一種重組胸腺肽α1的制備方法

專利名稱：一種重組胸腺肽α1的制備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥生物工程技術領域，具體涉及一種重組多肽的制備方法。
背景技術：
胸腺肽α I是Goldstein等1977年首次在胸腺組織中發現的由28個氨基酸組成的多肽，天然胸腺肽α I的氨基酸序列為NH2-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-GIu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH。胸腺肽α I具有免疫調節功能，是一種廣譜免疫調節劑，臨床上用于治療乙型肝炎、丙型肝炎及腫瘤等疾病。此外，還可以用作疫苗輔助制劑。目前，胸腺肽αI的生產方法有化學合成法和基因工程法。化學合成法的成本高，使用有機溶劑多，易造成環境污染。基因工程法是通過構建能表達胸腺肽α I的工程菌株(如大腸桿菌、酵母菌等)，在發酵階段進行誘導表達，再經過純化工序而制得胸腺肽α I。中國專利(專利號ZL200410077749. 2)公開了一種通過基因工程技術制備胸腺肽α I的方法，該方法在PTRX質粒的基礎上構建表達菌株，發酵中采用IPTG誘導工程菌表達，再采用親和層析、離子交換層析純化融合蛋白，腸激酶切釋放出胸腺肽α 1，再通過親和層析和HPLC純化出胸腺肽α I。但該方法存在成本高、無法大規模生產等問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種簡便、成本低、收率高且適用于大規模生產的重組胸腺肽α I的制備方法。本發明利用基因重組技術制備重組胸腺肽α 1，包括人工合成融合蛋白基因并將所述融合蛋白基因重組到載體質粒pet_22b中構建表達載體，將該表達載體轉化到宿主大腸桿菌中構建工程菌，將所述工程菌進行發酵并誘導融合蛋白表達，對表達產物進行純化制備后得到融合蛋白目標產物。本發明的具體技術方案為一種重組胸腺肽α I的制備方法，包括以下步驟I)人工合成胸腺肽α I的融合蛋白基因全序列，如SEQ ID NO. I所示；2)將合成的基因酶切后，重組到質粒pet_22b上構建表達載體，并將表達載體轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中構建工程菌；3)將工程菌發酵培養，以乳糖作為誘導劑誘導融合蛋白表達；4)將步驟3)的表達產物進行純化，制備重組胸腺肽α I。其中，步驟3)所述的發酵培養包括3a)將步驟2)構建的工程菌于培養基中培養獲得活化的種子菌； 3b)將活化的種子菌進行高密度發酵培養，培養過程中加入補碳液和補氮液步驟
4)所述的純化包括以下步驟
4a)收集經發酵培養的工程菌，用超高壓均質機破碎，得細胞破碎液；4b)用中空纖維濾膜過濾細胞破碎液，得濾液I ;4c)濾液I經親和層析后，再經超濾除去咪唑，得濾液II ；4d)用腸激酶水解濾液II后，用親和層析和HPLC純化出胸腺肽α I。進一步地，上述濾液II在15 20°C條件下，用腸激酶水解16hr。在所述條件可以減少腸激酶對胸腺肽α I的非特異性切割，有效提高胸腺肽α I的產量。本發明的制備方法適用于大規模的工業化生產，不但顯著提高了重組胸腺肽α I的產率，而且還具有制備工藝簡單、生產成本低等有益效果。



圖I是實施例5所得胸腺肽的純度和濃度的HPLC分析圖。圖2是實施例6所得胸腺肽的純度和濃度的HPLC分析圖。圖3是實施例8中腸激酶水解融合蛋白的SDS-PAGE分析圖；其中，泳道I為胸腺肽α I對照品、泳道2-6的水解溫度分別為25°C、20°C、18°C、15。。、12。。。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明重組胸腺肽α I的制備方法進行詳細描述。表汰載體的構建實施例II、試劑和材料載體質粒pet_22b購自美國MERK公司，大腸桿菌BL21 (DE3)購自天根生化科技(北京)公司，融合蛋白基因的合成及質粒的測序委托生工生物工程(上海)有限公司合成，T4DNA連接酶、DNA限制性內切酶Nde I和Not I購自生工生物工程(上海)有限公司，膠回收試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。2、方法(I)融合蛋白基因人工合成如SEQ ID NO. I所示的融合蛋白基因全序列；在序列中含NdeI和NotI酶切位點(分別為CATATG和GCGGCCGC)和腸激酶識別序列(CATCATCATCATCATCAT)。(2)重組質粒的構建將合成的上述基因用Nde I和NotI雙酶切后，回收DNA片段，然后與經Nde I和NotI雙酶切的pet_22b質粒連接,構建出融合蛋白表達質粒。(3)將上述融合表達質粒轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，以氨芐青霉素為選擇標記，篩選出轉化子并進行酶切鑒定。(4)將重組質粒測序，以確定表達載體構建的正確性。(5)上述含表達載體的BL21 (DE3)菌株作為重組胸腺肽α I的工程菌。發酵工藝研究實施例2發酵工藝II、培養基
—級種子用LB培養基(g/L):蛋白胨IOg,酵母粉5g, NaCl 10g。二級種子用2YT培養基(g/L):蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g。發酵罐發酵培養基(g/L):蛋白胨12g，酵母粉 12g，NaC15g，KH2P044g，K2HP045g，MgSO4 · 7H20 lg，葡萄糖 2g。補碳液(400ml):葡萄糖40g, MgSO4 · 7H20 3g,。補氮液(g/L):蛋白胨37g,酵母粉37g。2、種子菌活化
取在_70°C、20%甘油中保藏的工程菌劃平板，37°C培養約16hr，挑單克隆接種于含200ml LB培養基(含氨芐青霉素100 μ g/ml)的錐形瓶中，37°C，250rpm培養10小時左右。然后按2YT培養基量的I %轉種一次，在相同條件下培養14. 5小時，即成為活化種子菌。3、發酵培養IOL發酵罐中加入8L發酵用培養基，按I : 25的比例加入活化種子菌，另加入少量消泡劑，于37°C，pH7.0的條件下發酵。發酵過程中控制溶解氧濃度在30% 60%，起始轉速為300rpm，溶解氧濃度不足時，最大轉速可達800rpm。pH使用自動流加2N的HCl或4N的NaOH調節至7. O。發酵過程中取樣測定0D600和菌體密度，當加入種子菌2hr時后開始加入補碳液，IOL發酵罐補充400ml,誘導前30min左右完成；當加入種子菌后3hr開始加入補氮液，IOL發酵罐補充2000ml，誘導完畢前Ihr左右完成。當加入種子菌后5hr加入IPTG誘導表達，誘導的終濃度為O. 6mM,誘導Ihr后將IPTG濃度補充至ImM，IPTG終濃度為ImM，37°C誘導后4hr結束，誘導前和誘導后每小時取樣，SDS-PAGE分析融合蛋白表達率。發酵結束后于4°C , 5000rpm離心IOmin收集菌體,得到濕菌體300g 320g。實施例3發酵工藝2I、培養基一級種子用LB培養基(g/L):蛋白胨IOg,酵母粉5g, NaCl 10g。二級種子用2YT培養基(g/L):蛋白胨16g,酵母粉10g, NaCl 5g。發酵罐發酵培養基(7000ml):蛋白胨80g，酵母粉100g, NaCl 60g, KH2P0445g,K2HP0450g, MgSO4 · 7H20 12g，葡萄糖 70g。補碳液(800ml):葡萄糖250g, MgSO4 · 7H20 IOg,甘油 120g。補氮液(2000ml):蛋白胨130g，酵母粉130g，硫酸銨130g。2、種子菌活化取在_70°C、20%甘油中保藏的工程菌劃平板，37°C培養約16hr，挑單克隆接種于含200ml LB培養基(含氨芐青霉素100 μ g/ml)的錐形瓶中，37°C，250rpm培養10小時左右。然后按2YT培養基量的I %轉種一次，在相同條件下培養14. 5小時，即成為活化種子菌。3、高密度發酵培養IOL發酵罐中加入7L發酵用培養基，按I : 25的比例加入活化種子菌，另加入適量消泡劑，于37°C，pH7.0的條件下發酵。發酵過程中控制溶解氧濃度在30% 60%，起始轉速為300rpm，溶解氧濃度不足時，最大轉速可達800rpm。pH使用自動流加2N的HCl或氨水調節至7. O。發酵過程中取樣測定0D600和菌體密度，當加入種子菌3hr時后開始加入補碳液，IOL發酵罐補充800ml,誘導前30min左右完成；當加入種子菌后4hr開始加入補氮液，IOL發酵罐補充2000ml,誘導完畢前Ihr左右完成。當加入種子菌后6hr —次性加入乳糖進行誘導，乳糖終濃度為10mM，37°C誘導后4hr結束，誘導前和誘導后每小時取樣，SDS-PAGE分析融合蛋白表達率。發酵結束后于4°C，5000rpm離心IOmin收集菌體，得到濕菌體 1180g 1380g。發酵工藝I和發酵工藝2的比較上述2種發酵工藝的主要區別在于第一，誘導劑不同。工藝2使用乳糖作為誘導劑，成本大大低于工藝I使用的IPTG，且乳糖是動植物和微生物體內常見成分，對細胞無毒，適合于藥物制備，而IPTG對細胞有 一定毒性。第二，培養基的成分不同，與工藝I相比，工藝2中的補碳液增加了甘油，在補氮液中增加了硫酸銨，通過工藝2培養基配方的調整，發酵液中細菌密度提高5倍以上，且不會對目標蛋白的表達產生負面影響。第三，pH調節劑不同，工藝I中使用鹽酸和氫氧化鈉作為pH調節劑，工藝2中使用鹽酸和氨水作為PH調節劑，氨水即可調節pH，又可提供細菌生長所需的氮元素，細菌生長更好。按上述工藝I (實施例2)和工藝2 (實施例3)分別進行三次發酵，發酵罐體積10L，所產生的濕菌重量及目標蛋白的表達率結果比較，如表I所示。表I :兩者發酵工藝試驗結果比較
發酵X藝發酵次數濕菌重量(g)表達率(％)
第一次發酵31628.6
實施例2的第二次發酵30030.2
發酵工藝I 第三次發酵32027.5平均31228.76
第一次發酵126027.9
實施例3的第二次發酵118029.4
發酵工藝2第三次發酵138029.8
平均127329.03
I從上表可以看出，在相同發酵液體積的情況下，利用發酵工藝2所得的濕菌重量遠遠大于發酵工藝I所得的濕菌重量。由于在這兩種工藝中，目標蛋白重組胸腺肽αI的表達率基本相似，目標蛋白表達后是存在于細菌細胞內。所以發酵工藝2所得的目標蛋白表達量遠遠大于發酵工藝I。此外，發酵工藝2使用乳糖作為誘導劑來誘導目標蛋白表達，其與發酵工藝I中使用的誘導劑IPTG的誘導能力相似，但乳糖成本大大低于IPTG，且乳糖是動植物和微生物體內常見成分，對細胞無毒，適合于藥物制備，而IPTG對細胞有一定毒性。純化工藝研究
實施例4胸腺肽αI的純化工藝II、菌體處理將發酵后收集的菌體，用10倍重量的50mM Tris-HCl (pH8. O), O. 5MNaCl，重新懸浮菌體后，采用Branson450型超聲波細胞粉碎機破碎細菌，探頭型號為1/2”，以70%的功率在冰浴下超聲15 25min，(超聲8sec，間歇4sec)。4°C、IOOOOrpm離心30收集上清液，用于精純。2、精純純化中所用層析介質 chelating sepharose FF, Q-Sepharose FastFlow, sephadex G-25, sephadex G-IO 為美國 GE 公司產品，反相 C18 柱和 prep LC300 型液相系統為美國waters公司產品。
第一步，Ni2+-chelatingsepharose 親和層析將離心上清液過 Ni2+_chelatingsepharose FF親和層析柱，棄去穿透液，然后再以50mM Tris-HCl (pH 7. O), O. 5Μ NaCl,20mM咪唑溶液洗脫，繼之以Tris-HCl (pH 7.0)，O. 5M NaCl，150mM咪唑溶液洗脫，收集融合蛋白峰流出液。第二步，Q-Sepharose Fast Flow離子交換將第一步收集的融合蛋白溶液,通過 S印hadex G-25 柱更換成 20mM Tris-HCl (pH 8. 0)，20mM NaCl 緩沖液后上 Q-S印haroseFast Flow柱，用50mM Tris-HCl (pH 8. 0), 150mM NaCl進行洗脫，收集洗脫峰用于酶切。第三步，腸激酶水解融合蛋白在第二步收集的融合蛋白峰液中，紫外法測定超濾處理后蛋白溶液濃度，加入腸激酶，于15°C水解16小時,按每μ I腸激酶切割4mg融合蛋白的比例酶切。第四步Ni2+_chelatingsepharose 親和層析先用 50mM Tris-HCl (pH 8. 0),0. 5Μ NaCl,緩沖液平衡親和層析柱,將融合蛋白水解液上柱，收集穿透液,通過sephadexG-10柱將其中的緩沖液置換成超純水。第五步制備型HPLC (C18)純化流動相A (乙腈)，流動相B (0. OlM KH2PO4,)，按流動相5 %流動相A到30 %流動相A進行梯度洗脫，洗脫時間為30分鐘，收集胸腺肽α I峰，進行分析型反相HPLC(C18柱)分析其純度，測定其含量。實施例5胸腺肽αI的純化工藝2I、菌體處理將發酵后收集的菌體，用10倍重量的50mM Tris-HCl (pH 8. 0)，0. 5MNaCl,20mM咪唑溶液重新懸浮菌體，用低溫超高壓連續流細胞破碎機(廣州聚能JN-100C)破碎2次,利用中空纖維濾膜過濾(美國PALL公司，孔徑0. I μ m 0. 65 μ m),并洗濾3 5倍體積。2、精純純化中所用層析介質chelating sepharose FF, sephadex G-10為美國GE公司產品，反相C18柱和prep LC300型液相系統為美國raters公司產品，超濾系統和超濾膜為美國mi I Iipore公司產品。第一步，Ni2+-chelatingsepharose 親和層析先用 50mM Tris-HCl (pH 8.0)，0. 5M NaCl，20mM咪唑，緩沖液平衡親和層析柱，將過濾后收集的澄清液體上柱，棄去穿透液，然后再以50mM Tris-HCKpH 7. 0),0. 5M NaCl，20mM咪唑，緩沖液平衡層析柱，繼之以Tris-HCKpH 7. 0),0. 5M NaCl，150mM咪唑，緩沖液洗脫，收集融合蛋白峰流出液。第二步，腸激酶水解融合蛋白將第一步收集的融合蛋白峰流出液，先以截留分子量為5KD或10KD的超濾膜超濾除去咪唑并將其中的緩沖液置換為20m mo I/L Tris-HCl,pH8. 0, 20mM NaCl緩沖液，超濾后體積約為超濾如的90%左右,紫外法測定超濾處理后蛋白溶液濃度，加入腸激酶，于15°C水解16小時。按每I μ I腸激酶切割4mg融合蛋白的比例酶切。第三步Ni2+_chelatingsepharose 親和層析先用 50mM Tris-HCl (pH 8. O),O. 5Μ NaCl,緩沖液平衡親和層析柱,將融合蛋白水解液上柱，收集穿透液,通過sephadexG-IO柱將其中的緩沖液置換成超純水。第四步制備型HPLC(Cl8)純化:流動相A(乙腈)，流動相B(0. OlM KH2PO4,)，按流動相5 %流動相A到30 %流動相A進行梯度洗脫，洗脫時間為30分鐘，收集胸腺肽α I峰，進行分析型反相HPLC(C18柱)分析其純度，測定其含量。純化工藝I和純化工藝2的比較第一，在純化工藝I中，采用超聲波細胞粉碎機破碎細菌，由于目前市場上超聲波破碎機功率有限，該方法只適宜于試驗研究，無法規模化生產。而工藝2采用超高壓均質機破碎細菌，可以實現大規模生產。 第二，在純化工藝I中，細胞破碎液采用IOOOOrpm離心30min中的方法進行固液分離，很難實現大規模生產，而且離心效果不佳。而工藝2采用中空纖維過濾的方法進行分離，試驗證明，工藝2的方法所得液體更澄清，不會污染下一工序的層析介質，同時，通過放大膜面積，很容易實現規模化生產。第三,與純化工藝I中采用sephadex G-25的方法不同，工藝2采用超濾的方法除去咪唑，可以節省時間，省去層析介質成本，因為sephadex G_25為進口介質,使用次數有限，價格昂貴，層析過程耗時很長。而采用超濾方法后，除去咪唑后的溶液同樣可順利用于下一步的酶切工序，不影響酶切效果，而所用工時縮短一半以上。第四，在純化融合蛋白的步驟中，與工藝2不同，工藝I不采用離子交換的方法，而是除去咪唑后直接酶切，試驗證明，減少離子交換步驟，可以提高產量20 %以上，而且最終產品的純度和質量絲毫不受影響。所以工藝2減少了工序，明顯提高了產率。純化工藝I (實施例4)的分析結果如圖I所示，純化工藝2 (實施例5)的分析結果如圖2所示。通過和標準品的HPLC分析圖對照，計算出實施例4和實施例5方法制備的胸腺肽α I的含量，再計算出每克菌體所得到的胸腺肽α I毫克數，結果如表2所示。表2 :胸腺肽α I的質量
樣品純度每克菌體所得胸腺肽a I毫克數~
實施例 498.4%1.98mg
實施例 599. I %2. 50mg實施例6腸激酶最適水解溫度的篩選腸激酶是專一性很高的蛋白水解酶，其切割位點為DDDDK(天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸)后面的肽鍵，但有時也出現非特異性切割的現象。一般使用融合表達時，特意在融合蛋白序列中，設計了該位點，以便利用腸激酶將目標多肽釋放出來。若減少腸激酶對胸腺肽α I的非特異性切割，可有效提高胸腺肽α I的產量。本發明對腸激酶的水解溫度和時間進行了篩選，融合蛋白溶液濃度為4mg/ml，緩沖液為20mM Tris-HCl (pH 8. 0), 20mM NaCl，于融合蛋白溶液中加入腸激酶溶液，按每微升(μ D腸激酶切割4mg融合蛋白的比例加入混勻，分成兩份，分別置25°C，20°C，18°C，15°C，12°C的條件下進行水解，水解時間16hr，水解結束后，取樣進行SDS-PAGE分析，確定水解最適合溫度。結果如圖3所示。從圖3中可以看出，而25°C、20°C、18°C水解后，融合蛋白已被完全水解，但同時出現了較強的胸腺肽α I的非特異性水解，電泳圖中出現了較深的一條 小分子帶，而目的多肽胸腺肽α I的電泳帶變淺，說明造成了胸腺肽α I的損失，減少了胸腺肽α I的產量。而15°C水解條件下，非特異性水解較少，而目的多肽胸腺肽α I的帶最深，說明該條件下目的多肽胸腺肽α I產率最高，故選用15°C作為水解溫度。
權利要求
1.一種重組胸腺肽α I的制備方法，包括以下步驟 1)人工合成胸腺肽αI的融合蛋白基因全序列，所述基因序列如SEQ ID NO. I所示； 2)將合成的基因酶切后，重組到質粒pet_22b上構建表達載體，并將表達載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中構建工程菌； 3)將工程菌發酵培養，以乳糖作為誘導劑誘導融合蛋白表達； 4)將步驟3)獲得的表達產物按下述步驟進行純化，制備重組胸腺肽αI ； 4a)收集經發酵培養的工程菌，懸浮菌體，用超高壓均質機破碎，得細胞破碎液； 4b)用中空纖維濾膜過濾細胞破碎液，得濾液I ; 4c)濾液I經親和層析后，再經超濾，得濾液II ； 4d)用腸激酶水解濾液II后，用親和層析和HPLC純化出胸腺肽α I。
2.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述純化包括以下步驟 4a)收集經發酵培養的工程菌，用10倍重量的50mM Tris-HCl (pH 8. O)，O. 5MNaCl，20mM咪唑溶液重新懸浮菌體，然后用超高壓均質機破碎，得細胞破碎液； 4b)用孔徑O. I μ m O. 65 μ m的中空纖維濾膜過濾細胞破碎液的上清液，并洗濾3 5倍體積得濾液I ; 4c)用50mM Tris-HCl (pH 8. 0),0. 5M NaCl，20mM咪唑的緩沖液平衡親和層析柱，將濾液I上柱，棄去穿透液，然后再以50mM Tris-HCl (pH 7. 0),0. 5M NaCl，20mM咪唑的緩沖液平衡層析柱，以Tris-HCl (pH 7. 0),0. 5M NaCl，150mM咪唑的緩沖液洗脫，收集融合蛋白峰流出液，以截留分子量為5KD或IOKD的超濾膜超濾除去流出液中的咪唑，并將其中的緩沖液置換為 20mmol/LTris-HCl，pH8. 0,20mM NaCl 的緩沖液，得濾液 II ； 4d)測定濾液II的蛋白質濃度，以I μ I腸激酶切割4mg融合蛋白的比例加入腸激酶，于15°C水解16小時，用50mM Tris-HCl (pH 8. 0),0. 5M NaCl的緩沖液平衡親和層析柱，將融合蛋白水解液上柱，收集穿透液，并將其中的緩沖液置換成超純水，然后用HPLC純化出胸腺肽α I。
3.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟3)所述發酵包括以下步驟 3a)將步驟2)構建的工程菌于培養基中培養獲得活化的種子菌； 3b)將活化的種子菌進行高密度發酵培養，培養過程中加入補碳液和補氮液，以鹽酸-氨水調節PH，加入乳糖誘導劑培養獲得含表達的胸腺肽α I的菌體；其中補碳液含葡萄糖、MgSO4 · 7Η20和甘油，補氮液含蛋白胨，酵母粉和硫酸銨。
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3b)包括 i)向發酵罐中加入發酵培養基，每升發酵培養基組成為蛋白胨11.43g，酵母粉14.3g，NaCl 8. 57g，ΚΗ2Ρ046· 43g，Κ2ΗΡ047· 14g，MgSO4 · 7H20 I. 71g，葡萄糖 10g，按體積比I 25向發酵培養基中加入活化種子菌，另加入消泡劑，于37°C，pH7. O的條件下發酵； ii)控制發酵過程的溶解氧濃度為30% 60%，轉速為300-800rpm，自動流加2N的HCl或氨水將發酵液的pH調節至7. O ； iii)加入種子菌后3hr時至誘導前30min,連續向發酵罐加入補碳液,每升補碳液組成為葡萄糖 312. 5g，MgSO4 · 7H20 12. 5g，甘油 150g ； iv)加入種子菌后4hr至誘導完畢前lhr,連續向發酵罐加入補氮液,每升補氮液組成為蛋白胨65g,酵母粉65g,硫酸銨65g ;v)加入種子菌后6hr—次性加入乳糖進行誘導,使乳糖終濃度為IOmM,誘導4hr后收集菌體。
全文摘要
本發明利用基因重組技術制備重組胸腺肽α1，包括人工合成融合蛋白基因并將所述融合蛋白基因重組到載體質粒pet-22b中構建表達載體，將該表達載體轉化到宿主大腸桿菌中構建工程菌，將所述工程菌進行發酵并誘導融合蛋白表達，對表達產物進行純化制備后得到融合蛋白目標產物。
文檔編號C12N15/70GK102660568SQ20121008628
公開日2012年9月12日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者丁佳萱, 朱瑞東, 柴向東, 羅豪暉, 蔣為民, 趙秦, 韓杰, 高琰 申請人:深圳市海王英特龍生物技術股份有限公司