測量對多西他賽抗藥性或敏感性的方法

專利名稱：測量對多西他賽抗藥性或敏感性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及某些新穎、有效且在此之前是未知的方法，這些方法通過測量特定遺傳標記物較對照物的增加或減少，可預測或監(jiān)測患者對于紫杉醇類(taxoid)化合物分子的反應。本發(fā)明還提供了某些試劑盒，這些試劑盒通過測量特定遺傳標記物的核酸或蛋白質(zhì)水平并與對照物或參照標記物比較，可預測或監(jiān)測患者對于紫杉醇類分子的反應。
背景技術(shù)：
多西他賽(Docetaxel)是一種抗有絲分裂藥物，廣泛地用于乳癌、肺癌和卵巢癌的治療，其次，還用于頭頸部、胃部和前列腺的癌癥治療(Hong, Oncology 16 :9,2002)。多西他賽通過與β_微管蛋白結(jié)合以及阻止α-和β-微管蛋白異二聚體的分解來抑制微管動力學過程，從而終止腫瘤的生長(Ringel和Horwitz, J Natl Cancer Inst 83 :288, 1991)。多西他賽和一種相關(guān)紫杉烷(taxane)即泰素(paclitaxel)的抗腫瘤活性，起因于靶向有絲分裂紡錘體的微管，阻止染色體的排列和分離，阻止細胞周期進程并激活凋亡途徑(Wang 等，Cancer 88:2619,2000)。通過涉及 p53/p21waf 1/Cipl、raf/ras 和有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的細胞信號事件，泰素的促凋亡活性與Bcl-2的磷酸化和失活被聯(lián)系起來(Wang等，Cancer 88:2619,2000)。雖然多西他賽是一種比泰素更有效的抗癌劑，但涉及其細胞毒性的途徑卻尚未很好地確定(Katsumata, Br J Cancer 89 S9, 2003)。在所選擇的細胞系中觀察到了多西他賽通過一種涉及Bcl-2磷酸化和胱天蛋白酶-3 (caspase-3)活化的機制所誘導的凋亡(Kolfschoten 等，Biochem Pharmacol 63: 733,2002)。在各種培養(yǎng)的細胞系內(nèi)調(diào)節(jié)紫杉烷誘導的細胞殺傷作用的其它蛋白包括HeLa 細胞內(nèi)的 Aurora-A (Anand 等，Cancer Cel 13 :51, 2003)、乳腺癌細胞內(nèi)的 HER-2 (Tanabe 等， Int J Oncol 22 :875，2003)、膠質(zhì)母細胞瘤細胞內(nèi)的 p21waf 1/Cipl (Li 等，J Biol Chem 277 :11352,2002)以及卵巢癌細胞內(nèi)的 JNK/MKK1 (Lee 等，J Biol Chem 273:28253,1998)。在本領(lǐng)域內(nèi)存在著一種需要，即需要鑒別某些可誘導多西他賽抗藥性的藥用蛋白，這種抗藥性使這些蛋白在藥物開發(fā)過程中可用于鑒別那些可消除其活體內(nèi)功能并能提高細胞對于抗腫瘤藥物化療敏感性的藥劑(小分子、siRNA等)。在本領(lǐng)域內(nèi)還需要一種測定方法，用于在化療前可靠地預測哪些患者在接受基于多西他賽抗腫瘤藥物的化療之后會有起色，而哪些患者則不會。申請人在本文中描述了一種新穎的測定方法，該測定方法能預測對于多西他賽的抗藥性和/或敏感性，并為能消除癌癥抗藥性的新療法的發(fā)展提供了某些篩選方法。發(fā)明概沭依照本發(fā)明提供了某些新穎和有效的方法，通過比較患者和對照物體內(nèi)特定遺傳標記物的活化和/或表達的水平，監(jiān)測和/或預測患者對紫杉醇類分子的反應。
在一實施方案中，本發(fā)明提供了一種預測或監(jiān)測癌癥患者對紫杉醇類分子的反應的方法，其包括以下步驟a)從所述患者的癌癥區(qū)域獲得測試樣品；b)獲得對照樣品；c)測量一種或一種以上遺傳標記物的水平；以及d)在測試樣品和對照樣品之間比較所測量的所述一種或一種以上遺傳標記物的水平；其中，與對照樣品相比，在測試樣品內(nèi)所測量的所述一種或一種以上遺傳標記物水平的下降表明對紫杉醇類分子抗藥性的增強。在本發(fā)明該方面所提供的特定遺傳標記物包括BubRl :人(Homo spiens)的類似于蛋白激酶(BUBRl)mRNA,完全 cds (互補 DNA) (GenBank 登錄號AF046079)；Mad2 :人 MAD2 蛋白的 mRNA(GenBank 登錄號AJ000186)；Mpsl :人 TTK 蛋白激酶(TTK)，mRNA(GenBank 登錄號NM_003318)；Racl/CDC42 的 GEFT 人 RAC/CDC42 交換因子(GEFT)，轉(zhuǎn)錄變體 2，mRNA (GenBank 登錄號NM_133483)；Bubl :人BUBl (不受苯并咪唑I同系物抑制的芽殖)(酵母)(BUBl)，mRNA (GenBank 登錄號NM_004336)；hSepharase :人額外紡錘體極樣 I (釀酒酵母(S. cerevisiae)) (ESPLl)， mRNA (GenBank 登錄號NM_012291)；CamKIId :人鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)ΙΙ δ (CAMK2D)，轉(zhuǎn)錄變體3， mRNA (GenBank 登錄號NM_001221)；⑶K6 :人細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶6 (⑶K6)，mRNA (GenBank登錄號 NM_001259);和GRB2 :人生長因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2)，轉(zhuǎn)錄變體1，mRNA(GenBank登錄號 NM_002086)。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及一種預測或監(jiān)測癌癥患者對紫杉醇類分子的反應的方法，其包括以下步驟a)從所述患者的癌癥區(qū)域獲得測試樣品；b)獲得對照樣品；c)測量一種或一種以上遺傳標記物的水平；以及d)在測試樣品和對照樣品之間比較所測量的所述一種或一種以上遺傳標記物的水平；其中，與對照樣品相比，在測試樣品內(nèi)所測量的所述一種或一種以上遺傳標記物水平的下降表明對紫杉醇類分子敏感性的增強。在本發(fā)明的這一具體方面，一種或一種以上遺傳標記物可選自P21 (Wafl):人細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑1Α(ρ21，Cipl) (CDKNlA)，轉(zhuǎn)錄變體 I, mRNA(GenBank 登錄號NM_000389)；Pim-I :人 pim-1 癌基因(PMl)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002648)；
GBP-I :人鳥苷酸結(jié)合蛋白1，干擾素可誘導，67kDa(GBPl)，mRNA(GenBank登錄號 NM_002053)；RXRA :人類類視黃醇 X 受體，a (RXRA)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002957)；SPF45 :人 RNA 結(jié)合基序蛋白 17 (RBM17)，mRNA (GenBank 登錄號NM_032905)；Hecl :人動粒相關(guān) 2 (KNTC2)，mRNA (GenBank 登錄號NM_06101)；Rafl :人 raf 癌基因的 mRNA (GenBank 登錄號X03484)；Aurora A 人 aurora-相關(guān)激酶 I (ARKl) mRNA,完全 cds (GenBank 登錄號 AF008551)；TACC3 :人轉(zhuǎn)化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3 (TACC3)，mRNA (GenBank登錄號 NM_006342)；RelB:人v-rel網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒癌基因同系物B，B-細胞3 (鳥類)的κ輕多肽基因增強子的核因子(RELB)，mRNA(GenBank登錄號NM_006509)；PRKCD :人蛋白激酶 C，δ (PRKCD)，轉(zhuǎn)錄變體 1，mRNA (GenBank 登錄號 NM_006254)；BRAF35 :人高泳動族 20B (HMG20B)，mRNA (GenBank 登錄號NM_006339)；HSPAlL :人熱休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)，mRNA (GenBank 登錄號NM_005345)；STKll :人絲氨酸/蘇氨酸激酶11 (波-杰綜合征)(STKll)，mRNA (GenBank登錄號NM_000455);和MKK3 :人 MAP 激酶激酶 3 (MKK3)mRNA,完全 cds (GenBank 登錄號L36719)。在一更進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及一種預測或監(jiān)測癌癥患者對紫杉醇類分子的反應的方法，其包括以下步驟a)從所述患者的癌癥區(qū)域獲得測試樣品；b)測量選自以下一種或一種以上遺傳標記物的水平BubRl :人的類似于蛋白激酶(BUBRl)mRNA，完全cds (互補DNA) (GenBank登錄號 AF046079)；Mad2 :人 MAD2 蛋白的 mRNA(GenBank 登錄號AJ000186)；Mpsl :人 TTK 蛋白激酶(TTK)，mRNA(GenBank 登錄號NM_003318)；Racl/CDC42 的 GEFT 人 RAC/CDC42 交換因子(GEFT)，轉(zhuǎn)錄變體 2，mRNA (GenBank 登錄號NM_133483)；Bubl :人BUBl (不受苯并咪唑I同系物抑制的芽殖)(酵母)(BUBl),mRNA (GenBank 登錄號NM_004336)；hSepharase :人額外紡銀體極樣 I (釀酒酵母(S. cerevisiae)) (ESPLl)， mRNA (GenBank 登錄號NM_012291)；CamKHd 人鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)II δ (CAMK2D)，轉(zhuǎn)錄變體3， mRNA (GenBank 登錄號NM_001221)；⑶K6 :人細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶6 (⑶K6)，mRNA (GenBank登錄號 NM_001259);和GRB2 :人生長因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2)，轉(zhuǎn)錄變體1，mRNA (GenBank登錄號匪 002086)。
c)測量選自以下一種或一種以上參照遺傳標記物的水平GAPDH :人 3_ 磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002046);和RPS9 :人 cDNA 克隆 IMAGE :6647283,部分 cds (GenBank 登錄號BC071941)；d)比較測試樣品中所測量的所述一種或一種以上遺傳標記物的水平和所述一種或一種以上參照遺傳標記物的水平；其中，與所述一種或一種以上參照遺傳標記物的水平相比，在所述一種或一種以上遺傳標記物水平的下降表明對紫杉醇類分子抗藥性的增強。本發(fā)明的另一個進一步的實施方案涉及一種預測或監(jiān)測癌癥患者對紫杉醇類分子的反應的方法，其包括以下步驟a)從所述患者的癌癥區(qū)域獲得測試樣品；b)測量選自以下一種或一種以上遺傳標記物的水平P21 (Wafl):人細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑lA(p21，Cipl)(⑶KN1A)，轉(zhuǎn)錄變體 I，mRNA (GenBank 登錄號NM_000389)；Pim-I :人 pim-1 癌基因(PMl)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002648)；GBP-I :人鳥苷酸結(jié)合蛋白1，干擾素可誘導，67kDa(GBPl)，mRNA(GenBank登錄號 NM_002053)；RXRA :人類類視黃醇 X 受體，a (RXRA)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002957)；SPF45 :人 RNA 結(jié)合基序蛋白 17 (RBM17)，mRNA (GenBank 登錄號NM_032905)；Hecl :人動粒相關(guān) 2 (KNTC2)，mRNA (GenBank 登錄號NM_006101)；Rafl :人 raf 癌基因的 mRNA (GenBank 登錄號X03484)；Aurora A 人 aurora-相關(guān)激酶 I (ARKl) mRNA,完全 cds (GenBank 登錄號 AF008551)；TACC3 :人轉(zhuǎn)化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3 (TACC3)，mRNA (GenBank登錄號 NM_006342)；RelB:人v-rel網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒癌基因同系物B，B-細胞3 (鳥類)的k輕多肽基因增強子的核因子(RELB)，mRNA(GenBank登錄號NM_006509)；PRKCD :人蛋白激酶 C，8 (PRKCD)，轉(zhuǎn)錄變體 1，mRNA (GenBank 登錄號 NM_006254)；BRAF35 :人高泳動族 20B (HMG20B)，mRNA (GenBank 登錄號NM_006339)；HSPAlL :人熱休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)，mRNA (GenBank 登錄號NM_005345)；STKll :人絲氨酸/蘇氨酸激酶11 (波-杰綜合征)(STKll)，mRNA (GenBank登錄號NM_000455);和MKK3 :人 MAP 激酶激酶 3 (MKK3)mRNA,完全 cds (GenBank 登錄號L36719)。c)測量選自以下一種或一種以上參照遺傳標記物的水平GAPDH :人 3_ 磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002046);和RPS9 :人 cDNA 克隆 IMAGE :6647283,部分 cds (GenBank 登錄號BC071941)；d)比較測試樣品中所測量的所述一種或一種以上遺傳標記物的水平和所述一種或一種以上參照遺傳標記物的水平；其中，與所述一種或一種以上參照遺傳標記物的水平相比，所述一種或一種以上遺傳標記物水平的下降表明對紫杉醇類分子易感性的增強。本發(fā)明涉及預測或監(jiān)測癌癥患者對紫杉醇類分子的反應的各種方法。因此，本發(fā)明的一個進一步的實施方案包括紫杉醇類分子泰素、多西他賽XRP9881和XRP6258。通過采用下文中詳述的各種技術(shù)來測量RNA、DNA或蛋白質(zhì)的水平，可評估本發(fā)明所述的各種遺傳標記物。本發(fā)明的另一些實施方案則涉及用于預測或監(jiān)測患者對紫杉醇類分子的反應的各種試劑盒。通過以下結(jié)合附圖所作的詳細說明，對本發(fā)明的上述方面和其它方面、特點和優(yōu)點將能更好地理解。附圖簡沭圖I顯示了某些基因的特性，它們的下調(diào)可產(chǎn)生對多西他賽的抗藥性。所顯示的多西他賽劑量效應曲線為用RBUBubRl、Mad2和MpslsiRNA (實心正方形)與對照siRNA (空心正方形)轉(zhuǎn)染的HCT116細胞相比的情況。RBl是在篩選中沒有得分的siRNA的一個實例。在加入WST-I之后于450nM吸收度條件下測量細胞存活率。最小比率(MR)是多西他賽劑量為40nM時基因的WST-I值與對照物WST-I值的比率。圖2顯示了將BubRl和Mpsl shRNA(實心正方形)與對照shRNA (空心正方形) 比較的劑量效應曲線。圖3顯示了在分別含有BubRl shRNA和Mpsl shRNA的細胞內(nèi)，對BubRl shRNA和 Mpsl mRNA水平進行的TaqMan實時PCR分析。圖4分別顯示了在使用或不使用多西他賽處理的情況下，用Mad2、BubRl和Mpsl siRNA轉(zhuǎn)染的HCT116細胞的細胞存活率和形態(tài)學。在轉(zhuǎn)染后24小時，對細胞不加處理(_多西他塞)或以200nM多西他賽處理(+多西他賽)，并在處理后16和72小時以鈣熒光素-AM 染色以顯現(xiàn)活細胞。圖5顯示了用Mad2、BubRl、Mpsl和對照siRNA轉(zhuǎn)染的HCT116細胞繼多西他賽處理之后的有絲分裂指數(shù)。轉(zhuǎn)染后24小時細胞以200nM多西他賽處理16小時和72小時并加以進一步處理。以磷酸化的組蛋白H3抗體檢測有絲分裂細胞，此處顯示為染色細胞核的紅色斑點(有絲分裂指數(shù)試劑盒，Cellomics)。用Hoechst染料將細胞核染成藍色。圖6顯示了在分別用Mpsl、BubRl和Mad2siRNA轉(zhuǎn)染的HCTl 16細胞內(nèi)，對Mpsl、 BubRl和Mad2mRNA水平進行的TaqMan實時PCR分析。圖7顯示了用三種有絲分裂檢查點基因siRNA轉(zhuǎn)染的HCT116細胞的細胞周期分析。在用1 81、81*1 1和1&1(12&1 應轉(zhuǎn)染之后，未用多西他賽(_多西他賽)處理細胞或以 200nM多西他賽(+多西他賽)處理24小時。在加入多西他賽后72小時，收獲細胞并分析細胞周期。峰頂?shù)臄?shù)字表示DNA含量，例如2N、4N、8N、16N或32N。圖8顯示了使用穩(wěn)定敲低細胞系進行的產(chǎn)克隆細胞存活分析。將含有BubRl或載體對照shRNA的HCT116細胞接種在IOcm培養(yǎng)皿中并在5nM多西他賽中保持10天。用PBS 洗滌克隆并以結(jié)晶紫染色。圖9顯示了幾種基因的劑量效應曲線，這些基因的下調(diào)能增加對多西他賽的敏感性。所顯示的多西他賽劑量效應曲線為用RBl、Pim-1、p21、Aurora A和TACC3siRNA(實心正方形)與對照siRNA(空心正方形)轉(zhuǎn)染的HCT116細胞相比的情況。最小比率(MR)是多西他賽濃度為40nM時基因的WST-I讀數(shù)與對照物WST-I讀數(shù)的比率。IC50 (IR)比率是基因的IC50與對照物IC50的比率。

圖10顯示了 Aurora A shRNA(實心正方形)與載體對照物(空心正方形)比較的劑量效應曲線。圖11顯不了在含有Aurora A shRNA的細胞內(nèi)，對Aurora A mRNA水平的TaqMan 實時PCR分析。圖12顯示了用Pim-I和TACC3siRNA(實心正方形)與對照siRNA (空心正方形) 轉(zhuǎn)染的HCT116細胞比較在增殖方面的區(qū)別。也就是在用Pim-1、TACC3和對照siRNA轉(zhuǎn)染后的不同時刻，在6孔培養(yǎng)板內(nèi)剩下的細胞數(shù)量。圖13顯示了在siRNA轉(zhuǎn)染后對Pim-I和TACC3mRNA水平進行的TaqMan分析。圖14顯示了在用Pim-I和BubRlsiRNA轉(zhuǎn)染的HCT116細胞內(nèi)活性胱天蛋白酶_3 的水平。使用活性胱天蛋白酶_3beadmates試劑盒(Upstate),活性胱天蛋白酶_3的水平顯示為熒光強度。檢查了 3種多西他賽的濃度(即0、5和40nM)以及3個時刻(即加入多西他賽后24、48和72小時)的情況。圖15顯示了用Pim-I和BubRlsiRNA轉(zhuǎn)染的HCT116細胞內(nèi)AKT的磷酸化水平。磷酸化AKT和總AKT水平的比率是用基于珠的測定法(bead-based assay) (Biosource)確定的。轉(zhuǎn)染后24小時，對細胞不加處理或以5nM和40nM多西他賽處理。在多西他賽處理后 48小時，分析細胞裂解物。計算磷酸化水平，并以磷酸化AKT(ρ-ΑΚΤ)與總AKT(t-AKT)的比
率表示。圖16以Western印跡法結(jié)果顯不轉(zhuǎn)染后48小時Pim-I和BubRl的水平下降。發(fā)明詳述本發(fā)明以申請者對基因標記物的鑒定為充分依據(jù)，該基因標記物可預測受試者對紫杉醇(taxoid)類藥物是否具有抗性或敏感性。采用以細胞為基礎(chǔ)的RNA干擾(RNAi)篩選，申請者觀察到對多西他賽的抗藥性或敏感性與特定基因標記物相關(guān)。本專利說明及專利權(quán)要求中使用了許多術(shù)語及短語。這些術(shù)語及短語的定義如下在本文中，“預后”這個術(shù)語，是指關(guān)于因癌癥而引起的死亡或疾病進程的預測或可能性，其中包括抗藥性以及復發(fā)、轉(zhuǎn)移擴散和贅生性疾病。在本文中，“預測”這個術(shù)語，是指患者對一種藥物或一組藥物反應良好或不良的可能性以及這些反應的程度，例如，患者于手術(shù)摘除原發(fā)性腫瘤后及/或化療一段時間后是否能存活而無癌癥復發(fā)。本發(fā)明所預見的預測方法可在臨床上使用，通過為任何特定患者選擇最合適的治療方法，尤其是紫杉醇類藥物的化療方法，而做出治療決定。本發(fā)明的各種預測方法對預測患者對某種治療法(包括采用一種給定藥物或藥物組合的化療及/或放射治療)是否反應良好，或在停止化療或其它形式的治療后能否長期存活頗有價值。在本文中，“腫瘤”這個術(shù)語是指所有良性及惡性的贅生細胞生長和增殖，并指所有的癌前和癌性細胞與組織。在本文中，“癌”和“癌性”是指哺乳動物的某種生理病狀，其典型特征為無節(jié)制的細胞生長。癌癥的例子包括但不限于以下各種癌癥乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、肝細胞癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、癌、黑素瘤、腦癌(包括成膠質(zhì)細胞瘤和成神經(jīng)管細胞瘤)、膽道癌、絨膜癌、食道癌、胃癌、血液腫瘤(包括急性淋巴細胞性和髓性白血病)、多發(fā)性骨髓瘤、愛滋病相關(guān)白血病和成人T-細胞白血病淋巴瘤、上皮內(nèi)腫瘤(包括鮑恩病和佩吉特病)、淋巴瘤(包括何杰金氏病和淋巴細胞性淋巴瘤)、成神經(jīng)細胞瘤、口腔癌(包括鱗狀細胞癌)、肉瘤(包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和骨肉瘤)、皮膚癌(包括黑素瘤、卡波西肉瘤、基底細胞性癌和鱗狀細胞癌)、睪丸癌 (包括胚組織瘤如精原細胞瘤、非精原細胞瘤(畸胎瘤、絨膜癌)、間質(zhì)瘤以及生殖細胞腫瘤)、甲狀腺癌(包括甲狀腺腺癌和髓樣癌)、腎癌(包括腺癌和維爾姆斯瘤)。在本文中，“患者”這個術(shù)語主要是指人，但也可包括非人類靈長類動物、牛、馬、 豬、綿羊、山羊、狗、貓和嚙齒類動物。優(yōu)選地，受試者是人，其疑似患有癌癥，或已確診患有癌癥，或?qū)儆诨及└呶Ｈ巳?，例如有家族癌癥史。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，癌為乳腺癌。 鑒定疑似患有癌癥的受試者的方法包括手檢、活組織檢查、受試者家族病史、受試者病史或若干成像技術(shù)，包括乳房X線照相、磁共振成像、磁共振波譜或正電子發(fā)射斷層掃描。癌癥的診斷方法和癌癥診斷的臨床特性為醫(yī)療領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在本文中，“樣品”這個術(shù)語是指采用相關(guān)醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知的方法所取得的組織?；罱M織檢查等各種方法包括分割組織塊、顯微解剖、以激光為基礎(chǔ)的顯微解剖或本領(lǐng)域內(nèi)熟知的其它細胞分離方法。由于病變組織活檢材料中細胞類型的可變性和所用診斷方法靈敏度的可變性，分析所需樣品的細胞數(shù)量可從I、10、50、100、200、300、500、 1000、5000、10，000至50,000或更多不等。合適的樣品大小取決于細胞組成和活檢狀況， 確定細胞組成和活檢狀況時的標準制備步驟及其后在本發(fā)明中所采用的核酸分離方法為本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員所熟知。例如，取自活檢的樣品可能足以評價RNA表達而無需擴增。 反之，若小型活檢區(qū)域中細胞數(shù)量未達合適的數(shù)量，則需要采用RNA轉(zhuǎn)換方法和/或擴增方法，或采用其它提高核酸分子分辨率的方法。所述的允許采用有限活檢材料的方法為本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員所熟知。一些例子包括但不限于直接RNA擴增、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA、cDNA 擴增或生成放射性標記核酸分子。在本文中，關(guān)于樣品的術(shù)語“測試”是指取自身體癌變區(qū)域的樣品，或取自顯示某階段癌變或癌變特征的身體區(qū)域的樣品。在本文中，關(guān)于樣品的術(shù)語“對照”是指用于比較目的的樣品。優(yōu)選地，這些樣品為“對照”意思是指該樣品未顯示或據(jù)信未患有任何影響基因表達的疾病或病癥，在以這些樣品作為標準的疾病方面尤其如此。也可以這樣認為疾病和病癥的不同階段可以加以比較，在此情況下，“對照”樣品相當于該疾病或病癥的較早階段。例如，對照樣品可以是取自身體上非癌變但可比較部位的樣品。此外，對照樣品可取自同一個受試者的可比較部位，或與該第一個受試者實質(zhì)上相似的第二個受試者(物種、年齡、體重、性別等相同或相似)的非癌變部位。最后，對照樣品亦可取自對紫杉醇類分子治療產(chǎn)生良好反應的第二個受試者的癌變部位?！昂怂岱肿印笔侵负塑?腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；“RNA 分子”)或脫氧核苷(腺嘌呤脫氧核苷、鳥嘌呤脫氧核苷、胸腺嘧啶脫氧核苷或胞嘧啶脫氧核苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合體形式或其磷酸酯類似物(例如硫代磷酸酯和硫酯)，可為單鏈形式或雙鏈螺旋形式。也可能是雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。核酸分子(特別是DNA或RNA分子)這個術(shù)語僅指該分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，并不限于任何特定的三級結(jié)構(gòu)。因此該術(shù)語包括雙鏈DNA分子，其形式可為直鏈或環(huán)形DNA分子(如限制片段)、質(zhì)粒和染色體。在討論特定雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時，可根據(jù)僅給出順著5'端至3'端的方向沿著非轉(zhuǎn)錄DNA鏈(即含有與mRNA同源序列的鏈)的序列的慣例來描述序列?！爸亟MDNA分子”是指已經(jīng)過分子生物學操作的DNA分子。在本文中，為特定蛋白質(zhì)編碼的、分離的核酸分子的“部分”這個術(shù)語，是指包含編碼肽或多肽的足夠數(shù)量相鄰核苷酸的分尚核酸分子的部分或片段。自然，分尚核酸分子的一個“部分”不止一個核苷酸，而由這個部分編碼的肽或多肽含有許多氨基酸殘基，如下文肽和多肽的定義所述。在本文中，“肽”這個術(shù)語，是指由肽鍵共價連接的兩個或兩個以上氨基酸。在一特定實施方案中，一個肽包含至少10個氨基酸，優(yōu)選至少20個、更優(yōu)選至少30個、甚至更優(yōu)選至少40個、最優(yōu)選50個或更多氨基酸。在本文中，“多肽”這個術(shù)語，是指由多個相鄰氨基酸組成的直鏈聚合物，特別是多肽的分子量可聞于100kD。在本文中，“遺傳標記物”這個術(shù)語，是指一生理組成成分，可用其在樣品中測定的 RNA、DNA或蛋白質(zhì)質(zhì)水平來預測所測試受試者對紫杉醇類藥物是否有抗性或敏感性。此外， 遺傳標記物可編碼特定蛋白質(zhì)，也可用作其活性與身體樣品中遺傳標記物的水平相關(guān)的蛋白質(zhì)的“替代”標記物。該相關(guān)性可以是正比關(guān)系，即蛋白質(zhì)活性水平的下降對應于遺傳標記物水平的下降。或者，該相關(guān)性也可以是反比關(guān)系，即蛋白質(zhì)活性水平的下降對應于遺傳標記物水平的上升。這種生理組成成分包括(但當然不限于)細胞(例如其前體干細胞 (progenitor stem cell))蛋白質(zhì)、多肽、DNA、RNA、碳水化合物或脂肪酸,在此僅舉數(shù)例。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，根據(jù)已測定的基因標記物水平，可預測受試者對紫杉醇類藥物是否有抗性或敏感性。此類遺傳標記物的例子包括但不限于下列各項BubRl :人的類似于蛋白激酶(BUBRl)mRNA，完全cds (互補DNA) (GenBank登錄號 AF046079)；Mad2 :人 MAD2 蛋白的 mRNA(GenBank 登錄號AJ000186)；Mpsl :人 TTK 蛋白激酶(TTK)，mRNA(GenBank 登錄號NM_003318)；Racl/CDC42 的 GEFT 人 RAC/CDC42 交換因子(GEFT)，轉(zhuǎn)錄變體 2，mRNA (GenBank 登錄號NM_133483)；Bubl :人BUBl (不受苯并咪唑I同系物抑制的芽殖)(酵母)(BUBl)，mRNA (GenBank 登錄號NM_004336)；hSepharase :人額外紡錘體極樣 I (釀酒酵母(S. cerevisiae)) (ESPLl)， mRNA (GenBank 登錄號NM_012291)；CamKIId :人鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)ΙΙ δ (CAMK2D)，轉(zhuǎn)錄變體3， mRNA (GenBank 登錄號NM_001221)；⑶K6 :人細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶6 (⑶K6)，mRNA (GenBank登錄號 NM_001259);和GRB2 :人生長因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2)，轉(zhuǎn)錄變體1，mRNA(GenBank登錄號 NM_002086)。P21 (Wafl):人細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑1Α(ρ21，Cipl) (CDKNlA)，轉(zhuǎn)錄變體 I，mRNA (GenBank 登錄號NM_000389)；
Pim-I :人 pim-1 癌基因(PMl)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002648)；GBP-I :人鳥苷酸結(jié)合蛋白I，干擾素可誘導，67kDa(GBPl)，mRNA(GenBank登錄號 NM_002053)；RXRA :人類類視黃醇 X 受體，a (RXRA)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002957)；SPF45 :人 RNA 結(jié)合基序蛋白 17 (RBM17)，mRNA (GenBank 登錄號NM_032905)；Hecl :人動粒相關(guān) 2 (KNTC2)，mRNA (GenBank 登錄號NM_006101)；Rafl :人 raf 癌基因的 mRNA (GenBank 登錄號X03484)；Aurora A 人 aurora-相關(guān)激酶 I (ARKl) mRNA,完全 cds (GenBank 登錄號 AF008551)；TACC3 :人轉(zhuǎn)化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3 (TACC3)，mRNA (GenBank登錄號 NM_006342)；RelB:人v-rel網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒癌基因同系物B，B-細胞3 (鳥類)的k輕多肽基因增強子的核因子(RELB)，mRNA(GenBank登錄號NM_006509)；PRKCD :人蛋白激酶 C，8 (PRKCD)，轉(zhuǎn)錄變體 1，mRNA (GenBank 登錄號 NM_006254)；BRAF35 :人高泳動族 20B (HMG20B)，mRNA (GenBank 登錄號NM_006339)；HSPAlL :人熱休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)，mRNA (GenBank 登錄號NM_005345)；STKll :人絲氨酸/蘇氨酸激酶11 (波-杰綜合征)(STKll)，mRNA (GenBank登錄號NM_000455);和MKK3 :人 MAP 激酶激酶 3 (MKK3)mRNA,完全 cds (GenBank 登錄號L36719)。在本文中，“參照遺傳標記物”這個術(shù)語，是指所測定的RNA、DNA或蛋白質(zhì)質(zhì)水平在服用紫杉醇類藥物之前、期間或之后保持不變的生理組成成分。“參照遺傳標記物”被稱為持家基因。這些基因的選擇基于在諸如癌癥之類特定疾病的被檢驗系統(tǒng)中表達水平相對不變。持家基因用于使表達的結(jié)果歸一化。此類遺傳標記物的例子包括但當然不限于以下兩項GAPDH :人 3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002046);和RPS9 :人 cDNA 克隆 IMAGE :6647283,部分 cds (GenBank 登錄號BC071941)；在本文中，“紫杉醇類分子”這個術(shù)語，是指屬于紫杉烷族的一類化療化合物。紫杉醇類的具體成員包括但不限于泰素(紫杉醇)、多西他賽(泰索帝)及其類似物(即 XRP9881 和 XRP6258 ;參見 Ojima 和 Gemey，Curr Opin Investig Drugs 4 :737,2004)。由于此類分子為￠-微管蛋白結(jié)合物，可穩(wěn)定類似于多西他賽的聚合形式的微管，因此可以預期，此處所描述的生物標記物的臨床表達將反映對這些藥物的類似反應狀況。在本文中，“分子”、“化合物”或“藥劑”等術(shù)語，是指現(xiàn)在已知或以后發(fā)現(xiàn)的任何組合物。本專利中應用的化合物或藥劑的例子包括有機化合物(例如人造的、天然的和光活性化合物)、肽(例如人造的、天然的和光活性化合物，即D型或L型氨基酸)、碳水化合物、 核酸分子等。在本文中，“雜交嚴格度”或“嚴格條件下的雜交”，是指本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員能夠輕易判定的條件，通常是一種取決于探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的經(jīng)驗性計算。通常， 較長的探針需要較高的溫度，以便進行適當?shù)耐嘶?，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常取決于當互補鏈處于低于其解鏈溫度的環(huán)境時變性DNA的重退火能力。探針與可雜交序列之間同源性程度越高，所能采用的相對溫度越高。于是，較高的相對溫度往往使反應條件更嚴格，而在較低的溫度下，則嚴格度較低。關(guān)于雜交反應嚴格度的進一步細節(jié)和解釋，可參閱 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)。在本文中，“嚴格條件”或“高度嚴格條件”是指下列參數(shù)(1)洗滌時采用低離子強度和高溫，例如50°C下的0. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. I %十二烷基硫酸鈉；(2) 雜交時采用甲酰胺等變性劑，例如42°C下50% (v/v)甲酰胺加0. 1%牛血清白蛋白/0. 1% Ficol 1/0. I %聚乙烯吡咯烷酮/pH 6. 5的50mM磷酸鈉緩沖液以及750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉；或(3)在42 °C下過夜雜交，雜交溶液含50%甲酰胺，5x SSC(0. 75M氯化鈉，0. 075M 朽1檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6. 8)、0. I %焦磷酸鈉、5xDenhardt’ s溶液、超聲波處理的鮭魚精子DNA(50.mu.g/ml)、0. 1% SDS和10%硫酸葡聚糖，然后在0. 2x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中于42°C洗滌10分鐘，再以含有EDTA的0. Ix SSC于55°C進行高嚴格度洗滌。適度嚴格條件可按 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,New York Cold Spring Harbor Press, 1989中的描述加以鑒定,該適度嚴格條件包括采用嚴格度低于以上描述的洗滌溶液和雜交條件(如溫度、離子強度和SDS百分比)。適度嚴格條件的一個例子為37 °C下在一溶液中進行過夜雜交，該溶液含20%甲酰胺、5x 350(150禮氯化鈉、151111檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7. 6)、5x DenhardtJ s溶液、10%硫酸葡聚糖、和20mg/ml變性的片段化鮭魚精子DNA，然后于37-50°C在Ix SSC中洗滌濾膜。專業(yè)人員將會根據(jù)探針長度等因素調(diào)節(jié)溫度、離子強度等。雜交核酸時的適當嚴格度取決于核酸分子長度和互補程度，以及其它本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的變量。兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性越大，則含有這些序列的核酸雜合體的Tm越大。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應于較高的Tm)以下列順序遞減RNA:RNA、DNA:RNA, DNA:DNA。優(yōu)選地，可雜交核酸的最低長度至少約為12個核苷酸，優(yōu)選至少約為16個、更優(yōu)選至少約為24個、最優(yōu)選至少約為36個核苷酸。在本文中，“標記”或“可檢測標記”是指一種帶有可檢測標記的化合物或組合物， 它直接或間接與一種抗體、寡肽或其它有機分子綴合，而生成“標記的”抗體、寡肽或其它有機分子。該標記本身可被檢測到(如放射性同位素標記或突光標記)，或者，如果該標記為酶標記，則可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學改變。在本文中，“直接標記”是指在其自然狀態(tài)下輕易可見的物體，可為肉眼所見，或借助于濾光器和/或使用刺激(如以紫外光激發(fā)熒光)的情況下可見。其例子包括但不限于加色標記、金屬溶膠顆粒、染料溶膠顆粒、染色乳膠或染料包封脂質(zhì)體(見第4，313，734號美國專利、第 4，373，932 號美國專利、WO 88/08534、EP-A 0280559,0281327,H 4，703，017 號美國專利所描述)。其它的直接標記包括放射性核苷酸、不透射線物、熒光部分或發(fā)光部分。在本文中，“間接標記”是指可依照本發(fā)明加以使用的酶。與免疫測定相關(guān)的各種類型的酶為本領(lǐng)域內(nèi)所熟知，例如，堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶、溶菌酶、6-磷酸葡萄糖脫氫!酶、乳酸脫氫!酶和尿素酶，Eva Engvall 在 Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT 一文 (Methods in Enzymology, 70 :419-439(1980))和第 4，857，453 號美國專利中詳細地討論了這些酶以及其它一些酶。
在本文中，“試劑盒”這個術(shù)語是指包含一個或多個容器以及在容器上或者與容器相關(guān)的標簽(label)或說明書(package insert)的一種產(chǎn)品。在一優(yōu)選實施方案中，此類容器可包含帶有可檢測標記的抗體、帶有可檢測標記的抗體片段、或帶有可檢測標記的寡核苷酸。在另一實施方案中，此類容器提供各種手段，以便從身體樣品獲得總RNAdfS RNA 反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA，以及使用一套引物對cDNA進行聚合酶鏈式反應，這套引物中的一個或兩個均具有可檢測標記。試劑盒可包括其它容器，這些容器包含諸如稀釋液和緩沖劑、對照抗體、寡肽、或小的有機分子。該標簽或說明書可提供組成成分的描述，以及關(guān)于貯藏和旨在體外使用或診斷使用的說明。再則，按照本發(fā)明，可運用本領(lǐng)域的常規(guī)分子生物學、微生物學和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中得到充分解釋。參見Sambrook, Fritsch和Maniatis, Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(本文簡稱“Sambrook 等，1989”)；DNA Cloning A Practical Approach, Volumes I 和 II (D. N. Glover 編，1985) ；01igonucleotide Synthesis(M. J. Gait 編，1984) ；Nucleic Acid Hybridization[B. D. Hames和 S. J. Higgins 編(1985)] !Transcription And Translation[B. D. Hames 和 S. J. Higgins 編(1984)]； Animal Cell Culture[R. I. Freshney 編(1986)] ；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press, (1986)] ；B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)； F. M. Ausubel 等編，Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, Inc. (1994)。通常，RNAi技術(shù)使用合成的或載體生成的雙鏈RNA以誘導含有同源序列的mRNA 的降解(McManus和Sharp, Nat Rev genet 3:737,2002)。RNAi篩選已被用來闡明許多生物體中的基因功能，例如線蟲(Caenorhabditis elegans) (Simmer 等，PloS Biol I E12, 2003)，果蠅(Lum 等，Science 299 :2039,2003)和哺乳動物細胞(Aza-Blanc 等，Mol Cell 12 :627,2003)。在本發(fā)明中，使用HCT116結(jié)腸癌細胞針對101種與癌相關(guān)的基因(大多數(shù)為激酶族成員)篩選siRNA，并以高分辨率的劑量-效應曲線量化多西他賽的殺傷作用。采用此方法，申請者已經(jīng)證明9個基因(包括BubRl、Bubl，Mad2、Mpsl和GEFT Rac/CDC)的低水平表達可抑制多西他賽的殺傷作用，而降低15個其它基因(包括Piml、p21、TACC3和Aurora-A) 的表達可加強多西他賽所誘導的細胞死亡。因此，本發(fā)明廣泛擴展至某些診斷方法和試劑盒，可將這些診斷方法和試劑盒用于鑒定正在服用多西他賽或考慮服用該藥物的個體對該藥物是否會有抗性或敏感性。申請者已經(jīng)觀察到對多西他賽的抗藥性，抗藥性與喪失一組廣泛的檢查點控制基因相關(guān)，這些基因包括 BubRl、Bubl、Mad2、MspI 和 GEFTRac/CD。對多西他賽的敏感性增加與若干基因之一的喪失有關(guān)，這些基因包括GBP-1、 STKlURXRA、HecI、SPF45、RafI、RELB、MKK3、PRKCD、HSPAIA、BRAF35、Aurora-A,Pim-UTACC3 和p21wafl/Cipl，抑制這些基因的抑制劑可在多西他賽療法中用作有價值的輔助藥。有絲分裂的檢查點基因可通過抑制Cdc20_APC(后期促進復合物)作為延遲細胞分裂后期的可靠機制，直至姊妹染色單體的動粒正確附著于有絲分裂紡錘體上，并在赤道板上排列(Zhou等，J Cell Sci 115 :3547,2002)，從而使細胞可靠地退出有絲分裂，并以精確的DNA互補進入另外的細胞周期。如有微管抑制劑存在，退出有絲分裂的細胞不再能正確分離其染色體，通常立即凋亡或在若干細胞周期后凋亡(Taylor和McKeon，Cell89 :727， 1997)。微管抑制劑與有絲分裂檢查點基因(如BubRl)喪失這兩種因素的結(jié)合可使細胞避免有絲分裂阻滯，而不經(jīng)歷細胞凋亡，從而導致染色體不穩(wěn)定性(CIN)和非整倍性(Shin 等，Cancer Cell 4 :483，2003)。近來，在將微管抑制劑泰素用于處理其BubRl和Mad2下調(diào)的MCF-7細胞時，產(chǎn)生了抗藥性資料(Sudo等，Cancer Res 64 =2502,2004)。Pim-I基因編碼一種屬于相關(guān)激酶小家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶。Pim-I的功能一直與增殖、分化、細胞凋亡，腫瘤發(fā)生、組織缺氧、血管生成和有絲分裂聯(lián)系在一起(Wang 等，Biochim Biophys Acta 1593:45,2002)。顯微成像資料以及AKT低磷酸化資料和升高的胱天蛋白酶-3活性測量值顯示，通過使介導細胞生存的AKT信號失活，Pim-I的下調(diào)增強了多西他賽誘導的細胞凋亡。Pim-I和p21在使HCT116細胞對多西他賽敏化中具備極為相似的特點；與證明p21為Pim-I的磷酸化底物這一報道一致(Wang等，Biochim Biophys Acta 1593:45,2002)。在不存在多西他賽的情況下，Pim-I的下調(diào)誘導了一定程度的細胞凋亡，但當該藥物存在時效力則更高；然而在多西他賽不存在時下調(diào)轉(zhuǎn)化酸性卷曲螺旋蛋白質(zhì)TACC3并不誘導細胞死亡，表明僅RNAi技術(shù)本身對細胞增殖沒有影響。所述結(jié)果表明不同蛋白質(zhì)的損毀可引起細胞對多西他賽敏化的不同機制。因此，在本發(fā)明的一個方面，可根據(jù)表I和表II中所述的一個或多個基因的活化以及這些基因的蛋白質(zhì)水平來選擇治療策略，并監(jiān)測所選治療策略的有效性。在一特定的實施方案中，我們提供了一種方法,監(jiān)測化療過程中表I和表II中所示的一個或多個基因的活化水平，以評價和預測化療對患者的有效性。對取自腫瘤(如乳腺瘤、結(jié)腸瘤、非小細胞肺瘤和胃瘤)的活檢材料、或取自未確診癌癥患者或正接受治療的患者的腫瘤活檢材料的短期培養(yǎng)物進行處理，以便分離出DNA(Hafner等,Arch Pathol Lab Medl27 :1221,2003 ;Rodriguez 等，Clin Cell Res 10 :5785，2004)、信使 RNA (Chang 等， Lancet. 362 :340, 2003)和 / 或蛋白質(zhì)(Espina 等，J Tmmunol Methods 290 :121, 2004),以評價表I和表II中所描述的基因或其亞群的活化水平或蛋白質(zhì)水平?；蜣D(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達圖譜可用于診斷和預測可能的治療策略的療效，并可作為監(jiān)測患者治療反應的有用工具。按照本發(fā)明,可用本領(lǐng)域常用的任何現(xiàn)有方法(Ullmann等，J Biomol Screen 9 95,2004 ;Badiee等，BMC Biotechnol 3:23,2003)從腫瘤樣品中分離RNA。從受試者身上獲取一個或多個細胞，并從細胞中分離出RNA。例如,可從受試者身上獲得外周血白細胞 (PBL)，亦可以獲得一細胞樣品后，針對需要的細胞類型富集該樣品。可采用各種技術(shù)將細胞從細胞混合體中分離出來，例如，采用與所需細胞類型上的特定表位結(jié)合的抗體來分離細胞。如果所需的細胞是在固體組織中，則可使用顯微切割或激光捕獲顯微切割(LCM)之類的方法分割特定細胞(Bonner 等，Science 278 :1481,1997 ;Fend 等,Am J Path 154 61，1999)?？捎酶鞣N方法從組織或細胞樣品中提取RNA，例如硫氰酸胍溶解繼以氯化銫離心(Chirgwin等,Biochemistry 18:5294,1979)?？蓮膯蝹€細胞獲取RNA,如從單個細胞制備cDNA文庫的方法所述(Dulac，Curr Top Dev Biol. 36 :245，1998)。RNA樣品可針對特定種類進一步富集。例如，在一實施方案中，可從RNA樣品中分離出poly(A)+RNA。特別是， poly-T寡核苷酸可作為mRNA的親合配體被固定于固體載體上。用于該目的的試劑盒已有市售，如 MessageMaker 試劑盒(Life Technologies, Grand Island, N. Y.)。該富集過程可通過引物特異性cDNA合成、或以cDNA合成為基礎(chǔ)進行多輪線性擴增以及模板指導的體外轉(zhuǎn)錄等方法(Wang 等，Proc Natl Acad. Sci USA86 :9717,1989 ；Dulac 等，同上)實現(xiàn)。有多種擴增方法適用于本發(fā)明的方法，包括例如聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR) (Wu 和 Wallace, Genomics 4 560,1989)、自主序列復制(SSR) (Guatelli 等，Proc Natl Acad Sci USA 87 :1874，1990)、基于核酸的序列擴增(NASBA)和轉(zhuǎn)錄擴增(Kwoh 等，Proc Natl Acad Sci USA 86:1173,1989)。PCR 技術(shù)專用方法為本領(lǐng)域內(nèi)所熟知(例如參見 PCRTechnology Principles and Applications for DNA Amplification (H. A. Erlich 編，F(xiàn)reeman Press, N. Y. , N. Y. , 1992) ；A Guide to Methods and Applications (Innis 等編,Academic Press, San Diego, Calif. , 1990)?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員了解的方法標記RNA以進行檢測。例如，采用由 Affymetrix公司等生產(chǎn)的微列陣。采用任何常用方法進行雜交以標記和檢測RNA，例如用染料如 Cyanine-3 或 Cyanine-5 (Perkin Elmer MPS544001KT)直接標記 RNA。其它方法包括通過核苷酸反轉(zhuǎn)錄使用Cyanine-3或Cyanine-5 (Badiee A 2003)、突光素或Alexa染料(Molecular Probes)或其它突光團對cDNA直接標記。再則，還可利用間接的cDNA標記，如FairPlayTM/氨基烯丙基標記(Stratagene目錄號252002)、3DNA樹狀聚體標記 (Genisphere Inc)或酶信號擴增(MICROMAX TSA,Perkin Elmer)。另外，可使用通過酶、突光、放射性或發(fā)光等方法檢測的RNA探針量化RNA。在本發(fā)明的一個方面，RNA取自腫瘤樣品，并運用Taqman技術(shù)檢測遺傳標記物。生成引物以檢測表I和表II中標明的特定RNA或其亞群，并用反轉(zhuǎn)錄酶來擴增引物。對反轉(zhuǎn)錄擴增的特定片段的檢測可通過以下方式完成凝膠電泳、多聚體電泳、直接DNA定序、光檢測、熒光信號的喪失、酶反應或經(jīng)由對互補RNA的雜交進行檢測。在本發(fā)明的另一方面，利用實時PCR來檢測寡核苷酸。將取自腫瘤樣品的mRNA反向翻譯為cDNA。生成引物以通過聚合酶鏈式反應技術(shù)來擴增表I和表II中標明的特定RNA 或其亞群?？赏ㄟ^凝膠電泳和溴化乙啶或CYBR綠染色，或通過測量聚合酶所釋放的熒光團標記序列特異探針發(fā)出的熒光強度來完成mRNA水平的檢測。在本發(fā)明的又一個方面，采用了 Northern印跡法。RNA取自腫瘤樣品，然后凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至一膜上。通過采用P32等放射性同位素標記探針的雜交，或通過基于酶的顯色法或發(fā)光法，來確定RNA豐度。在本發(fā)明的另一方面，基因的量可作為轉(zhuǎn)錄水平的替代指示物。表I和表II中的轉(zhuǎn)錄物或其亞群的基因的量可以定量地確定，從而評價腫瘤對多西他賽療法是否有反應 (Rodriguez等，Clin Cancer Res 10:5785,2004)。由于此評價在新輔助治療(手術(shù)前的治療)之前進行，所以，如果患者屬于有反應之列，則可用多西他賽治療，如果屬于無反應之列，則可施用另一種化療藥劑。從患者腫瘤活檢材料中提取DNA，并以本領(lǐng)域技術(shù)人員所用方法對其純化以去除污染物。用來確定腫瘤DNA中的基因量的方法包括但不限于定量PCR、基因組DNA芯片、原位雜交或 Southern 印跡法(Hafner 等，Arch Pathol Lab Med 127 :1221, 2003 ;Rodriguez 等，Clin Cancer ReslO =5785,2004)。因此，這些方法可用于確定表I和表II中一個基因或多個基因的拷貝數(shù)，并將其與對照樣品或參照標記物相比較。
在本發(fā)明的又一個方面，蛋白質(zhì)水平可用作轉(zhuǎn)錄水平的替代測量標準。已表明蛋白質(zhì)水平與轉(zhuǎn)錄水平的抑制或提高相關(guān)。因而，本發(fā)明包括用來測量與由表I和表II中轉(zhuǎn)錄物編碼的多肽產(chǎn)物相關(guān)的蛋白質(zhì)水平的技術(shù)。蛋白質(zhì)作為對多西他賽的預測反應的標記物加以檢測和使用。蛋白質(zhì)檢測方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，免疫測定是運用抗體檢測靶蛋白表達的方法。在一特定實施方案中，免疫測定被用來檢測表I和表II所列的一個或多個基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。另外，抗表I和表II所列任何一種蛋白質(zhì)的抗體可用于許多其它檢測方法中。 這些檢測方法包括但不限于下列各項=Western印跡法、ELISA測定和夾心ELISA。另外，亦考慮采用其它不使用抗體的測定法，包括那些使用識別由表I和表II所列轉(zhuǎn)錄物所編碼蛋白質(zhì)的DNA寡核苷酸或多肽(如適體)的方法。亦可采用生物樣品的質(zhì)譜分析方法，通過確定蛋白水解分裂后肽片段的精確分子量，來確定多肽的組成成分。本發(fā)明進一步包含合適的標記，其中包括酶、熒光團，如異硫氰酸熒光素(FITC)、 藻紅蛋白(PE)、得克薩斯紅(Texas red，TR)、羅丹明、游離或螯合的鑭系鹽、發(fā)色團、放射性同位素、螯合劑、染料、膠體金、乳膠顆粒、配體(如生物素)和化學發(fā)光劑。在本發(fā)明的一個方面，所用放射性標記可為同位素，如3H、14C、32P、35S、36C1、 51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、13lUP 186Re等?？赏ㄟ^目前已知和可得到的計算程序定量放射活性水平。反之，亦可采用不透射線的物質(zhì)。在標記為酶的實施方案中，可采用目前利用的比色法、分光光度法、熒光分光光度法、電流測量法或本領(lǐng)域熟知的氣體定量分析法等任何一種技術(shù)實現(xiàn)檢測。本發(fā)明的又一個方面是采用肽結(jié)合劑，例如抗體或抗體片段。抗體包括按照常規(guī)方法制備的多克隆抗體和單克隆抗體。僅抗體分子的一小部分，即抗原互補位，參與該抗體與其表位的結(jié)合(一般內(nèi)容參見，Clark, ff. R. (1986), The Experimental Foundations of Modem Immunology, Wiley&Sons, Inc. , New York ；Roitt, I. (1991), Essential Immunology,第 7 版,Blackwell Scientific Publications, Oxford)。例如,pFc，和 Fe 區(qū)域為補體級聯(lián)的效應因子，但不參與抗原結(jié)合。其PFc’區(qū)域已被酶斷裂，或生成時缺失 pFc’區(qū)域的抗體被稱為F(ab’)2片段，它保留完整抗體的兩個抗原結(jié)合位點。因此，本發(fā)明的一個實施方案采用帶有可檢測標記的抗體片段，如F(ab’)2。同樣，其Fe區(qū)域已被酶斷裂，或其生成時缺失Fe區(qū)域的抗體被稱為Fab片段，它保留完整抗體分子的抗原結(jié)合位點之一。Fab片段由一個共價結(jié)合的抗體輕鏈和抗體重鏈的一部分(被稱為Fd)組成。Fd 片段為抗體特異性的主要決定子(一個單一 Fd片段可與多達10個不同的輕鏈相結(jié)合而不改變抗體特異性)，單獨存在的Fd片段保留了表位結(jié)合能力。正如本領(lǐng)域所熟知的，在抗體的抗原結(jié)合部分內(nèi)，有互補決定區(qū)(CDR)，而互補決定區(qū)直接與抗原的表位和主鏈區(qū)域(FR)發(fā)生相互作用，主鏈區(qū)域維持抗原互補位的三級結(jié)構(gòu)(一般內(nèi)容參見Clark，1986 ;Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重鏈Fd片段和輕鏈中，有4個主鏈區(qū)域(FRl至FR4)，它們分別被3個互補決定區(qū)(⑶Rl至⑶R3)分隔開。這些CDR，特別是CD3區(qū)域，尤其是重鏈CDR3，在很大程度上決定著抗體特異性。哺乳動物抗體的非CDR區(qū)域可為同種或異種抗體的相似區(qū)域所替代，同時保留原抗體的表位特異性， 這已為本領(lǐng)域所公認。這在“人源化”抗體的研發(fā)和利用中得到極為清楚的證明，在該“人源化”抗體中非人類CDR與人類的FR和/或Fc/pFc’區(qū)域共價連接產(chǎn)生功能抗體(參見第4，816，567,5, 225，539,5, 585，089,5, 693，762 和 5，859，205 號美國專利)。完全人類單克隆抗體亦可通過對轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫處理來制備，這些轉(zhuǎn)基因小鼠在很大部分基因座上具有人類免疫球蛋白重鏈和輕鏈。對這些小鼠(如 XenoMouse (Abgenix),HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))進行免疫處理后，可按照標準的雜種瘤技術(shù)制備單克隆抗體。這些單克隆抗體將具備人類免疫球蛋白氨基酸序列，因而，應用于人類時不會引起人類抗小鼠抗體(HAMA)反應。因此，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明亦包括F(ab’)2、Fab、Fv和 Fd片段；嵌合抗體(其中Fe和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域已被同源的人類或非人類序列所替代)；嵌合F(ab’)2片段抗體(其中FR和/或CDRl和/ 或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域已被同源的人類或非人類序列所替代)；嵌合Fab片段抗體 (其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域已被同源的人類或非人類序列所替代)以及嵌合Fd片段抗體(其中FR和/或CDRl和/或CDR2區(qū)域已被同源的人類或非人類序列所替代)。本發(fā)明亦包括所謂單鏈抗體。通過參考下列非限制性實施例可更好地理解本發(fā)明，這些實施例作為本發(fā)明的范例提供。列出以下實施例是為了更充分地說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而決不應以任何方式將其解釋為限定本發(fā)明的廣泛范圍。
實施例實施例l:siRNA篩選為了鑒別能增加細胞對多西他賽的抗藥性或敏感性的基因，在HCT116細胞內(nèi)針對101種基因進行了 SiRNA篩選，同時使用一系列多西他賽濃度以產(chǎn)生劑量效應曲線。人的結(jié)腸癌細胞系HCT116從ATCC獲得，并在37°C與95% CO2和5% O2的條件下在補加100 單位/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、4mM L-谷氨酰胺和10 %胎牛血清的McCoy 5A中培養(yǎng)。siRNA列表包含癌相關(guān)基因，其中包括在對多西他賽具有抗藥性的乳房腫瘤中過表達的那些基因，正如基因表達圖譜實驗所顯示(Chang等，Lancet 362:362,2003)。其它的準則是，該目標可經(jīng)得起藥物開發(fā)的驗證?？偟姆桨父爬ㄈ缦?。第一天，將HCT116細胞按每孔5，000個細胞接種在96孔培養(yǎng)板上，第二天按每基因用3-4種siRNA轉(zhuǎn)染。所用siRNA 的代表性樣品如表I和表II所示。用脂質(zhì)體試劑Lipofectamine2000 (Invitrogen)在96 孔培養(yǎng)板上將SiRNA(Dharmacon)轉(zhuǎn)染至HCT 116細胞內(nèi)。第三天，將siRNA除去并加入濃度范圍為O到40nM的多西他賽。第六天，使用WST-I測定法定量測定細胞存活率。這是一種監(jiān)測存活細胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性的測定法，該活性導致了四唑鹽WST-I的裂解而形成甲臜(formazan)。在測定當天，將培養(yǎng)基從96孔培養(yǎng)板上除去。將WST-I試劑(Roche)在 McCoy 5A培養(yǎng)基中稀釋10倍并于每孔內(nèi)加入IOOul。然后將培養(yǎng)板于37°C培養(yǎng)40-80分鐘，再在SpectroMax (Molecular Devices)上于450nm讀數(shù)。通過計算實驗siRNA與對照 siRNA數(shù)值的比率，將WST-I值按等級分組，結(jié)果共15個基因被鑒定為可增加敏感性，9個基因可增加抗藥性，如下文的表III所示。增加敏感性和抗藥性的基因可進一步劃分為以下兩種類型1)在多西他賽濃度較低時(1_6ηΜ)觀察到siRNA改變IC50的效應，或2)在較高濃度時(> 6nM)觀察到顯著的效應和較小的IC50變化。與Mad2、BubRl 和 Mpsl 的 siRNA 相比，革巴向 Grb2> CDK6、Sepharase,以及隹丐 / 隹丐調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II S (CamKIID)的siRNA在較低的多西他賽濃度范圍(l_6nM)內(nèi)顯示了更顯著的效應和典型的IC50變化?？傊@一亞組顯示了比有絲分裂檢查點基因較弱的抗藥性，而且CamKIID siRNA形成了最高水平的保護，比對照細胞高出兩倍。這些數(shù)據(jù)顯示，四個有絲分裂檢查點基因以及其它幾個基因的喪失可在不同程度上增加對多西他賽的抗藥性。圖I的數(shù)據(jù)顯示了對于用siRNA轉(zhuǎn)染隨后又接觸各種濃度多西他賽的細胞的幾條典型的劑量效應曲線。針對四種有絲分裂檢查點基因，包括BubRl、Bubl、Mad2和Mpsl (Bubl 的數(shù)據(jù)未顯示)以及Rac/Cdc42的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFT)的siRNA，顯示了對多西他賽的顯著抗藥性，在較高的多西他賽濃度范圍(>6nM)此效應更為顯著。對于Mad2顯示了抗藥性的最高水平，其細胞存活率比對照siRNA轉(zhuǎn)染的細胞增加五倍。在篩選中大多數(shù)siRNA沒有得分，作為一個代表性實例，我們在此處顯示了人的成視網(wǎng)膜細胞瘤I (RBl)。綜上所述，這些結(jié)果顯示，siRNA篩選可幫助人們了解基因表達的下調(diào)是如何敏化細胞或在用多西他賽處理時如何保護細胞，以及根據(jù)不同的濃度而產(chǎn)生不同的作用機制以減緩多西他賽引起的細胞死亡。
權(quán)利要求
1.一種預測或監(jiān)測癌癥患者對紫杉醇類分子的反應的試劑盒，其中該試劑盒包括用于測量如下遺傳標記物的試劑Pim-I :人 pim-1 癌基因(PMl)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002648)。
2.權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述測量遺傳標記物Pim-I的試劑選自帶有可檢側(cè)標記的抗體、帶有可檢側(cè)標記的抗體片段或帶有可檢測標記的寡核苷酸，其中該寡核苷酸能在嚴格條件下與所述遺傳標記物雜交，所述抗體片段選自F(ab’ )2, Fab, Fv和Fd片段。
3.權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述可檢測標記選自酶、放射性同位素、或發(fā)熒光的化合物、化學發(fā)光分子、不透射線的物質(zhì)、脂質(zhì)體以及半抗原分子。
4.一種預測或監(jiān)測癌癥患者對紫杉醇類分子的反應的試劑盒，其中該試劑盒包含測量選自如下的一種或一種以上遺傳標記物的試劑P21 (Wafl):人細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑1Α(ρ21，Cipl)(⑶KN1A)，轉(zhuǎn)錄變體 1，mRNA (GenBank 登錄號NM_000389)；Pim-I :人 pim-1 癌基因(PMl)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002648)；GBP-I :人鳥苷酸結(jié)合蛋白1，干擾素可誘導，67kDa(GBPl)，mRNA(GenBank登錄號 NM_002053)；RXRA :人類類視黃醇 X 受體，a (RXRA)，mRNA (GenBank 登錄號NM_002957)；SPF45 :人 RNA 結(jié)合基序蛋白 17 (RBM17)，mRNA (GenBank 登錄號NM_032905)；Hecl :人動粒相關(guān) 2(KNTC2)，mRNA (GenBank 登錄號NM_006101)；Rafl :人 raf 癌基因的 mRNA (GenBank 登錄號X03484)；Aurora A :人 aurora-相關(guān)激酶 I (ARK I) mRNA,完全 cds (GenBank 登錄號AF008551)； TACC3 :人轉(zhuǎn)化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3(TACC3)，mRNA (GenBank登錄號 NM_006342)；RelB:人v-rel網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒癌基因同系物B，B-細胞3 (鳥類)的κ輕多肽基因增強子的核因子(RELB)，mRNA(GenBank登錄號NM_006509)；PRKCD :人蛋白激酶 C，δ (PRKCD)，轉(zhuǎn)錄變體 1，mRNA (GenBank 登錄號NM_006254)； BRAF35 :人高泳動族 20B(HMG20B)，mRNA (GenBank 登錄號NM_006339)；HSPAlL :人熱休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)，mRNA (GenBank 登錄號NM_005345)；STKll :人絲氨酸/蘇氨酸激酶11(波-杰綜合征)(STKll)，mRNA(GenBank登錄號 NM_000455);和MKK3 :人 MAP 激酶激酶 3 (MKK3)mRNA,完全 cds (GenBank 登錄號L36719)，條件是所述試劑盒包含測量遺傳標記Pim-I的試劑。
5.權(quán)利要求4的試劑盒，其中測量所述一種或一種以上遺傳標記物的試劑選自帶有可檢測標記的抗體、帶有可檢測標記的抗體片段或帶有可檢測標記的寡核苷酸，其中該寡核苷酸能在嚴格條件下與所述遺傳標記物雜交，所述抗體片段選自F(ab’)2、Fab、Fv和Fd片段。
6.權(quán)利要求5的試劑盒，其中所述可檢測標記選自酶、放射性同位素、或發(fā)熒光的化合物、化學發(fā)光分子、不透射線的物質(zhì)、脂質(zhì)體以及半抗原分子。
7.權(quán)利要求1-6任一項的試劑盒，其中所述試劑盒還包含從身體樣品獲取總RNA的試劑，將總RNA反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA的試劑，和對該cDNA進行聚合酶鏈式反應的試劑。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中對所述cDNA進行聚合酶鏈式反應的試劑包含一套引物， 其中這套引物中的一個或兩個具有可檢側(cè)標記，且兩個引物均衍生自遺傳標記Pim-I的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述可檢測標記選自酶、放射性同位素、或發(fā)熒光的化合物、化學發(fā)光分子、不透射線的物質(zhì)、脂質(zhì)體以及半抗原分子。
10.權(quán)利要求1-6任一項的試劑盒，其中所述試劑盒還包含測量選自以下一種或更多種參照遺傳標記物的水平的試劑GAPDH :人3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)，mRNA (GenBank登錄號NM_002046);和 RPS9 :人 cDNA 克隆 IMAGE :6647283,部分 cds (GenBank 登錄號BC071941)。
11.權(quán)利要求1-6任一項的試劑盒，其中所述紫衫醇類分子選自泰素、多西他賽、 XRP9881 和 XRP6258。
全文摘要
本發(fā)明測量對多西他賽抗藥性或敏感性的方法，涉及某些新穎、有效的方法，這些方法通過測量特定遺傳標記物較對照物的增加或減少，可預測或監(jiān)測患者對紫杉醇類分子的反應。本發(fā)明還提供了某些試劑盒，這些試劑盒通過測量特定遺傳標記物的核酸或蛋白質(zhì)水平并與對照物或參照標志比較，可預測或監(jiān)測患者對紫杉醇類分子的反應。
文檔編號C12Q1/68GK102605066SQ201210067448
公開日2012年7月25日 申請日期2005年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者D·格呂內(nèi)貝格, P·奧古斯特, S·納特森, 黃西 申請人:安萬特藥物公司