專利名稱：一粒小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子遺傳學領域，涉及小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標記及其應用。
背景技術：
小麥是全球最主要的糧食作物，在中國也是僅次水稻的第二大糧食作物。目前，世 界小麥毎年的產量約為6. 2億噸，提供了人類所需的1/5能量，小麥的生產關乎著人類生存。普通小麥是ー個異源六倍體物種，含有A、B、D三個不同的染色體組，與小麥基因組具有同源或部分同源的野生種及原始種中蘊含了豐富的基因資源。利用小麥種質資源中優異的等位變異是實現小麥穩產、增產的關鍵因素。小麥白粉病是由子囊菌綱中高度專性寄生的禾谷白粉菌小麥專化型Blumeriagraminis f. sp. tritici侵染而引起的一種氣傳病。它引起的小麥白粉病是由ー種嚴重的小麥葉部病害。病菌侵染小麥后，吸收植株營養，使小麥植株的光合能力下降甚至完全喪失，最終導致成穗數、穗粒數和千粒重下降，能夠導致小麥產量損失5% 34%，嚴重時能達到45%甚至絕收。在眾多的的小麥白粉病防治措施中，培育和推廣抗病品種最為經濟有效并且環保。當前生產上抗白粉病利用的主要是質量抗性基因。但是，由于白粉病質量抗性具有小種專化性，病原菌的無毒基因與抗性基因進行協同進化，在生產上大面積推廣使用單ー抗病品種很容易導致產生新的毒性小種，從而使所攜帯的抗病基因喪失其抗性。從小麥種質資源中發掘與利用新的抗白粉基因是小麥遺傳學家和育種家們的一個長期目標與挑戰。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標記。本發明的另一目的是提供該小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標記應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標記，所述的分子標記MAG5827 ；所述的分子標記MAG5827 左端引物序列為SEQ ID NO. 1，右端引物序列為SEQ ID NO. 2，擴增產物為282bp，此分子標記來自一粒小麥TA20337AL染色體，為共顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2. 0測得與Mlm2033基因的遺傳距離為0. 4cM。所述的分子標記在小麥種質資源中抗白粉病基因的鑒定和轉移中的應用。一粒小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標記方法，用以下的任意ー對分子標記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產物分子標記MAG5827
左端引物序列為SEQ ID NO. 1，右端引物序列為SEQ ID NO. 2 ；如果用引物MAG5827能夠擴增出282bp的擴增片段，則標志著待檢小麥存在抗白粉病基因Mlm2033。ー種篩選抗白粉病小麥的方法，其特征在于用權利要求I所述的引物對之ー擴增待檢小麥基因組DNA，如果用引物MAG5827能夠擴增出282bp的擴增片段，則標志該待檢小麥為存在抗白粉病Mlm2033的抗白粉病小麥。上述小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標記可通過以下方法獲得( 一)TA2033與M389F2代的創建與表型鑒定
(I)栽培一粒小麥TA2033 (3)與栽培一粒小麥M389 (早)進行雜交得到雜種F1,
F1自交產生F2群體。(2)F2代群體單株種植于穴盤，放置溫室，白天22度14小時，晚上18度10小吋。一葉一心期接種白粉病，接種7天后進行抗性調查。鑒定結果見表I。(3)F2代單株調查后將感病植株移苗大田，自交所得種子為F3家系。每個F3家系中選擇18粒進行子代測驗。(4)通過對F2進行遺傳分析，推定抗病種質中攜帶的抗病基因的個數。( ニ)多態性分子標記篩選(5)將6株抗病F2單株的葉片等量混合成抗池，6株感病F2單株的葉片等量混合成感池。用SDS法(Ma and Sorrells, 1995)提取抗病親本TA2033、感病親本M389、抗池和感池的DNA,應用簡單重復序列標記SSR與BSA (Bulk segregant analysis)結合的方法進行多態性篩選。(6)首先利用37對SSR引物對TA2033、M389、抗池和感池進行多態性篩選。PCR 反應體積為 25 微升，其中 IOXbuffer 2. 5 微升，25mM MgC121. 5 微升，2. 5mMdNTPs 2微升，Taq酶(5單位/微升)0. 2微升，10 y M引物(F/R)各0. 5微升，模板DNA20納克，加水至25微升；SSR反應體系為DNA 94°C預變性3min后，94°C變性lmin，50_65°C (視引物而定)退火lmin，72°C延伸lmin，循環35次，最后72°C延伸IOmin ； 在PCR擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，然后在紫外透射儀上照相，記錄結果選擇在親本間和F2代群體的R、S池間擴增出相同有多態型的引物，與Mlm2033連鎖的候選分子標記I對；(三)分子標記獲得(7)分子標記的開發，上述標記ZMG132被定位于小麥7AL，由于小麥的第七群與短柄草的第一群有宏觀共線性，利用短柄草對應的區段捜索小麥EST并開發標記，其中根據EST CJ579028轉化的標記，MAG5827的PCR產物在抗感親本及抗感池中有一致的多態。(8)根據連鎖交換規律，利用擴增獲得的純和感病家系各單株的基因型資料與抗性鑒定獲得的抗性資料構建I對分子標記與Mlm2033基因的連鎖圖，所用軟件為MapmakerMacintosh V 2. 0，獲得了與Mlm2033緊密連鎖的分子標記MAG5827，利用MapmakerMacintosh V 2. 0測得與Mlm2033基因的遺傳距離分別為0. 4cM ；
(四)抗譜的獲得(9)利用本實驗室全部 的15個白粉病生理小種分別接種抗病材料TA2033，記錄抗病材料TA2033對不同生理小種的抗病表現。(五)向普通小麥的轉移(10)利用獲得的分子標記，通過先將抗病基因Mlm2033導入到四倍體中，再導入到普通小麥獲得攜帯有Mlm2033的普通小麥品種(簡稱為橋梁親本法)。有益效果本發明在一粒小麥中發現了ー個抗白粉病基因Mlm2033，Mlm2033優異的抗病表現使得其在抗白粉病育種中有重要的價值。獲得了與其緊密連鎖的分子標記MAG5827。利用獲得的分子標記，通過橋梁親本法將Mlm2033轉移到推廣品種揚麥158中，成功獲得了攜帶有Mlm2033的抗病揚麥158。I、在一粒小麥中鑒定了ー個抗白粉病基因Mlm2033。2、對Mlm2033的抗譜進行測定，結果顯示Mlm2033抗本實驗室全部15個白粉病生理小種，具有優異的抗性，是白粉病育種中優良的抗病基因。3、獲得了與小麥抗白粉病基因Mlm2033緊密連鎖的分子標記MAG5827。MAG5827與基因的遺傳距離為0. 4cM,同時也是共顯性分子標記，能夠幫助該基因向推廣品種中轉移以及與其它抗病基因聚合。4、鑒定方便。分子標記具有檢測方便、擴增穩定、簡便等優點。用標記MAG5827檢測小麥抗白粉病基因Mlm2033，可以確定Mlm2033的存在與否以及存在狀態，并預測白粉病抗性，進而加快轉移Mlm2033的利用。5、本發明提出了利用一粒小麥種質資源中抗白粉病基因的方法利用分子標記篩選，通過橋梁親本法將Mlm2033導入到六倍體小麥中；利用該方法成功獲得了抗白粉病的揚麥158。
圖I分子標記擴增帶型MAG5827擴增帶型，其中I，2，3，4分別為抗病品種TA2033、感病品種M389、抗池和感池，M :pUC19/MspI，箭頭所指為282bp特異擴增條帶；圖2MAG5827與小麥抗白粉病基因Mlm2033的遺傳連鎖圖，左邊為標記間的圖距，箭頭所指方向為端粒方向。
具體實施例方式實施例I( 一)TA2033與M389F2代的創建與表型鑒定( 一 ) TA2033與M389F2代的創建與表型鑒定(I)栽培一粒小麥TA2033 (3)與栽培一粒小麥M389 (早)進行雜交得到雜種F1,
F1自交產生F2群體。(2)F2代群體單株種植于穴盤，放置溫室，白天22度14小時，晚上18度10小吋。一葉一心期接種白粉病，接種7天后進行抗性調查。鑒定結果見表I。
表IBgt 19 接種后 M389 X TA2033F2 群體 0058](3)F2代單株調查后將感病植株移苗大田，自交所得種子為F3家系。每個F3家系中選擇18粒進行子代測驗。驗證感病單株是否為純和感病家系。(4)通過對ろ進行遺傳分析，發現抗病種質TA2033中攜帯有ー個顯性抗病基因。( ニ)多態性分子標記篩選(I)將6株抗病F2單株的葉片等量混合成抗池，6株感病F2單株的葉片等量混合成感池。用SDS法(Ma and Sorrells, 1995)提取抗病親本TA2033、感病親本M389、抗池和感池的DNA,應用簡單重復序列標記SSR與BSA (Bulk segregant analysis)結合的方法進行多態性篩選。(2)首先利用 37 對 SSR 引物(bare =Song QJ, Shi JR, Singh S，Fickus Eff,Costa JM, Lewis J, Gill BS, Ward R, Cregan PB (2005) Development and mappingof microsatellite (SSR)markers in wheat.Theor Appl Genet 110 :550-560 ;gwm :Roder MS, Korzun V, Wendehake K, Plaschke J, Tixer MH, Leroy P, Ganal MW(1998)Amicrosatellite map of wheat. Genetics 149 :2007-2023；wmc ffheat MicrosatelliteConsortium(http://wheat, pw. usda. gov) ；cfa, gpw :Sourdille，s lab(http://wheat.pw.usda.gov) ；cfd Guyomarc> h H, Sourdille P, Charmet G, Edwards KJ, BernardM(2002)Characterization of polymorphic microsate丄Iite markers from Aegilopstauschn and transferaoility to the D—genome of bread wheat. Theor Appl Genet104 :1164-1172 ；gdm Pestsova E, Ganal MW, Rflder MS (2000) Isolation and mappingof microsatel丄ite markers speciffc for the D genome of bread wheat. Genome 43:689-697)對TA2033、M389、抗池和感池進行多態性篩選。PCR 反應體積為 25 微升，其中 IOXbuffer 2. 5 微升，25mM MgC121. 5 微升，2. 5mMdNTPs 2微升，Taq酶(5單位/微升)0. 2微升，10 y M引物(F/R)各0. 5微升，模板DNA 20納克，加水至25微升；SSR反應體系為DNA 94°C預變性3min后，94°C變性lmin，50_65°C (視引物而定)退火lmin，72°C延伸展lmin，循環35次，最后72°C延伸IOmin ；其中SSR標記ZMG132在抗感親本與抗感池之間檢測到了一致多態。(三)分子標記的開發(3)分子標記的開發，根據 Singriin 的定位結果(Singriin C, Hsam SLK, ZellerFJ, Wenzel Lr, Mohler V(2004)Localization of a novel recessive powdery mildewresistance gene from common wheat line RD30in the terminal region of chromosome7AL. Theor Appl Genet 109 :210-214)，ZMG132被定位于7AL。由于小麥的第七群與短柄草的第一群有宏觀共線性，利用短柄草對應的區段捜索小麥EST并開發標記，其中根據ESTCJ579028轉化的標記，MAG5827的PCR產物在抗感親本及抗感池中有一致的多態(圖I)。(4)根據連鎖交換規律，利用擴增獲得的純和感病家系各單株的基因型資料與抗性鑒定獲得的抗性資料構建I對分子標記與Mlm2033基因的連鎖圖，所用軟件為MapmakerMacintosh V 2. 0，獲得了與Mlm2033緊密連鎖的分子標記MAG5827，利用MapmakerMacintosh V 2. 0測得與Mlm2033基因的遺傳距離分別為0. 4cM(圖2)；(四)抗譜的獲得(5)利用本實驗室全部的15個白粉病生理小種分別接種抗病材料TA2033，結果發現TA2033對15個生理小種表現抗病，是優良的抗病基因。(五)向普通小麥的轉移
(6)利用獲得的分子標記，通過先將抗病基因Mlm2033導入到四倍體中，再導入到普通小麥獲得攜帯有Mlm2033的普通小麥品種(簡稱為橋梁親本法)。利用上述策略，成功獲得了攜帶有Mlm2033的抗病揚麥158。小麥種質資源中蘊含豐富的基因資源，利用這些基因資源對于小麥具有重要作用。本發明通過將抗病種質TA2033與感病品種雜交，通過遺傳分析確定抗病材料中攜帯有ー個顯性的抗病基因，通過分子標記篩選，并構建分離群體，發現抗病基因位于小麥7AL染色體上，通過構建分離群體同時利用分子標記的方法構建了抗病基因Mlm2033的遺傳連鎖圖。抗譜測試發現Mlm2033具有優異的白粉病抗性，是小麥抗白粉病育種的優良抗源。利用分子標記MAG5827，通過橋梁親本法成功將抗白粉病基因Mlm2033導入到推廣品種揚麥158中。在傳統育種的方法中，由于不知道抗病材料的遺傳及其連鎖的分子標記，每代轉移都需要抗性鑒定，費時費力，因此，已知與Mlm2033緊密連鎖的分子標記，可以簡便快捷的篩選含有Mlm2033的植株，分子標記MAG5827的應用，可以大大節省抗病材料的篩選時間和勞力，并加強預測的準確性。
權利要求
1.一粒小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標記，其特征在于所述的分子標記MAG5827 ； 所述的分子標記MAG5827 左端引物序列為SEQ ID NO. 1， 右端引物序列為SEQ ID NO. 2， 擴增產物為282bp，此分子標記來自一粒小麥TA20337AL染色體，為共顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2. 0測得與Mlm2033基因的遺傳距離為0. 4cM。
2.權利要求I所述的分子標記在小麥野生種質資源中抗白粉病基因的鑒定和轉移中的應用。
3.—粒小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標記方法,其特征在于用以下的ー對分子標記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產物 分子標記MAG5827 左端引物序列為SEQ ID NO. 1， 右端引物序列為SEQ ID NO. 2 ； 如果用引物MAG5827能夠擴增出282bp的擴增片段，則標志著待檢小麥存在抗白粉病基因 Mlm2033。
4.ー種篩選抗白粉病小麥的方法,其特征在于用權利要求I所述的引物對之ー擴增待檢小麥基因組DNA，如果用引物MAG5827能夠擴增出282bp的擴增片段，則標志該待檢小麥為存在抗白粉病Mlm2033的抗白粉病小麥。
全文摘要
本發明屬于分子遺傳學領域，涉及小麥抗白粉病基因Mlm2033的分子標記及其應用。所述的分子標記MAG5827與Mlm2033基因的遺傳距離為0.4cM。利用分子標記MAG5827選擇含有Mlm2033單株，通過橋梁親本法可以將一粒小麥中的抗白粉病基因Mlm2033轉移到普通小麥中。利用本發明與Mlm2033緊密連鎖的分子標記，可以簡便快捷的篩選含有Mlm2033的植株，分子標記MAG5827的應用，可以大大節省抗病材料的篩選時間和勞力，并加強預測的準確性。
文檔編號C12N15/11GK102653758SQ201210085158
公開日2012年9月5日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者付必勝, 馬正強 申請人:南京農業大學