專利名稱：一種高表達、嗜熱、高酶活力的醛縮酶及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種醛縮酶，以及編碼該醛縮酶的基因、載體、工程菌及其應用。
背景技術：
醛縮酶作為催化碳碳原子立體成鍵的酶，可以廣泛的應用在有機化學合成中，它可以方便的以小分子為起點向大的復雜分子方向進行不對稱催化合成，這個過程在碳水化合物為底物的反應中意義尤為突出。應用酶的高區域選擇性，能夠容易避開對碳水化合物中的活潑的羥基的保護，更為突出的是在催化碳碳鍵合成的同時醛縮酶可以引入新的手性中心。正是這種能夠高效引入手性碳原子的能力，使得醛縮酶在藥物分子合成領域中有著廣泛的應用，與化學工藝相比，具有明顯優勢，如避免了有毒有害物質的使用，合成可在常溫常壓條件下進行。從替代傳統化學合成工藝催化劑的角度，該酶催化的反應具有很強的綠色屬性，對傳統化學工藝的綠色化學改造有著重要意義，因而該酶具有廣闊的應用前景。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的、編碼基因、載體、工程菌及其應用。該新的醛縮酶與常規醛縮酶相比具有高表達、嗜熱、高酶活力的特性。本發明采用的技術方案是一種來源于PyrcAaculum calidifontis的醛縮酶基因(DERA)，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示atgctgcatctggtggactttgctctgctgaaaccgtatctgtctatcgaagaggtggtt60
aaaggtgccgaaaaagcggaacgtctgggcgttgcagcgtactgcgttaacccggcttac120
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accccggaggctctggcactcgag684 由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO. 1所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的等位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上
3改變其編碼的氨基酸的功能。 一種高表達、嗜熱、高酶活力的醛縮酶，由所述醛縮酶基因編碼。具體的，所述醛縮酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示MetLeuHisLeuValAspPheAlaLeuLeuLysProTyrLeuSerlie
151015
GluGluValValLysGlyAlaGluLysAlaGluArgLeuGlyValAla
202530
AlaTyrCysValAsnProAlaTyrAlaAlaTyrValLysProLeuLeu
354045
LysArgValLysLeuCysValValValAspPheProPheGlyAlaLeu
505560
ProThrTrpAlaArgAlaGlyLeuValSerLysLeuAlaGluValAla
65707580
GluGluLeuAspValValAlaProlieGlyLeuValLysSerLysAla
859095
TrpArgGluValArgArgAspLeulieSerValValGlyAlaAlaGly
100105110
GlyArgValValLysVallieValGluGluProTyrLeuThrAspGlu
115120125
GluArgTyrThrLeuTyrAsplieValAlaGluAlaGlyAlaHisPhe
130135140
lieLysSerSerThrGlyPheAlaGluGluAlaTyrAlaAlaLysLeu
145150155160
GlyAsnProValAlaSerThrProGluArgAlaAlaAlalieAlaArg
165170175
TyrValLysGluArgGlyTyrLysLeuGlyValLysMetAlaGlyGly
180185190
lieArgThrLysGluGlnAlaArgAlalieValGluAlalieGlyPhe
195200205
GlyGluAspProAlaArgValArgLeuGlyThrSerThrProGluAla
210215220
LeuAlaLeuGlu
225
經實驗證明，上述結構的蛋白質具有很好的高表達->嗜熱、高酶活力的特性
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQID NO. 2所示氨基酸序列的多狀
或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨基酸序列同源性在95%以上，均屬于本發明保護范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。本發明還涉及一種含有所述醛縮酶基因的重組載體，以及所述重組載體轉化得到的重組基因工程菌。本發明還涉及所述的醛縮酶基因在制備重組醛縮酶中的應用。具體的，所述的應用為構建含有所述醛縮酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養(通常以IPTG為誘導劑)，培養液分離得到含有重組醛縮酶的菌體細胞。本發明的要點在于提供了 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，在已知該核苷酸序列和氨基酸序列的情況下，該核苷酸序列和氨基酸序列的獲得，以及相關載體、宿主細胞的獲得，對于本領域技術人員來說均是顯而易見的。本發明的高表達、嗜熱、高酶活力的醛縮酶可按如下方法獲得1、DERA基因全長的cDNA合成與克隆根據DERA基因的核苷酸序列，進行全基因合成，獲得SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的醛縮酶基因。2、含目的基因的表達載體的構建將步驟1得到的醛縮酶基因克隆至中間載體。3、將步驟2得到的重組表達載體轉入宿主細胞中，如大腸桿菌(Escherichiacoli)BL 21，在適合表達醛縮酶的條件下，培養所述宿主細胞。4、從步驟3的培養物中分離出醛縮酶。本發明的有益效果主要體現在提供了一種醛縮酶，以及編碼該醛縮酶的基因、載體、工程菌及其應用，該醛縮酶可用于2，4，6-三脫氧己糖化合物的合成，綠色環保，應用前景廣闊。
圖1為Pyrobaculum calidifontis的酸縮酶表達結果(M :marker ；2 全菌體蛋白；3 =DERA)。圖2為DERA裂解2_脫氧-D-核糖_5_磷酸酯反應中NADH在340nm處吸光值變化曲線。圖3為不同溫度下DERA的相對活力。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 :DERA基因全長的cDNA合成與克隆根據NCBI中的來自Pyrobaculum calidifontis的DERA基因的核苷酸序列，交上海生工生物工程技術有限公司進行全基因合成，成功獲得SEQ ID NO. 1所示核苷酸的序列。根據PyrcAaculum calidifontis的DERA基因編碼序列(SEQ ID N0. 1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點，以便表達載體。以基因合成的產物為模板，經PCR擴增后，將PyrcAaculum calidifontis的DERA克隆至中間載體pET303/CT (購自hvitrogen公司)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉入 E. Coil BL21 中，得到工程菌 E. Coil BL21/pET 303 CT/DERA。
實施例2 =DERA蛋白的表達將實施例1 中獲得的 E. Coil BL21/pET 303 CT/DERA 在含 IOOmLlOO μ g/mL 氨芐青霉素的LB液體培養基中搖床過夜培養。將IOml過夜培養后的菌液倒入IL 100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基培養，直到菌液0D_達到0. 6 0. 8時加入IPTG終濃度為0. 5mM, 誘導1 后，離心收集菌體，菌體用25ml磷酸緩沖液pH7. 4使其重懸浮，超聲破碎細胞。離心取上清，含DERA的上清用0. 22 μ m醋酸纖維素濾膜過濾后鎳柱親和層析進行純化獲得DERA 021純酶。綜合BCA法測定DERA酶濃度數據，LB培養基中DERA酶的表達量達到約220mg/L(圖1)，單位培養液酶的表達量較高。實施例3 =DERA的高酶比活力本發明以2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯為底物，室溫條件下，DERA催化裂解一分子底物解得到一分子三磷酸甘油醛，其在NADH及丙糖磷酸異構酶存在的情況下，被甘油三磷酸脫氫酶催化，每一分子三磷酸甘油醛被催化消耗一分子NADH。通過測量NADH在340nm波長的UV吸收來檢測動力學曲線以分析測定DERA的天然底物分解活性。一分子NADH的消耗對應一分子2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯的分解。具體操作如下用IOOmM咪唑鹽酸緩沖液(pH8. 0)溶解DERA配成酶液，加入至底物的混合溶液(0. ImM NADH，0. 4mM 2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯，llU/mL丙糖磷酸異構酶，4U/mL甘油三磷酸脫氫酶)，測定340nm處吸光值，每秒測定一次。根據曲線前100秒的數據計算出NADH吸光值變化的速率為-0. OSOmin-1 (圖2)。一次反應所用酶量為5 μ L，酶濃度經BCA法測定為20ng/y L，根據以上數據最終得出DERA的比酶活力為24. 12U/mg，具有較高的酶比活力。實施例4 =DERA的嗜熱性以實施例3 中反應體系為準，分別在 20°C，30°C，40°C，50°C，60°C，70°C，80°C，90°C，100°C下測定DERA的酶分解活力。以測得的DERA分解活力最高值為100%，得到各個溫度下DERA相對分解活力。如圖2所示，結果表明來自Pyrobaculum calififontis的DERA酶在70°C時分解活力最高，具有嗜熱性。
權利要求
1.一種來源于PyrcAaculum calidifontis的醛縮酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種高表達、嗜熱、高酶活力的醛縮酶，由權利要求1所述醛縮酶基因編碼。
3.如權利要求2所述的醛縮酶，其特征在于所述醛縮酶氨基酸序列如SEQID NO. 2所
4.一種含有權利要求1所述醛縮酶基因的重組載體。
5.一種用權利要求4所述重組載體轉化得到的重組基因工程菌。
6.如權利要求1所述的醛縮酶基因在制備重組醛縮酶中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述的應用為構建含有所述醛縮酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離得到含有重組醛縮酶的菌體細胞。
全文摘要
一種高表達、嗜熱、高酶活力的醛縮酶及其應用。本發明提供了涉及一種醛縮酶，以及編碼該醛縮酶的基因、載體、工程菌及其應用。所述來源于Pyrobaculum calidifontisi的醛縮酶基因(DERA)，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述醛縮酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本發明所述醛縮酶可用于2，4，6-三脫氧己糖化合物的合成，綠色環保，應用前景廣闊。
文檔編號C12N15/60GK102559723SQ20121006404
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月12日 優先權日2012年3月12日
發明者杜鵬飛, 王秋巖, 謝恬 申請人:杭州師范大學