專利名稱：用于同時檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、i型和ii型犬腺病毒的多重pcr檢測引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一套檢測病毒的引物，尤其涉及一套用于同時檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒多重PCR方法的引物，屬于病毒的檢測領域。
背景技術：
犬痕熱病毒(Caninedistemper virus, CDV)、犬細小病毒(Canine parvovirus, CPV)和犬腺病毒(Canine adenovirus,CAV)是引起犬發(fā)病的主要病原，這3種病毒單一或混感后臨床致死率可達50% -100%，給養(yǎng)犬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。臨床上，⑶V引起的犬瘟熱主要有呼吸型、消化型、神經(jīng)型和混合型四種，CPV主要引起犬急性出血性胃腸炎和幼犬急性心肌炎。CAV根據(jù)其血凝和中和試驗等特性不同可將 CAV分為I型和2型，即CAV-I和CAV-II。。CAV-I在臨床上可導致犬傳染性肝炎、狐貍和熊腦炎的發(fā)生。CAV-II引起犬、狐傳染性喉氣管炎。犬的這幾種主要疾病臨床癥狀相似，并常有混合感染，給診斷造成困難。常用的單項PCR方法耗時長，有必要建立快速的早期診斷方法，以便盡快采取有效的防控措施，減少這些疾病對養(yǎng)犬業(yè)造成的危害。鑒于此，本試驗建立了⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II的多重 PCR檢測方法，為臨床檢測提供保障
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的結束問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一套可用于檢測犬瘟熱病毒野毒株的RT-LAMP引物。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的本發(fā)明的一套用于檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR 檢測引物，其特征在于所述引物包括三對引物，其中，所述的用于犬瘟熱病毒檢測的引物序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；所述的用于犬細小病毒檢測的引物序列分別為 SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示；所述的用于I型和II型犬腺病毒檢測的引物序列為 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 所示。本發(fā)明還提供了一種檢測犬瘟熱病毒(⑶V)、犬細小病毒(CPV)、1型和II型犬腺病毒(CAV-I、CAV-II)的方法，其特征在于包括以下步驟配制25 ii L PCR 反應體系10X Ex Buffer 2. 5 U L, dNTPs 2 U L, Ex Taq DNA 聚合酶 0. 25 u L、CDV-Nl 和 CDV-N2 各 0. 35 y L、CPV-NSl 和 CPV-NS2 各 0. 35 y L、CAV-E31 和 CAV-E32 各 0. 65 ii L、CDV 模板 0. 75 u L、CPV 模板 0. 75 u L、CAV-1 模板 0. 75 u L、CAV-II 模板 I. 5 u L、滅菌 ddH20 13. 5 u L ；其中，引物⑶V-Nl和⑶V-N2用于犬瘟熱病毒的檢測，其序列分別為SEQ IDNO : I 和SEQ ID NO :2所示；引物CPV-NSl和CPV-NS2用于犬細小病毒的檢測，其序列分別為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示；引物CAV-E31和CAV-E32用于I型和II型犬腺病毒的檢測，其序列分別為SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示；
PCR 反應程序94°C預變性 5min ;94°C變性 30S，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；觀察取L PCR產物，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。進一步的，本發(fā)明還提供了一種用于檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的試劑盒，其特征在于包含本發(fā)明所述的引物。更進一步的，本發(fā)明還提供了所述的引物在制備檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I 型和II型犬腺病毒單一感染或混合感染試劑中的應用。及所述的試劑盒在制備檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒單一感染或混合感染試劑中的應用。以本發(fā)明所設計的引物采用多重PCR檢測方法對⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II進行檢測，檢測結果均為陽性，而對其他常見犬源性病毒檢測結果均為陰性。應用本發(fā)明引物序列采用多重PCR方法，可以同時檢測⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點。本發(fā)明所設計的引物序列在發(fā)病犬早期檢測和快速診斷中具有重要意義。
圖I為多重PCR擴增結果；I :陰性對照；2 CDV ；3 CPV ；4 CAV-I ；5 =CAV-II ；6 CDV+CPV+CAV-I+CAV-II ；M DL 2000 DNA Marker圖2為多重PCR特異性試驗結果；I CDV ；2 CPV ；3 CAV-I ；4 =CAV-II ；5 :CDV+CPV+CAV-I+CAV_II ；6 RV ；7 陰性對照；M DL 2000DNA Marker圖3為多重PCR敏感性試驗結果。M DL 2000DNA Marker ;1 :陰性對照；2 10_1 ；3 :1(T2 ；4 :1(T3 ；5 :1(T4 ；6 :1(T5 ；7 1(T具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。實施例II材料和方法I. I病毒株⑶V株、CPV株、CAV-I、CAV-II株及狂犬病毒(RV)株均由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存。I. 2主要試劑Ex Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL 2000DNA Marker、M-MLV 酶和 RNA 酶抑制劑購自購自寶生物工程(大連)公司；DNA提取試劑盒購自Omega公司；RNA提取試劑盒購自Qiagen 公司。
I. 3引物設計分別根據(jù)GenBank中CBVN基因序列、CPVNS基因序列和CAV E3基因序列，設計3 對特異引物，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。序列見表I。表I多重PCR引物序列
引物_序列(5'-3')._長度(bp)
TGCGGTCTTACATTTGCATC ( SEQ ID NO. I )
CDV507
ACTCCAGAGCAATGGGTAGGG ( SEQ ID N0.2 )
CPVATGGTTGGTGACTCTTTGTTT ( SEQ ID N0.3 )287
ACATTTGATTGACACTTCCC ( SEQ ID N0.4 )
CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC ( SEQ ID N0.5 )
CAV-I/II 590/1027 _CCTAGAGCACTTCGTGTCCGCTT ( SEQ ID N0.6 )_I. 4RNA 和 DNA 的提取按RNA提取試劑盒和DNA抽提試劑盒說明書分別提取病毒RNA和病毒DNA。I. 5多重PCR方法建立以CDV的cDNA和CPV、CAV-I, CAV-II的DNA混合物作為多重PCR的模板，建立 PCR 反應。采用 25 ii L 反應體系10 X Ex Buffer 2. 5 u L, dNTPs 2 u L, Ex Taq DNA 聚合 SI 0. 25 u L、CDV-Nl 和 CDV-N2 各 0. 35 y L、CPV-NS I 和 CPV-NS2 各 0. 35 y L、CAV-E31 和 CAV-E32 各 0. 65 ii L、CDV 模板 0. 75 u L、CPV 模板 0. 75 u L、CAV-1 模板 0. 75 u L、CAV-II 模板 I. L、滅菌 ddH20 13. 5 u L0 反應程序:94°C預變性 5min ;94°C變性 30S，55°C退火 30s， 72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。取5 y L PCR產物，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳， 于凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。I. 6多重PCR方法的特異性試驗以優(yōu)化的多重PCR條件對CDV、CPV、CAV_I、CAV-II和RV進行PCR擴增，以檢測該
方法的特異性。I. 7多重PCR方法的敏感性試驗分別測定⑶V、CPV、CAV_I和CAV-II的模板濃度，稀釋成相同濃度后，再10倍梯度稀釋，測定該雙重PCR方法的敏感性。2 結果2. I多重PCR的擴增采用優(yōu)化的PCR方法，對⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II的核酸模板及混合模板進行 PCR擴增，結果獲得大小約為500bp、300bp、600bp和IOOObp的片段，與測序結果507bp、 287bp、598bp和1 027bp 一致，結果如圖I所示。2. 2多重PCR的特異性試驗用建立的多重PCR 方法，對 CDV、CDV+CPV+CAV-I+CAV-II、CPV、CAV-I, CAV-II, RV和健康犬的核酸提取物進行擴增，結果顯示，只有CDV、CDV+CPV+CAV-I+CAV-II、CPV、CAV-I、 CAV-II有特異性的擴增產物，而RV未見擴增，表明該方法具良好特異性(圖2所示。)。2. 3多重PCR的敏感性試驗 在優(yōu)化的PCR反應條件下，CDV的最高檢測敏感度為10_7 (IOh9TCID5tl)，CPV的最高檢測敏感度為IO^7 (IOl7TCID50), CAV-I的最高檢測敏感度為IO^7 (IOl7TCID50), CAV-II的最高檢測敏感度為IO^(IO2-2TCID50)(圖3所示。)。
權利要求
1.一套用于檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR檢測引物，其特征在于所述引物包括三對引物，其中，所述的用于犬瘟熱病毒檢測的引物序列為SEQID NO :1和SEQ ID NO :2所示；所述的用于犬細小病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4所示；所述的用于I型和II型犬腺病毒檢測的引物序列為SEQ ID NO :5和 SEQ ID NO 6 所示。
2.一種檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的方法，其特征在于包括以下步驟 配制 25 ii LPCR 反應體系IOX Ex Buffer 2. 5 u L, dNTPs 2 u L, Ex Taq DNA 聚合酶0.25 u UCDV-Nl 和 CDV-N2 各 0. 35 y L,CPV-NSI 和 CPV-NS2 各 0. 35 y L、CAV_E31 和 CAV-E32各 0. 65 ii L、CDV 模板 0. 75 u L、CPV 模板 0. 75 u L、CAV_I 模板 0. 75 u L,CAV-II 模板 I. 5 y L、滅菌 ddH20 13. 5 u L ； 其中，引物⑶V-Nl和⑶V-N2用于犬瘟熱病毒的檢測，其序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2所示；引物CPV-NS I和CPV-NS2用于犬細小病毒的檢測，其序列分別為SEQID NO :3和SEQ ID NO :4所示；引物CAV-E31和CAV-E32用于I型和II型犬腺病毒的檢測，其序列分別為SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示； PCR反應程序94°C預變性5min ;94°C變性30S，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ； 觀察取L PCR產物，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。
3.一種用于檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的試劑盒，其特征在于包含權利要求I所述的引物。
4.權利要求I所述的引物在制備檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒單一感染或混合感染試劑中的應用。
5.權利要求2所述的試劑盒在制備檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒單一感染或混合感染試劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一套用于檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR檢測引物，所述引物包括三對引物，其中，用于犬瘟熱病毒檢測的引物序列為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；用于犬細小病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；用于I型和II型犬腺病毒檢測的引物序列為SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示。采用本發(fā)明引物通過多重PCR的方法可以同時檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102618666SQ20121006346
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權日2012年3月12日
發(fā)明者劉大飛, 姜騫, 張洪英, 曲連東, 林歡 申請人:中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所