專利名稱：水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8、重組表達載體和制備方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，特別涉及水稻葉綠體硫氧還蛋白基因還涉及該基因的重組表達載體和制備方法。
背景技術：
硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)廣泛地存在于生物界中，是一種低分子量 (12KD)、有還原雙硫鍵活力的蛋白質。硫氧還蛋白都含有高度保守的活性位點，其保守的活性位點為Trp-Cys-Gly-Pro-Cys,保守活性位點中存在兩個還原性的Cys殘基。在還原態， 硫氧還蛋白具有促使目標蛋白中_■硫鍵打開的作用。植物體中的硫氧還蛋白最初是在葉綠體中發現的，被認為是光合作用中一些關鍵酶的活化調節蛋白，后來在細胞質和線粒體中也發現了硫氧還蛋白，它們在結構和功能上都有所差異。并且植物中包含很多硫氧還蛋白異構體，并將這些異構體分為不同的亞型，如h型、f■型、m型、c型等。其中，h型硫氧還蛋白被NADPH和NADPH-硫氧還蛋白還原酶所還原；f型和m型為葉綠體硫氧還蛋白，被鐵氧還蛋白依賴的系統所還原。葉綠體硫氧還蛋白主要調節光依賴酶，在光照條件下，硫氧還蛋白催化目標蛋白二硫鍵的打開并激活目標蛋白；在黑暗條件下，硫氧還蛋白處于氧化態不具有活性。經研究發現，水稻基因組中至少含有30個編碼硫氧還蛋白的基因，按其在染色體上的順序統一命名為OsTrxf 30，分為5個亞群分別為m型，h型，x型，f型和pdil型。 有報道稱水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrX23，是一種冷脅迫誘導的蛋白，在體外對絲裂原活化蛋白激酶3 (0sMPK3)和絲裂原活化蛋白激酶6 (0sMPK6)具有負調控。水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrx29是一種m型葉綠體硫氧還蛋白，利用RNAi抑制0sTrx29基因表達后，導致葉綠體發育異常，植株生長延遲。水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrx8屬于m型硫氧還蛋白，但其相關功能迄今為止尚未見報道。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的核苷酸序列；目的之二在于提供所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達載體，目的之三在于提供水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的重組表達載體的制備方法，為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS在水稻中的功能研究提供了有力的工具。I、水稻葉綠體硫氧還蛋白基因( Ti-xS,所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8 的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。2、含有所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達載體。進一步，所述重組表達載體為重組干擾表達載體flsT^^-RNAi，所述干擾重組表達載體是在pENTR/D-TOPO載體的克隆位點中插入水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8, U IOVO-OsTrxS載體，再將所得TOPO-GsT^rS載體與pANDA載體同源重組而得。3、所述重組表達載體的制備方法，具體步驟如下從水稻中克隆水稻葉綠體硫氧CN 102533810 A
還蛋白基因0sTrx8并連接pENTR/D-T0P0載體，得TOPO-GsT^rS載體，將所得TOPO-GsT^rS 載體與pANDA載體進行同源重組，得重組干擾表達載體ttsT^^-RNAi。本發明的有益效果在于本發明提供了一個水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS, 為研究水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的功能奠定了基礎，還構建了含有水稻葉綠體硫氧還蛋白基因的重組表達載體，并且該載體為干擾重組表達載體，在植物細胞中能夠干擾水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的表達，因此可以通過水稻葉綠體硫氧還蛋白基因功能缺失觀察水稻表型的變化，從而得到水稻葉綠體硫氧還蛋白基因
基因在水稻中的功能；還公開了水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達載體的制備方法，其制備方法簡單，為研究0sTrx8基因在水稻中的功能提供了有力的工具。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中
圖I為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8電泳圖2為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的時空差異表達圖。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優選實施例中使用的材料使用的水稻品種為水稻日本晴(Oryza Sativa L)由重慶市農業科學研究院提供；M-MLV逆轉錄酶、高保真DNA聚合酶pfu、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、PMD19-T載體、Trizol試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、入-Hind III DNA Marker 及 DL2 000 DNA Marker 購自 TaKaRa 公司；DNA Marker III購自天根生化科技(北京)有限公司；氨節青霉素(Ampici 11 in, Amp)和卡拉霉素 (Kanamycin, Kan)為Sigma公司產品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術有限公司完成；pENTR D-T0P0 克隆試劑盒(貨號為K2400_20)購自Invitrogen公司；其它化學試劑購自北京鼎國生物技術有限責任公司；大腸桿菌JM109、農桿菌GV3101由本實驗室保存。實施例I、水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的克隆
以水稻日本晴(fl Sativa L)為材料，取葉片少許，迅速放入液氮中研磨成粉末，按照 Trizol試劑盒說明書提取總RNA。所得水稻葉片總RNA的電泳結果顯示主帶清晰完整，28S 和18S的條帶亮度比約為2:1，說明RNA的濃度和純度符合實驗要求，可以用于合成雙鏈 cDNA。以所得水稻葉片總RNA為模板，按照M-MLV逆轉錄酶說明書，使用Oligo (dT)引物進行逆轉錄獲得第一鏈cDNA。在水稻基因組注釋項目(http://rice.plantbiology.msu.edu/ca/gene_ fams/5_8. shtml)數據庫中進行假定功能搜索,搜索到43個與硫氧還蛋白相關的基因，選擇座位為L0C_0s09g07570的基因，其描述為編碼具有催化能力的鐵硫氧還蛋白酶基因， 經預測表明為葉綠體前體。我們把它命名為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS。根據Genbank中登陸的序列,利用Primer 5. 0和Oligo 6. 0軟件設計水稻葉綠體硫氧還蛋白基因 fefnS 特異引物，上游引物 0sTrx8Y :5’ -caccatggcggccttcacctcc-3’ (SEQ ID No. 2), 下劃線部分為接頭序列；下游引物 flsrnSR :5’- caacctccaaagcactctcaatct-3’(SEQ ID No. 3)。以逆轉錄獲得的第一鏈cDNA為模板，采用水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS特異引物OsTrxS 和OsTrxl并用高保真DNA聚合酶pfu進行PCR擴增，PCR反應條件為 94°C預變性4分鐘；然后94°C變性30秒，60°C復性30秒，72°C延伸2分鐘，共32個循環； 最后72°C延伸10分鐘。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳顯示在500-600bp處有單一的特異性條帶，即水稻葉綠體硫氧還蛋白基因，結果如圖I所示。檢測后，按 DNA凝膠回收試劑盒說明書進行切膠回收純化；純化的DNA片段與pMD19-T載體在T4 DNA 連接酶作用下于16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，酶切鑒定片段大小后測序，得重組載體PMD19T-OsTrxS,菌液送上海英駿生物技術有限公司，測序驗證片段準確性。測序結果顯示，獲得的水稻硫氧還蛋白基因0sTrx8為含有507個核苷酸，編碼169個氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID No. I 所示。實施例2、水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的時空差異表達
分別取幼苗期根、幼苗期莖、幼苗期葉、分蘗期根、分蘗期莖、分蘗期葉和開花期穗為材料，分別按照上述總RNA提取方法提取不同時期不同部位的總RNA，得幼苗期根RNA、幼苗期莖RNA、幼苗期葉RNA、分蘗期根RNA、分蘗期莖RNA、分蘗期葉RNA和開花期穗RNA。分別以提取的總RNA為模，按照M-MLV逆轉錄酶說明書，使用Oligo (dT)引物進行逆轉錄獲得第一鏈 cDNA，所得第一鏈cDNA用于進行半定量RT-PCR分析水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrx8基因的時空差異表達。以水稻肌動蛋白actin為內參，上游引物為5’-aggaaggctggaagaggacc_3’ (SEQ ID No. 4),下游引物為 5，-cgggaattgtgagggacat-3，(SEQ ID No. 5),分別取等量的第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為94°C預變性2分鐘，94°C變性35秒，58°C 退火I分鐘，72°C延伸2分鐘，反應25個循環，再72°C后延伸7分鐘。取5 y L PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶亮度調整模板濃度，至各樣本在等量模板條件相同擴增所得 actin的PCR產物量一致，此時的模板用于水稻硫氧還蛋白基因OsTrxS的時空差異達分析。 以調整模板濃度后的第一鏈cDNA為模板，上游引物如SEQ ID No. 2所示，下游引物如SEQ ID No. 3所示，PCR程序如下94°C預變性2分鐘，94°C變性45秒，59°C退火45秒，72°C延伸I分鐘，反應40個循環，最后72°C后延伸7分鐘，4°C保存。PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，如圖2所示。由圖2可知，actin擴增結果顯示初始模板的拷貝數基本保持一致，水稻硫氧還蛋白基因OsTrxS擴增結果顯示水稻硫氧還蛋白基因OsTrxS主要在幼苗期葉和分蘗期葉中表達，在幼苗期根、幼苗期莖、分蘗期根、分蘗期莖和開花期穗組織基本不表達，這就表明0sTrx8基因在葉綠體功能上的發揮作用。實施例3、0sTrx8基因重組干擾載體的構建
利用實施例I中PCR擴增所得水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8與pENTR/D-T0P0 載體連接，得重組載體，命名為TOPO-Gs將所得重組載體TOPO-GsT^rS轉化大腸桿菌 DH5 a感受態細胞，挑取陽性克隆，經液體培養基培養后提取質粒，即TOPO-GsT^rS質粒，用分光光度計測定OD■和OD■的吸光值，計算重組質粒TOPO-的拷貝數。取10 nglQ Q-0sTrx8 質粒加入 10 y L Gateway 系統的 pANDA 載體，TOPO-fe質粒與 pANDA 載體利用同源重組原理獲得重組表達載體，命名為&財i，獲得的重組表達載體為干擾重組表達載體。隨后將重組干擾載體0sTrx8-RNAi采用凍融法轉化根癌農桿菌GV3103感受態細胞，得含重組干擾載體0sTrx8-RNAi的農桿菌GV3103，命名為GV3103_tts， 然后于-80 °C保存備用。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。
權利要求
1.水稻葉綠體硫氧還蛋白基因( 其特征在于所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因 OsTrxS的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.含有權利要求I所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達載體。
3.根據權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為重組干擾表達載體AsT^rS-RNAi，所述重組干擾表達載體是在pENTR/D_T0P0載體的多克隆位點中插入水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8，得TOPO-GsT^rS載體，再將所得TOPO-GsT^rS載體與 pANDA載體同源重組而得。
4.權利要求2或3所述重組表達載體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下從水稻中克隆水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8并連接pENTR/D-T0P0載體，得TOPO-GsT^rS載體，將所得TOPO-Gs載體與pANDA載體進行同源重組，得重組表達載體ttsT^rS-RNAi。
全文摘要
本發明公開了水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，還公開了水稻葉綠體硫氧還蛋白OsTrx8基因的重組表達載體及其重組表達載體的制備方法，其制備方法簡單，為研究水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8在水稻中的功能提供了有力的工具。
文檔編號C12N15/66GK102533810SQ20121004946
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者康振輝, 張筱娟, 王貴學, 黃俊麗 申請人:重慶大學