專利名稱：一株腐殖質(zhì)還原陶厄氏菌及應(yīng)用和微生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物系統(tǒng)分類和環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株腐殖質(zhì)還原陶厄氏菌(TXawera humireducens )新種的分離鑒定,及其在厭氧條件下還原腐殖質(zhì)的應(yīng)用，以及相應(yīng)的微生物制劑。
背景技術(shù)：
隨著化肥的大量使用，過量的N元素累積在土壤和深層污泥中，對生物的正常生長具有毒害作用。在水體中，N的累積也是水體富營養(yǎng)化的一個(gè)重要原因。在土壤和深層污泥中，微生物可利用氨態(tài)氮供能，將N氧化為硝酸鹽或亞硝酸鹽(一般統(tǒng)稱為硝酸鹽)。硝酸鹽或亞硝酸鹽的大量累積，，不僅對作物的生長有毒害作用，而且可能引起亞硝酸鹽在作物，特別是蔬菜中的累積，直接危害人類的食品安全。消除土壤或污泥中累積的硝酸鹽或亞硝酸鹽，具有重要的實(shí)際意義。反硝化作用也稱為脫氮作用。反硝化細(xì)菌在缺氧條件下，利用NO2—和N03_為呼吸作用的電子受體，把硝酸還原成氮(N2),并從中獲得能量供菌體生長。能進(jìn)行反硝化作用的只有少數(shù)細(xì)菌，這個(gè)生理群稱為反硝化菌。大部分反硝化細(xì)菌是異養(yǎng)菌，例如脫氮小球菌、反硝化假單胞菌等，它們以有機(jī)物為碳源和能源，進(jìn)行無氧呼吸。腐殖質(zhì)是富含醌基的、非均相的天然有機(jī)混合物，是土壤有機(jī)質(zhì)的主體，約占土壤有機(jī)碳的60 80%。研究表明，腐殖質(zhì)可在厭氧條件下作為電子受體，為微生物供能來支持微生物的生長，這種微生物代謝類型成為腐殖質(zhì)呼吸，具有腐殖質(zhì)呼吸活性的微生物稱為腐殖質(zhì)還原菌。腐殖質(zhì)呼吸在元素的生物地球化學(xué)循環(huán)、水體自凈、污染土壤原位修復(fù)及污水處理等方面具有積極作用。反硝化作用和腐殖質(zhì)呼吸都是厭氧環(huán)境中普遍存在的微生物呼吸代謝模式，土壤中一般這兩種呼吸作用同時(shí)存在，作用于有機(jī)物的生物降解，當(dāng)環(huán)境中的氧化還原體系不同時(shí)，兩種呼吸代謝途徑在有機(jī)物降解中的貢獻(xiàn)也不盡相同。正是由于兩種呼吸方式的共同作用才提高了有機(jī)物的可利用譜，增加了徹底清除環(huán)境中多種有機(jī)物復(fù)合污染的可能性。
陶厄氏屬細(xì)菌是Betaproteobacteria綱下的一類革蘭氏陰性細(xì)菌。已知的陶厄氏屬細(xì)菌共有9個(gè)種，其中有8個(gè)種的代表菌株已被證明是反硝化菌。對已經(jīng)分離的陶厄氏屬菌株的研究表明，很多菌株都能在反硝化條件下利用苯酚、多酚、鹵代苯甲酸鹽及甲苯等作為碳源，具有廣泛的芳香族化合物降解能力。因此，它被認(rèn)為是一類廣泛存在于各種類型的廢水處理裝置中并具有多種污染物降解能力的重要功能類群。然而，目前為止，尚沒有證明陶厄氏細(xì)菌具有腐殖質(zhì)還原能力的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株具有厭氧反硝化和腐殖質(zhì)還原能力的新菌種陶厄氏|if (Thauera humireducens ) SgZ-I
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述菌株在硝酸鹽還原和腐殖質(zhì)還原中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種腐殖質(zhì)還原和硝酸鹽還原微生物制劑申請人:于2011年10月28日將菌株保藏在位于湖北武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心于2011年12月31日收到申請人提供的菌株陶厄氏菌(Samrahumireducens)Sgl~l0保藏中心給予該培養(yǎng)物的保藏號為CCTCC M2011497，建議的分類命名為Thauera humireducens SgZ-I,已于2012年I月10日鑒定保藏的菌株是存活的。將本發(fā)明的菌株SgZ-I與可接受的輔料混合在一起，即可得到可以進(jìn)行腐殖質(zhì)還原和硝酸鹽還原的微生物制劑。本發(fā)明的菌株陶厄氏菌(TXawera humireducens) SgZ_l,可利用多種底物進(jìn)行硝酸鹽和腐殖質(zhì)的還原，可以有效地去除硝酸鹽積累，還原腐殖質(zhì)，加速有機(jī)污染物的降解，在環(huán)境修復(fù)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明的微生物制劑，可以很好的還原硝酸鹽和腐殖質(zhì)。
圖I :本發(fā)明菌株的3000 X透射電鏡照片；
圖2 :本發(fā)明菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹；
圖3 :本發(fā)明菌株使用不同電子供體還原AQDS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式菌株SgZ-I的富集和分離
I)從污泥微生物燃料電池中撕取陽極碳?xì)纸萦?0 mL液體富集培養(yǎng)基中，液體富集培養(yǎng)基的組成是0· 25 g NH4CUO. 678 g NaH2PO4 · 2H20、O. I g KCl,2. 94 g NaHCO3'1.59 g Na2CO3,10. O mL維生素溶液、10. O mL微量元素溶液，其中，維生素溶液是每升去離子水中含2. O mg生物素、2. O mg葉酸、VB6 10. O mg維生素、5. O mg硫胺素、5. O mg核黃素、5. O mg煙酸、5. O mg泛酸韓、0· I mg維生素B12、5.0 mg對氨基苯甲酸、5. O mg硫辛酸；微量元素溶液是每升去離子水中含I. 5 g氨三乙酸、3. O g MgSO4 ·7Η20、0. 5 g MnSO4 -H2O,l.Og NaCl.O. I g FeSO4 · 7Η20、0· I g CoCl2 · 6Η20、0· I g CaCl2,0. I g ZnSO4 · 7Η20、0· 01g CuSO4 · 5Η20、0· 01 g AlK(SO4)2 · 12Η20、0· 01 g Η3Β03、0· 01 g Na2MoO4 · 2Η20 ;滅菌后添加I g葡萄糖和16 g AQDS分別作為電子供體和電子受體。2)往已接種的富集培養(yǎng)基中充混合氣(N2/C02=80/20)30分鐘，鼓氣完畢蓋橡膠蓋加鋁蓋密封，置于厭氧工作站，30°C靜置培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況；
3)當(dāng)培養(yǎng)液顏色從無色變?yōu)槌赛S色時(shí)，以10%的接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至另一新鮮的液體富集培養(yǎng)基，厭氧操作及厭氧培養(yǎng)條件同2 )，如此富集培養(yǎng)三次；
4)將第四代反應(yīng)后的培養(yǎng)液采用稀釋平板法進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋后的培養(yǎng)液O. I mL均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站，30°C培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進(jìn)行單菌落分離與純化，其中，所述TSA培養(yǎng)基的組成是胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨3.0 g/L, D(+)-葡萄糖 2. 5 g, NaCl 5. O g/L, K2HPO4 2. 5 g,瓊脂粉 20 g/L, pH 調(diào)節(jié)至 7. 2。篩選得到腐殖質(zhì)還原陶厄氏菌(TXawera humireducens) SgZ-I 菌株SgZ-I的形態(tài)特征 O菌體形態(tài)特性菌株SgZ-I為革蘭氏陰性菌；透射電子顯微鏡結(jié)果(圖I)顯示菌株為桿狀，菌體大小為O. 6-0. 8X1. 8-2. 5 Mm，單鞭毛，端生。)菌落形態(tài)特性
有氧、30 1的條件下，將菌株SgZ-I在TSA上培養(yǎng)24 h后，菌落表面光滑不透明，邊緣整齊，菌落直徑約O. 8 I. 2 mm。菌株SgZ-I的生理生化特征
根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定鑒定手冊》第九版所述的標(biāo)準(zhǔn)程序測試菌株的生理生化特征，以及利用API ID32GN、20E、ZYM實(shí)驗(yàn)條檢測其他的理化性質(zhì)，菌株為非發(fā)酵型兼性厭氧菌，結(jié)果見下表權(quán)利要求
1.一種腐殖質(zhì)還原陶厄氏菌SgZ-ι，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC M2011497。
2.權(quán)利要求I所述腐殖質(zhì)還原陶厄氏菌SgZ-I在腐殖質(zhì)還原中的應(yīng)用。
3.一種腐殖質(zhì)還原微生物制劑，其特征在于所述微生物制劑中含有權(quán)利要求I所述的陶厄氏菌SgZ-I。
4.權(quán)利要求I所述腐殖質(zhì)還原陶厄氏菌SgZ-I在硝酸鹽還原中的應(yīng)用。
5.一種硝酸鹽還原微生物制劑，其特征在于所述微生物制劑中含有權(quán)利要求I所述的陶厄氏菌SgZ-I。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株ThauerahumireducensCCTCCM2011497及其在硝酸鹽還原及腐殖質(zhì)還原中的應(yīng)用。本發(fā)明從運(yùn)行良好的污泥微生物燃料電池陽極生物膜中分離純化得到一株Thauerahumireducens菌株SgZ-1，其具有較強(qiáng)厭氧反硝化能力和腐殖質(zhì)還原能力，在土壤原位修復(fù)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N1/20GK102634466SQ201210060240
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者周順桂, 莊莉, 楊貴芹, 韓陸超 申請人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所