專利名稱：家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子及其重組表達載體和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種組織特異性啟動子及其表達載體和應用。
背景技術：
家蠶在天然條件下產出的絲纖維是一種在紡織工業、生物醫學等領域具有廣泛應用的纖維材料。蜘蛛與家蠶具有相似的紡絲體，但其產出的絲纖維卻較蠶絲具有更強的硬度和更出色的韌性。絲纖維在生物體內的形成是一個極其復雜的過程，至今都沒有獲得完全闡明。現有的合成纖維都是人工模擬昆蟲天然產絲的過程，在體外進行合成，但是其力學性能還遠不能和蜘蛛絲纖維進行對比。如果能使家蠶高效、特異地產出大量優質的類蜘蛛絲纖維，對于優質纖維材料的獲取具有非常重要的意義。家蠶前部絲腺是向列型液晶形成的場所，離子強度對絲纖維的形成具有重要作用。利用家蠶前部絲腺特異啟動子過量表達外源蛋白例如家蠶前部絲腺的某些離子通路蛋白，可能使絲纖維性質發生改變，獲得更加優良的蠶絲纖維。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種家蠶表皮蛋白啟動子及其重組表達載體和應用，該啟動子可以使外源蛋白在家蠶前部絲腺特異性表達，利用該啟動子在家蠶前部絲腺調控某些離子通路蛋白的表達，可能使絲纖維性質發生改變，獲得更加優良的蠶絲纖維。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案
I、家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子，由SEQ ID No. I所示核苷酸序列組成。2、含有所述家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子的重組表達載體。進一步，所述重組表達載體為pBac[BmCP274-表達基因-SV40，3xP3EGFP]， 是將由家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子、表達基因序列和SV40終止信號組成的表達框 [BmCP274-表達基因-SV40]插入穿梭載體pSLfall80fa的多克隆位點中，獲得重組載體 pSL [BmCP274-表達基因-SV40]，再用Asc I從重組載體pSL [BmCP274-表達基因-SV40]中切下[BmCP274-表達基因-SV40]片段，與同樣經Asc I酶切的載體pBac [3xP3_EGFPafm] 連接，即得。進一步，所述表達基因為紅色熒光蛋白DeRed基因。3、所述家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子作為家蠶前部絲腺特異性啟動子的應用。本發明的有益效果在于本發明利用蛋白質組學手段鑒定到一個在家蠶前部絲腺特異并且高量表達的表皮蛋白BmCP274，對其啟動子序列進行了克隆，并以DsRed基因為代表基因構建了由BmCP274啟動子調控的DsRed表達載體，將該表達載體顯微注射入家蠶體內獲得了轉基因家蠶陽性個體，對該轉基因家蠶陽性個體的研究發現，BmCP274啟動子驅動 DsRed在家蠶前部絲腺特異表達，因此，BmCP274啟動子可以作為家蠶前部絲腺特異性啟動子應用。利用BmCP274啟動子在家蠶前部絲腺調控某些離子通路蛋白的表達，可能使絲纖維性質發生改變，獲得更加優良的蠶絲纖維，從而本發明為下一步研究通過調控家蠶前部
3絲腺的離子通路蛋白表達來影響家蠶吐絲行為和改良絲纖維性能打下了基礎，而本發明提供的含有BmCP274啟動子的重組表達載體為上述研究提供了有力的工具。
圖I為BmCP274啟動子轉基因家蠶不同時期在白光和熒光照射下的照片，其中a 和b分別為白光和熒光照射下的卵，c和d分別為白光和熒光照射下的成蟲，e和f分別為白光和突光照射下的家蠶苗殼。圖2為BmCP274啟動子轉基因家蠶的絲腺解剖圖，其中a和b分別為白光和熒光照射下的轉基因家蠶絲腺，c和d分別為白光和熒光照射下的非轉基因家蠶大造絲腺。圖3為BmCP274啟動子轉基因家蠶的Southern blot分析，其中I為Tran 2K plus DNA Marker，2為經Bgl II酶切的非轉基因家蠶大造蠶蛾DNA，3為經Bgl II酶切的轉基因家蠶Gl代蠶蛾DNA，4為增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因(陽性對照)。圖4為BmCP274啟動子轉基因家蠶在前部絲腺特異表達DsRed的Western blot 分析，其中I為轉基因家蠶前部絲腺蛋白，2為非轉基因家蠶大造前部絲腺蛋白。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中使用的家蠶品種為大造，由中國西南大學家蠶基因資源庫提供。一、家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子的克隆
根據家蠶基因組數據庫中序列nscaf 1681，設計I對上下游引物。設計的引物委托生工生物工程(上海)有限公司進行合成。引物序列如下
274-F 5' -ttgtcgacgtagcctttacataatatgccg-3' (SEQ ID No. 2,下劃線部分為 Sal I 酶切位點)；
274-R :5’ -gaagatctctttcctggtgatcgatgg-3' (SEQ ID No. 3,下劃線部分為 Bgl II 酶切位點)。以五齡第三天的大造基因組DNA為模板，采用引物274-F和274-R擴增BmCP274啟動子片段(SEQ ID No. I)。PCR反應條件為94°C預變性4分鐘；然后94°C變性40秒，51°C 退火40秒，72°C延伸I. 5分鐘，共24個循環；最后72°C延伸10分鐘。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收純化目的片段，再克隆入載體PMD19-T Simple(TaKaRa),獲得重組載體 pMD19-BmCP274。二、BmCP274啟動子調控的DsRed表達載體的構建
將重組載體pMD19-BmCP274用Sal I和Bgl II雙酶切，回收BmCP274啟動子片段，再與同樣經Sal I和Bgl II雙酶切的載體pSL[MCS-DsRed-SV40]進行連接，獲得重組載體 pSL[BmCP274-DsRed-SV40]。所述載體 pSL[MCS-DsRed_SV40]系參照文獻方法(Horn and ffimmer, 2000),利用pSLfall80fa克隆穿梭載體,采用兩步克隆法構建而得,具體構建方法見中國專利申請20110423280. 3。將重組載體pSL [BmCP274-DsRed-SV40]用 Asc I 酶切，回收 BmCP274-DsRed_SV40片段，再與同樣經Asc I酶切的載體pBac [3xP3-EGFPafm]進行連接，獲得重組載體 pBac [BmCP274-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]。所述載體 pBac [3xP3-EGFPafm]系參照文獻方法 (Horn and ffimmer, 2000)構建而得。三、BmCP274啟動子調控的DsRed表達載體轉基因家蠶的獲得
將重組載體pBac[BmCP274-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]與編碼piggyBac轉座酶的轉基因輔助載體pHA3PIG等摩爾比混合，通過顯微注射入已解除滯育的大造早期胚胎(產卵后2飛小時，GO代)中，注射后的蠶卵用無毒膠水封口，25°C催青至孵化，孵化的幼蟲采用人工飼料飼育，至成蟲后進行自交制種，獲得的卵期第7天的蠶卵(Gl代)在宏觀體視熒光顯微鏡 (Olympus MVX10)下利用波長為46(T490nm的激發光檢測綠色熒光，篩選出在眼睛或神經特異激發綠色熒光的轉基因陽性個體(圖I a-d)，即獲得BmCP274啟動子轉基因家蠶。隨機選取BmCP274啟動子轉基因家蠶Gl代蠶蛾，提取基因組DNA進行Southern blot檢測，結果如圖3所示，EGFP的插入拷貝數為I個，DsRed與EGFP處在同一個轉座子區域中，其插入拷貝數也為I個，表明攜帶DsRed的piggyBac轉座元件在BmCP274啟動子轉基因家蠶的基因組中發生了I次轉座事件。四、BmCP274啟動子調控的DsRed表達載體在轉基因家蠶前部絲腺的特異表達
I、熒光觀察DsRed在轉基因家蠶中的時期與組織特異性
隨機選取BmCP274啟動子轉基因家蠶，于胚胎發育后期開始進行連續的熒光檢測，結果發現，在蟻蠶時就可以觀察到前部絲腺發出紅色熒光，之后隨著轉基因家蠶的發育，紅色熒光越來越強。將五齡第一天的BmCP274啟動子轉基因家蠶進行解剖后發現，紅色熒光是從前部絲腺發出且無性別差異，而在其它組織如中腸、生殖腺等中沒有觀察到紅色熒光，在轉基因家蠶的繭殼中也沒有觀察到紅色熒光(圖I e，f)。將BmCP274啟動子轉基因家蠶與非轉基因家蠶的絲腺進行解剖后發現，只有在BmCP274啟動子轉基因家蠶的前部絲腺中才能檢測到紅色熒光(圖2)。2、RT-PCR檢測DsRed基因在轉基因家蠶中的時期與組織特異性
分別取自五齡起蠶時期至蛹期第二天的轉基因家蠶個體，以及五齡第三天轉基因家蠶的各組織樣品，在液氮中快速研磨并提取總RNA，反轉錄成cDNA，采用DsRed基因特異引物[DsRed-F :5，-atggtgcgctcctccaagaacg-3，(SEQ ID No. 4) ;DsRed_R : 5’ -ctacaggaacaggtggtggc-gg-3’ (SEQ ID No. 5)]進行 RT-PCR 檢測，以 Actin3 為對照。 PCR反應條件為94°C預變性4分鐘；然后94°C變性15秒，65°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，共24個循環；最后72°C延伸10分鐘。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，在時期特異性方面，DsRed基因自五齡起蠶時期至上蔟12小時都有高量表達，而自上蔟 12小時后表達量急劇下降；在組織特異性方面，DsRed基因只在家蠶前部絲腺表達。3、Western blot檢測DsRed在轉基因家蠶前部絲腺中的表達
分別取五齡第三天的BmCP274啟動子轉基因家蠶和非轉基因家蠶的前部絲腺，在液氮中快速研磨溶于8mol/L尿素緩沖液中，4°C放置I小時，離心取上清，測定總蛋白濃度，再與 5X加樣緩沖液混合，100°C變性10分鐘，進行10% SDS-聚丙稀酰胺膠凝膠電泳，電泳完畢后，以Anti-DsRed抗體為一抗、Tubulin抗體為內參照抗體進行Western blot分析。結果如圖4所示，DsRed在BmCP274啟動子轉基因家蠶的前部絲腺中表達，而在非轉基因家蠶前部絲腺中沒有表達。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。
權利要求
1.家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子，其特征在于，由SEQID No. I所示核苷酸序列組成。
2.含有權利要求I所述家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子的重組表達載體。
3.根據權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體為 pBac[BmCP274-表達基因-SV40, 3xP3EGFP]，是將由家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子、表達基因序列和SV40終止信號組成的表達框[BmCP274-表達基因-SV40]插入穿梭載體 pSLfall80fa的多克隆位點中，獲得重組載體pSL[BmCP274_表達基因-SV40]，再用Asc I 從重組載體pSL[BmCP274-表達基因-SV40]中切下[BmCP274_表達基因-SV40]片段，與同樣經Asc I酶切的載體pBac[3xP3-EGFPafm]連接，即得。
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述表達基因為紅色熒光蛋白 DsRed基因。
5.權利要求I所述的家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子作為家蠶前部絲腺特異性啟動子的應用。
全文摘要
本發明公開了一個家蠶表皮蛋白BmCP274啟動子，由SEQ ID No.1所示核苷酸序列組成；該啟動子可以驅動外源蛋白在家蠶前部絲腺特異表達，可作為家蠶前部絲腺特異性啟動子應用；本發明還公開了含有該啟動子的重組表達載體，為下一步研究通過調控家蠶前部絲腺的離子通路蛋白表達來影響家蠶吐絲行為和改良絲纖維性能提供了有力的工具。
文檔編號C12N15/866GK102604953SQ20121008585
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者夏慶友, 徐漢福, 王鑫, 衣啟營, 趙萍, 馬三垣 申請人:西南大學