存在的大米過敏原衍生的非天然存在的變異體，其核酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后，人工合成全長的重組大米過敏原基因。采用生物信息學(xué)軟件分析其抗原表位，針對(duì)一個(gè)或多個(gè)抗原性指數(shù)高的位點(diǎn)進(jìn)行有目的的置換，獲得重組大米過敏原突變體的基因，使其在保持原有生物學(xué)活性和空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，能夠有效地降低重組大米過敏原的過敏原性。然后利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，在人工控制的條件下，獲得高純度的重組大米過敏原及其突變體蛋白。與天然大米過敏原相比，該重組蛋白突變體與特異性 IgE的結(jié)合性能明顯減少，可安全地應(yīng)用于過敏性基本的預(yù)防和治療。一種重組大米過敏原，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。上述重組大米過敏原的突變體，是在重組大米過敏原的突變體的基礎(chǔ)上衍生的突變體，其中B細(xì)胞或/和T細(xì)胞表位的至少一個(gè)表面暴露的保守氨基酸殘基被在天然存在的過敏原來源的分類學(xué)目內(nèi)任何已知的同源蛋白質(zhì)氨基酸序列中的相同位置不出現(xiàn)的另一殘基取代，該突變體具有與天然出現(xiàn)的過敏原基本相同的a-碳骨架三級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明重組大米過敏原的突變體的制備方法，是在重組大米過敏原的突變體的基礎(chǔ)上衍生的突變體，其中B細(xì)胞或/和T細(xì)胞表位的至少一個(gè)表面暴露的保守氨基酸殘基被在天然存在的過敏原來源的分類學(xué)目內(nèi)任何已知的同源蛋白質(zhì)氨基酸序列中的相同位置不出現(xiàn)的另一殘基取代，該突變體具有與天然出現(xiàn)的過敏原基本相同的a-碳骨架三級(jí)結(jié)構(gòu)。更進(jìn)一步地,所述表達(dá)宿主為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),該表達(dá)系統(tǒng)名稱為Escherichia coli JM109-RA17，于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2011149， 保藏日期為2011年4月29日，保藏地點(diǎn)為中國.武漢.武漢大學(xué)；該表達(dá)宿主表達(dá)與純化后即獲得權(quán)利要求I所述的重組大米過敏原。最詳細(xì)的制備方法步驟如下
(1)從數(shù)據(jù)庫中獲取大米過敏原的核酸序列,根據(jù)表達(dá)宿主的密碼子偏好性對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后序列中GC含量為35飛5%，原氨基酸序列不變；
(2)人工合成優(yōu)化后的核酸序列；
(3)經(jīng)雙酶切后，與表達(dá)載體連接，構(gòu)建成重組載體；
(4)將重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主中，選擇陽性轉(zhuǎn)化物；
(5)在2(T38°C下，培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)化物，用濃度為0.Of 2. Ommol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為4 38°C ；
(6)所得培養(yǎng)物經(jīng)裂解宿主細(xì)胞后，純化獲得高純度的重組蛋白。本發(fā)明所述重組大米過敏原的突變體的制備方法包括如下步驟
Ca)采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測權(quán)利要求I所述重組大米過敏原的氨基酸序列的優(yōu)勢抗原表位；
(b)采用定點(diǎn)法改變抗原性高的位點(diǎn)，用天然存在的過敏原來源的分類學(xué)目內(nèi)任何已知的同源蛋白質(zhì)氨基酸序列中的相同位置不出現(xiàn)的氨基酸殘基取代原有的氨基酸殘基； (C)獲得大米過敏原突變體的基因片段，經(jīng)酶切后，與表達(dá)載體連接，構(gòu)建成突變型重組載體；(d)按照前述步驟(4) (6)的方法，獲得高純度的重組突變蛋白。本發(fā)明所述重組大米過敏原及其突變體可以用于制備藥物，制得的藥物用于治療變態(tài)反應(yīng)性疾病并使對(duì)大米過敏原乃至其它類型過敏的患者產(chǎn)生免疫耐受；或者用來診斷變態(tài)反應(yīng)性疾病或者判斷其它食品藥品的過敏源性的高低。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，經(jīng)密碼子優(yōu)化后人工合成重組大米過敏原的編碼基因，并采用生物信息學(xué)軟件分析其抗原表位，通過定點(diǎn)突變的方法，針對(duì)一個(gè)或多個(gè)抗原性高的位點(diǎn)進(jìn)行定向置換，以降低其過敏源性，構(gòu)建成低過敏原性的重組大米過敏原突變體。利用在人工控制的條件下進(jìn)行蛋白表達(dá)，獲得高純度的重組大米過敏原及其突變體蛋白。與天然大米過敏原相比，該重組蛋白突變體與特異性IgE的結(jié)合能力明顯降低，可安全地應(yīng)用于過敏性疾病的診斷與治療乃至判斷其它蛋白過敏原性的高低。
圖I重組大米過敏原蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖。圖中從左至右分別為Marker ;未誘導(dǎo)菌體；誘導(dǎo)菌體。Marker從上至下分別為97. 4，66.2，45.0，31.0，21.0，14. 4 kD。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例I重組大米過敏原的克隆與表達(dá)
(I)重組大米過敏原核酸序列的確定從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取天然大米過敏原RAGl的核酸序列(NCBI登錄號(hào)NM_001065720)，在該序列的C端加上方便純化的親和標(biāo)簽6*HIS、 STREPII或S蛋白，然后分別在序列的N端和C端加上Nde I.EcoR I、Xho I,Pst I等酶切位點(diǎn)，得到重組大米過敏原的目的基因片段RA17。(2)根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性，對(duì)目的基因RAGl的核酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使得目的基因更適合在宿主菌中表達(dá)，優(yōu)化后GC含量為35飛5%，原氨基酸序列不變，如 SEQ ID NO: I 所示。(3)人工合成優(yōu)化后的RAGl基因序列。(4)經(jīng)雙酶切后，將目的片段RAGl克隆到原核表達(dá)載體pET上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。(5)將重組表達(dá)質(zhì)粒pET- RAGl轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌Rosetta中。(6)選擇含重組表達(dá)質(zhì)粒pET- RAGl的表達(dá)宿主菌Rosetta在LB培養(yǎng)基中 30-37°C培養(yǎng)1-6小時(shí)，加入濃度為0. Of 2. 0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2_8小時(shí)，誘導(dǎo)溫度為 4-38°C。誘導(dǎo)后，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)量(見圖I)。(7)超聲破碎法裂解菌體獲得目的蛋白的包涵體，裂解液為15-100 mM Tris-Hcl, 50-300 mM NaCl, 0. 05-1. 0 mM EDTA。(8)用透析法進(jìn)行蛋白復(fù)性后，以8000-30000rpm的轉(zhuǎn)速在4°C下離心15-30 min,
收集上清液。(9)復(fù)性后得到的上清液，經(jīng)6*HIS、STREPII或S蛋白標(biāo)簽的親和層析柱獲得高純度的目的蛋白。實(shí)施例2重組大米過敏原的抗原表位分析及突變位點(diǎn)的確定
(I)運(yùn)用在線軟件平臺(tái)包括 SYFPEITHI，MHCPred, SYFPEITHI, BIMAS, NetMHC II， MHC-THREAD,EpiPredict,HLA-DR4 binding, ProPred, RankPep, SVMHC,PREDEP, PREDICT 等對(duì)重組大米過敏原的氨基酸序列的抗原指數(shù)進(jìn)行分析。綜合各軟件的分析，結(jié)果表明重組大米過敏原氨基酸序列中1-23、35-62、123-150區(qū)域的抗原值較高。(2)針對(duì)抗原值比較高的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸置換，以弱化抗原性。將抗原性改造后的氨基酸序列再進(jìn)行上述的抗原性分析，如此反復(fù)，篩選出抗原性顯著降低的突變位點(diǎn)。 實(shí)施例3重組大米過敏原突變體的構(gòu)建
(I)針對(duì)確定的突變位點(diǎn)，按照突變試劑盒提供方法設(shè)計(jì)突變體引物，Tm值一般要求大于78 °C，引物長度在25-45個(gè)堿基之間比較適宜。(2)根據(jù)突變試劑盒的要求，以重組大米過敏原的重組表達(dá)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行突變 PCR。(3)用試劑盒中提供的酶消化PCR產(chǎn)物后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，測序檢測突變是否成功。
權(quán)利要求
1.一種重組大米過敏原，其特征在于是在重組大米過敏原的基礎(chǔ)上衍生的非天然存在的突變體，其中B細(xì)胞或/和T細(xì)胞表位的至少一個(gè)表面暴露的保守氨基酸殘基被在天然存在的過敏原來源的分類學(xué)目內(nèi)任何已知的同源蛋白質(zhì)氨基酸序列中的相同位置不出現(xiàn)的另一殘基取代，該突變體具有與天然出現(xiàn)的過敏原基本相同的a-碳骨架三級(jí)結(jié)構(gòu)。
2.權(quán)利要求I所述的一種重組大米過敏原的突變體，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO: I 所示。
3.權(quán)利要求I所述一種重組大米過敏原的制備方法，其特征在于包括如下步驟編碼權(quán)利要求I所述重組大米過敏原的基因依據(jù)相應(yīng)的表達(dá)宿主的情況通過密碼子優(yōu)化得到， 并以之獲得重組載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌、酵母或植物，得到重組宿主，蛋白表達(dá)后得到權(quán)利要求I所述的重組大米過敏原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種重組大米過敏原的制備方法，其特征在于所述表達(dá)宿主為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)名稱為Escherichia coli JM109-RA17，于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2011149，保藏日期為2011年4月29日，保藏地點(diǎn)為中國.武漢.武漢大學(xué)；該表達(dá)宿主表達(dá)與純化后即獲得權(quán)利要求I所述的重組大米過敏原。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組大米過敏原的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)從數(shù)據(jù)庫中獲取大米過敏原的核酸序列,根據(jù)表達(dá)宿主的密碼子偏好性對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后序列中GC含量為35飛5%，原氨基酸序列不變；(2)人工合成優(yōu)化后的核酸序列；(3)經(jīng)雙酶切后，與表達(dá)載體連接，構(gòu)建成重組載體；(4)將重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主中，選擇陽性轉(zhuǎn)化物；(5)在2(T38°C下，培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)化物，用濃度為0.Of 2. Ommol/L的誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為4 38°C ；(6)所得培養(yǎng)物經(jīng)裂解宿主細(xì)胞后，純化獲得高純度的重組蛋白。
6.權(quán)利要求2所述的一種重組大米過敏原的突變體的制備方法，其特征在于包括如下步驟(a)采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測權(quán)利要求I所述重組大米過敏原的氨基酸序列的優(yōu)勢抗原表位；(b)采用定點(diǎn)法改變抗原性高的位點(diǎn)，用天然存在的過敏原來源的分類學(xué)目內(nèi)任何已知的同源蛋白質(zhì)氨基酸序列中的相同位置不出現(xiàn)的氨基酸殘基取代原有的氨基酸殘基；(c)獲得大米過敏原突變體的基因片段，經(jīng)酶切后，與表達(dá)載體連接，構(gòu)建成突變型重組載體；(d)按照權(quán)利要求5所述步驟(4) (6)的方法，獲得高純度的重組突變蛋白。
7.權(quán)利要求1-6所述的重組大米過敏原或其突變體在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用于治療變態(tài)反應(yīng)性疾病并使對(duì)大米過敏原乃至其它類型過敏的患者產(chǎn)生免疫耐受；或者用來診斷變態(tài)反應(yīng)性疾病或者判斷其它食品藥品的過敏原性的高低。
8.權(quán)利要求7中所述的藥物或診斷試劑，其特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求f6中任意一項(xiàng)的重組過敏原，任選與藥用或者診斷試劑中可接受的賦形劑和/或載體，并且任選佐劑和/或偶聯(lián)劑組 合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組大米過敏原與突變體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述重組大米過敏原是天然存在的過敏原衍生的非天然存在的變異體，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，經(jīng)密碼子優(yōu)化后人工合成重組大米過敏原的編碼基因，并采用生物信息學(xué)軟件分析其抗原表位，通過定點(diǎn)突變的方法，針對(duì)一個(gè)或多個(gè)抗原性高的位點(diǎn)進(jìn)行定向置換，以降低其過敏源性，構(gòu)建成低過敏原性的重組大米過敏原突變體。利用在人工控制的條件下進(jìn)行蛋白表達(dá)，獲得高純度的重組大米過敏原及其突變體蛋白。與天然大米過敏原相比，該重組蛋白突變體與特異性IgE的結(jié)合能力明顯降低，可安全地應(yīng)用于過敏性疾病的診斷與治療乃至判斷其它蛋白質(zhì)的過敏原性的高低。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102617719SQ20121008961
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者何穎, 劉雪婷, 李燕芳, 鄒澤紅, 陳惠芳, 陶愛林 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院