專利名稱：一組控制水稻抽穗期的dth2基因及其單倍型和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一組控制水稻抽穗期的DTH2基因及其單倍型和應用。
背景技術：
抽穗期是一個重要的農藝性狀，并且可能在作物的馴化過程中被選擇(Izawa T. Journal of Experimental Botany 58 :3091-3097 (2007)) 栽培稻目前分布在世界范圍內的從北緯53°到南緯40°之間的廣大地區(Chang T. T. Euphytica 25， 425-441 (1976)) ο然而,亞洲栽培稻的祖先普通野生稻，主要分布在南亞,東南亞和澳大利亞北部，其分布的最北限位于北緯28°的東鄉野生稻。水稻馴化的一個重要目的是產生適應各地區種植的水稻品種，從而擴大栽培面積。影響栽培稻向北擴張的主要限制因素就是抽穗期。在高緯度地區(例如亞洲東北部)，早抽穗和對光周期不敏感的特性，保證了水稻能在寒冷天氣來臨之前種子發育成熟。因此，為滿足日益增長的人口對糧食的需求，尋找能擴大栽培稻種植面積的關鍵基因，并克隆相應基因，闡明其遺傳基礎和分子機理，對培育廣適性水稻品種具有重要的理論和實踐意義。水稻品種的抽穗期主要由其感光性、感溫性和基本營養生長性決定(Chang T T, Li C C，Vergara B S. (1969) Euphytica, 18 :79 91 ；Tsai K H. (1985) Rice Genet Newslett, 2 :77 78 ;Tsai K H. (1986)In Rice Genetics. International Rice Research Institute, 339 349)。水稻品種感光性、感溫性和基本營養生長性組合的多樣性，使得抽穗期的遺傳表現異常復雜，經典遺傳學和分子遺傳學都證明抽穗期是由少數質量性狀基因和多個數量性狀基因(QTL Quantitative Trait Locus)控制的。到目前為止，已經有20個水稻抽穗期基因被克隆，其中有6個是通過精細定位圖位克隆的途徑克隆的。如Hdl，Hd6， Hd3a，Ehdl，Ghd7和DTH8(Yano，M. et al. (2000) Plant Cell 12，2473-2483 ;Takahashi，Y.， Shomura,A. ,Sasaki,T. & Yano’M. (2001)Proc Natl Acad Sci USA 98,7922-7927 ；Kojima, S，，Takahashi, Y. & Kobayashi, Y. (2002)Plant Cell Physiol 43，1096-1105 ;Doi，K. et al. (2004)Genes. Dev. 18,926-936 ；Xue, ff. Y. et al. (2007)Nat. Genet. 40，761-767 ；ffei, X.J.et al. (2010)Plant. Physiol. 153,1747-1758)。對于抽穗期基因來說，由于各地光周期的差異，不同地區的人可能會選擇不同類型的光敏感材料以適應當地的光照條件。研究發現Hdl和Ghd7的等位基因的自然變異和水稻的分布區有關，但Hdl和Ghd7的等位變異對于品種抽穗期的改變過于劇烈，對其它基因也有很強的上位作用，因此，在品種抽穗期的改良上很難應用。而微效基因的改變較易適應環境的緩慢變化，更具有適應性，在育種上有重要意義。另外判斷一個基因是否是馴化基因，主要看該基因在野生稻中的等位基因類型對人類是無利的，而經過馴化以后栽培稻中的等位基因類型對人類是有利的。即人類馴化選擇了對人類有利的性狀，但并不是所有的有利性狀都是馴化的。利用源于粳稻品種Asominori和秈稻品種IR24的重組自交系(RILs)群體，我們之前的研究檢測到多個抽穗期 QTL(Wei XJ, et al. (2010)Mol Breeding 25 :287-298)，其
3中我們關注位于第二染色體長臂末端RM318和RM240之間的微效抽穗期QTL (該QTL在本發明中被命名為DTH2)，在自然長日照條件下，包含Asominori等位基因的植株比包含IR24 等位基因的植株提前抽穗。到目前為止，還沒有發現通過QTL克隆的基因屬于在長日照條件下促進開花的類型(Tsuji H, Taoka KI and Shimamoto K (2010) Current Opinion in Plant Biology 14:1-8)。精細定位水稻抽穗期QTL最好的辦法就是構建染色體片段置換系(CSSL)或近等基因系(NIL)，使目標QTL位點之外的絕大部分背景保持一致，使該位點表現為典型的孟德爾遺傳，即數量性狀質量化。但是對于微效QTL來說，在F2群體里，由于雜合型單株和隱性純合型單株的表型差異較小，在構建NIL的基礎上，還需要把F2群體繁衍成F2:3家系群體，使表型易于鑒定。之后把QTL分解為單個基因并進行圖位克隆，即通過分析突變位點與已知分子標記的連鎖關系來確定目的基因在染色體上的物理位置。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的上述不足，提供了一組控制水稻抽穗期的DTH2 基因及其單倍型和應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現一個控制水稻抽穗期基因DTH2，它來自水稻，長度為7867bp，相應編碼CCT/B-box 鋅指蛋白的407個氨基酸，顯性等位基因DTH2-a(DTH2等位基因來自一個日本的粳稻品種 Asominori)全序列為SEQ ID NO. 1，其CDS序列如SEQ ID NO. 2所示，屬于DTH2基因的單倍型 5 (Haplotype5, Hap5)。所述的控制水稻抽穗期基因DTH2在水稻品種改良中的應用。所述的基因DTH2的隱性等位基因DTH2_i (DTH2等位基因來自一個國際水稻所的秈稻品種IR24)，核苷酸全序列如SEQ ID NO. 3所示，其CDS序列如SEQ ID NO. 4所示，屬于 DTH2 基因的單倍型 I (Haplotypel，Hapl)。所述的基因DTH2的隱性等位基因DTH2_i在水稻品種改良中的應用。所述的基因DTH2的單倍型2 (Hap2)，其⑶S序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。所述的基因DTH2的單倍型2在水稻品種改良中的應用。所述的基因DTH2的單倍型3 (Hap3)，其⑶S序列如序列表SEQ ID NO. 6所示。所述的基因DTH2的單倍型3在水稻品種改良中的應用。所述的基因DTH2的單倍型4 (Hap4)，其⑶S序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。所述的基因DTH2的單倍型4在水稻品種改良中的應用。根據圖I的技術路線，本發明為精細定位QTL DTH2，利用以Asominori為背景親本，IR24為供體親本的染色體片段置換系(CSSLs)群體(南京農業大學水稻研究所保存)，鑒定出晚抽穗的攜帶DTH2-i插入片段的家系CSSL18。從CSSL18與Asominori雜交構建的次級F2群體中，再次檢測到DTH2(L0D值24. 70，貢獻率26. 22% )0進一步利用分子標記輔助選擇的方法(MAS)，構建了僅攜帶DTH2的近等基因系一NIL(DTH2)并利用 NIL(DTH2) XAsominori的次級F2、F2l3以及F3:4群體，最終將DTH2限定在標記dCAPS3與 dCAPS5之間約37. 6kb的區間范圍內，共有9個候選基因。序列分析發現第5個基因，編碼 CCT/B-box鋅指蛋白，且與擬南芥C0L9同源，暗示著該基因可能是目的基因。通過構建一個包含該基因的7867bp基因組區段的轉基因組全長互補載體，轉入NIL(DTH2)中，發現T2R轉基因家系抽穗提前。通過Real-time RT PCR發現，DTH2在水稻抽穗期途徑中位于Hd3a 和RFTl的上游。隨后通過對79份栽培稻和48份野生稻的測序，發現在DTH2編碼區存在 5個堿基差異，導致3個氨基酸變化，產生5種單倍型。并證明DTH2在馴化中被選擇，且起源于中國。有益效果I.本發明通過構建近等基因系NIL(DTH2)，并利用NIL(DTH2) XAsominori的次級 f2、f2:3以及f3:4群體，通過圖位克隆的方法，最終克隆了一個擴大栽培稻向北分布區及控制水稻抽穗期的微效基因DTH2，此基因是第一個通過圖位克隆的方法克隆的在長日條件下促進水稻抽穗的基因，為擴大栽培稻向北分布區提供新的基因資源，也為其他作物利用電子克隆法克隆相關基因提供了基因序列，進一步分析發現該基因是一個馴化基因，為水稻的進化研究提供新的思路。2.將DTH2_a導入包含DTH2_i的育種材料中，可以使該材料的抽穗期提前，種植范圍由其原產地向北遷移，擴大栽培稻的向北分布區。3.本發明克隆的基因與馴化相關，其馴化模式可為水稻、玉米和大豆等農作物的光周期反應和分子進化研究提供參照。
圖I.本發明的總體技術流程2. DTH2的精細定位和轉基因全長互補T2代和干擾T2代的結果。A圖是DTH2精細定位圖；B圖表示DTH2的基因結構；C_D圖表示轉基因全長互補 T2代和干擾T2代及兩親本Asominori和NIL(DTH2)的表型(C)和抽穗期數據(D)，P1和P2 分別指全長互補轉基因植株和NIL(DTH2)及干擾植株和Asominori之間的P值，采用威爾科克森符號秩檢驗，P3指兩親本之間的P值，采用雙尾t檢測，η指實驗中檢測的植株數，平均值 ± s. e. nio圖3.本發明中用到的雙元載體PCAMBIA1305. I的載體圖。圖4. DTH2編碼區的自然變異和地理分布分析。圖A是對79個栽培稻和48個野生稻的DTH2編碼區測序的結果，顯示了 5個SNP 和5種單倍型；圖B顯示了 5種單倍型的地理分布；圖C顯示了 5種單倍型的轉基因結果， 平均值土s. e. m, P值采用雙尾t檢測得出；圖D顯示了 5種單倍型在不同亞種之間的分布和它們之間的進化關系。
具體實施例方式實施例I DTH2近等基因系的構建I. DTH2的QTL檢測，回交與選擇利用Asominori和IR24的RILs群體，我們之前的研究檢測到多個控制抽穗期的基因位點，其中的一個位點DTH2,在自然長日照(natural long-day, NLD)條件下,包含 DTH2-a的植株比包含DTH2-i的植株提前抽穗。利用以Asominori為背景親本，IR24為供體親本的CSSLs群體，我們發現CSSL18比背景親本Asominori具有極顯著遲熟且表達穩定，由于CSSL18與背景親本Asominori相比，僅在某些片段上插入了 IR24片段，因此插入的秈稻片段IR24是導致CSSL18具有極顯著遲熟的根本原因。我們將CSSL18與Asominori 雜交一次，連續回交4次，然后自交構建一個包含374個單株的CSSL18/ASominori BC4F2群體，采用IciMapping v2. I軟件，從中再次檢測到DTH2。目標區段確定在兩個SSR(Simple Sequence Repeat)標記RM318和RM240之間(RM系列引物公知公用，見網站www. gramene. org)，遺傳距離9. 6cM(厘摩)。從表I可以看出在這個區間存在一個控制抽穗期的QTL，貢獻率26. 22 %，運用MAS技術，選擇在DTH2區段為純合IR24基因型，而在其他區段為純合 Asominori背景的單株即為NIL(DTH2)。表I.位于RM318和RM240之間控制抽穗期的QTL
QTL標記區間染色體LOD%PVEadDTH2RM318-RM240224.7026.225.03-1.17% PVE :解釋表型變異率；a :加性效應；d :顯性效應。2.微衛星標記基因型鑒定方法(SSR技術)PCR標準程序參見J.薩姆布魯克等，2002,分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社。PCR采用20 μ I反應體系如下DNA模版20-50ng，引物O. 5μΜ， dNTPlOO μ Μ, I Xbuffer (Mg2+ plus)和 IU rTaqDNA 聚合酶(購自日本 Takara 公司)。PCR 擴增條件為=98°預變性3分鐘；94° 30秒，55° 30秒，72° I分鐘，35個循環；72°延伸 7分鐘。PCR產物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上分離后進行銀染(Basam，et al. (1991)Anal. Biochem. 196 :80-83)。實施例2 DTH2的精細定位與圖位克隆I.兩親本的抽穗期表型鑒定抽穗期指單株的第一個穗子抽出的日期；抽穗期天數指單株自播種到第一個穗子抽出的天數；極端晚抽穗單株指抽穗期與親本NIL(DTH2)相同或更晚的單株；極端晚抽穗家系指一個隨機家系中大部分單株抽穗都相同或晚于親本NIL(DTH2)的家系。在北京NLD 條件下(中國農業科學院作物科學研究所東門網室)，NIL(DTH2)比Asominori晚抽穗7. 4 天(表I,圖2C)。而在海南自然短日照(natural short-day,NSD)條件下(海南陵水南京農業大學南繁基地)，兩親本抽穗沒有顯著差異。經過光照培養箱嚴格的長日照(LD，14小時光照/10小時黑暗)與短日照(SD，10小時光照/14小時黑暗)處理，結果分別與在NLD 和NSD條件下的一致(表2)。表2. Asominori和NIL(DTH2)在不同光照條件下的抽穗期表現
權利要求
1.一個控制水稻抽穗期基因DTH2，它來自水稻，長度為7867bp，相應編碼CCT/B-box 鋅指蛋白的407個氨基酸，顯性等位基因DTH2-a全序列為SEQ ID NO. 1，其⑶S序列如SEQ ID NO. 2 所示。
2.權利要求I所述的控制水稻抽穗期基因DTH2在水稻品種改良中的應用。
3.權利要求I所述的基因DTH2的隱性等位基因DTH2-i，核苷酸序列如SEQID NO. 3 所示，其CDS序列如SEQ ID NO. 4所示。
4.權利要求3所述的基因DTH2的隱性等位基因DTH2-i在水稻品種改良中的應用。
5.權利要求I所述的基因DTH2的單倍型2，其⑶S序列如序列表SEQID NO. 5所示。
6.權利要求5所述的所述的基因DTH2的單倍型2在水稻品種改良中的應用。
7.權利要求I所述的基因DTH2單倍型3，其⑶S序列如序列表SEQID NO. 6所示。
8.權利要求7所述的所述的基因DTH2的單倍型3在水稻品種改良中的應用。
9.權利要求I所述的基因DTH2的單倍型4，其⑶S序列如序列表SEQID NO. 7所示。
10.權利要求9所述的所述的基因DTH2的單倍型4在水稻品種改良中的應用。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域，涉及一組控制水稻抽穗期的DTH2基因及其單倍型和應用。該基因編碼一個CCT/B-box鋅指蛋白，屬于CONSTANS-Like轉錄因子基因家族，顯性等位基因序列如SEQ ID NO.1所示，只在長日照條件下促進開花。隱性等位基因的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。通過轉基因實驗證明了該基因具有使水稻抽穗期提前的功能。通過對79份栽培稻和48份野生稻的測序，發現在DTH2編碼區存在5個堿基差異，導致3個氨基酸變化，產生五種單倍型。并證明該基因在馴化中被選擇，且起源于中國。
文檔編號C12N15/29GK102586277SQ201210054659
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者萬建民, 吳瑋勛, 江玲, 鄭曉明, 鐘錚錚, 陸廣文 申請人:南京農業大學