專利名稱：病原真菌致病性新基因pcg16及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種病原真菌致病性新基因PCG16及其用途。
背景技術：
稻痕菌(Magnaporthe oryzae)是子囊菌亞門的真菌,能侵染水稻、小麥、大麥、粟以及其它多種禾本科植物，導致瘟病。一般情況下，稻瘟病的危害可使水稻減產5-10%，重病田可導致水稻絕收。稻瘟病是我國水稻的主要病害之一，也是世界性的水稻病害。稻瘟菌以分生孢子作為侵染寄主植物的初侵染源和再侵染源。稻瘟菌的一部分菌絲在生長過程中分化為分生孢子梗。分生孢子梗頂端細胞膨大形成第一個分生孢子，此后， 頂端的極性向一邊偏移進而依次產生另外的分生孢子。稻瘟菌的分生孢子呈梨形，由三個細胞組成。一般5至9個分生孢子以合軸的方式從一個分生孢子梗的頂端產生。分生孢子釋放后，在分生孢子梗上留下屈膝狀的疤痕。釋放后的分生孢子吸附到葉片上，經過萌發形成附著胞，成熟的附著胞內產生與累積膨脹壓；然后，附著胞下產生侵染釘直接穿透植物表皮，并在植物細胞內形成侵染性菌絲；最后侵染性菌絲在植物細胞內和細胞間擴展、定植。 稻瘟菌侵染感病寄主時，侵染性菌絲在植物組織內擴展形成直徑2-3毫米以上的灰色或灰褐色病斑，這些病斑中的侵染菌絲穿透植物組織向空中分化形成分生孢子梗，進一步形成分生孢子。分生孢子在風、雨的沖刷下釋放、附著，重新引起植物的再侵染。稻瘟菌從分生孢子附著到分生孢子再產生的周期一般所需時間為3-5天；在植物的生長季節，如果條件適宜，能夠多次侵染，造成危害。綜上所述，分生孢子的形成是稻瘟菌侵染植物所必需的過程，稻瘟病的嚴重度與稻瘟菌分生孢子的產生量呈正相關。如果能阻斷稻瘟菌的分生孢子形成，就可以控制稻瘟病的發生。
發明內容
本發明的目的是提供病原真菌致病性蛋白Pcgl6及其編碼基因PCG16的新用途。 所述蛋白Pcgl6為序列表序列3所不的蛋白質,其編碼基因PCG16為序列表序列I中第1991 位至第2530位所示的核苷酸序列。本發明所提供的新用途之一是序列表序列3所示的蛋白質可用于調控稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)分生孢子的產生,或調節序列表序列3所示的蛋白質表達量的物質用于調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子的產生。實驗證明，病原真菌致病性蛋白Pcgl6的表達量降低時，稻瘟菌 (Magnaportheoryzae)分生孢子的產生量減少。基于該實驗,本發明提供了一種調控稻痕菌 (Magnaporthe oryzae)分生孢子產生的方法。所述調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生的方法,包括調控所述稻痕菌中序列表序列3所示蛋白質的表達水平，或調控所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質編碼基因的轉錄水平的步驟。所述調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生的方法具體可為降低稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生的方法,包括降低所述稻痕菌中序列表序列3所示蛋白質的表達水平，或降低所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質編碼基因的轉錄水平的步驟。進一步的實驗證明，稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子的產生量減少,所述稻痕菌對寄主植物的致病力減弱。基于該實驗，本發明提供一種降低稻痕菌(Magnaporthe oryzae)對植物致病力的方法。該方法包括抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的編碼基因表達的步驟。本領域技術人員可根據實際需要，通過篩選或鑒定調控所述蛋白質表達量的物質來實現稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生量的調控,最終控制植物稻痕菌病害的發生和危害。下述以稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示的蛋白質或其編碼基因為靶點篩選或鑒定植物稻瘟菌殺菌劑的方法均屬于本發明的保護范圍本發明提供的篩選植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)殺菌劑的方法,包括以所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白質為靶點對待檢測物質進行篩選，將得到的抑制序列表序列3所示蛋白質表達的待檢測物質作為候選的植物稻瘟菌殺菌劑的步驟。本發明提供的篩選植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)殺菌劑的方法,包括以所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白質的編碼基因為靶點對待檢測物質進行篩選，將得到的抑制序列表序列3所示蛋白質編碼基因轉錄的待檢測物質作為候選的植物稻瘟菌殺菌劑的步驟。本發明提供的鑒定或輔助鑒定植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)候選殺菌劑的方法，包括如下步驟檢測待測物質能否抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的表達，如所述待測物質能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白質表達，則所述待測物質為候選的所述植物稻瘟菌殺菌劑；如所述待測物質不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3 所示的蛋白質表達，則所述待測物質為非候選的所述植物稻瘟菌殺菌劑。本發明提供的鑒定或輔助鑒定植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)候選殺菌劑的方法，包括如下步驟檢測待測物質能否抑制稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的編碼基因的轉錄，如所述待測物質能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的編碼基因的轉錄，則所述待測物質為候選的所述植物稻瘟菌殺菌劑；如所述待測物質不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的編碼基因的轉錄，則所述待測物質為非候選的所述植物稻瘟菌殺菌劑。下述以物質在制備植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)殺菌劑中的應用均屬于本發明的保護范圍本發明保護具有如下I) -4)中至少一種功能的物質在制備植物稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)殺菌劑中的應用I)抑制序列表序列3所示氨基酸序列組成的蛋白質的表達；2)抑制將序列表序列3所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加、且具有調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生功能的蛋白質的表達；3)抑制序列表序列3所示氨基酸序列組成的蛋白質的編碼基因的轉錄；
4)抑制將序列表序列3所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加、且具有調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生功能的蛋白質的編碼基因的轉錄。本發明還保護具有如下5)-8)中至少一種功能的物質在制備植物稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)殺菌劑中的應用5)降低序列表序列3所示氨基酸序列組成的蛋白質的表達水平；6)降低將序列表序列3所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加、且具有調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生功能的蛋白質的表達水平；7)降低序列表序列3所示氨基酸序列組成的蛋白質的編碼基因的轉錄水平；8)降低將序列表序列3所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加、且具有調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生功能的蛋白質的編碼基因的轉錄水平。本發明還保護具有如下功能的物質在制備植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)殺菌劑中的應用使序列表序列3所示氨基酸序列組成的蛋白質失活或使將序列表序列3所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加、且具有調控稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)分生孢子產生功能的蛋白質失活。本發明提供一種敲除載體和重組稻瘟菌，所述敲除載體為敲除稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白質編碼基因的重組載體；所述敲除載體具體可按照包括如下步驟的方法得到將序列表序列I的第867位至第1864位核苷酸片段連接到質粒pKNH的BamHI和 EcoRI位點間，并將序列表序列I的第2595位至第3469位核苷酸片段連接到質粒pKNH的 HindIII和KpnI位點間，得到的重組載體即為所述敲除載體；所述重組稻痕菌為將稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白質編碼基因敲除得到的重組菌，所述重組稻瘟菌具體可通過包括如下步驟的方法得到將所述敲除載體導入所述稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中，敲除所述稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所不蛋白質的編碼基因。本發明保護所述敲除載體在敲除稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3 所示蛋白質編碼基因中的應用。本發明提供一種DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列是序列表序列I中的第I 位至第1990位所示的核苷酸序列。本發明保護所述DNA分子在作為啟動子中的應用。實驗證明，蛋白Pcgl6的編碼基因PCG16被潮霉素磷酸轉移酶基因(hph)置換后得到的敲除體X3產生分生孢子極少，且在菌絲塊接種劃傷的水稻葉片上不能形成病斑，而 PCG16基因的互補體W6與野生型稻痕菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131的分生孢子產生量相同，且在菌絲塊接種劃傷的水稻葉片上均能形成病斑。更進一步地說，基因PCG16的缺失即蛋白Pcgl6不表達,可導致稻痕菌(Magnaporthe oryzae)的分生孢子產生量減少,對水稻的侵染能力喪失。本發明所提供的方法和應用在植物稻瘟菌病害的控制方面具有重要意義。
圖I為野生型稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131及其突變體CD8069的菌落。其中，左圖為野生型稻瘟菌菌株P131的菌落，右圖為突變體CD8069的菌落。圖2為突變體⑶8069中的T-DNA在PCG16啟動子區域的插入位置示意圖。其中， 黑色矩形代表外顯子，L和R分別代表T-DNA的左邊緣和右邊緣，Bg和H分別代表BglI和 Hindlll，各位置以PCG16的轉錄起始位點為基準，T-DNA片段大小為5kb。圖3為突變體⑶8069的Southern雜交圖。其中，從左至右的泳道依次為HindIII 酶切野生型稻瘟菌菌株P131的基因組、HindIII酶切突變體⑶8069的基因組、BglI酶切野生型稻瘟菌菌株P131的基因組和BglI酶切突變體⑶8069的基因組；第2泳道有雜交信號的條帶大小為9. Okb，第4泳道有雜交信號的條帶大小為7. Okb。圖4為敲除載體pZ2的構建示意圖。其中，C、B、E、H、K分別代表限制性內切酶 ClaI、BamHI、EcoRI、Hindi 11、KpnI，hph代表潮霉素磷酸轉移酶基因，上方為野生型稻瘟菌菌株P131的基因組片段，下方為敲除載體pZ2的基因片段。圖5為PCG16基因敲除體X3的Southern雜交驗證。其中，左側泳道為ClaI酶切的野生型菌株P131的基因組，右側泳道為ClaI酶切的敲除體X3的基因組，左側雜交帶大小為3，664bp，右側雜交帶大小為7，173bp。圖6為PCG16基因的敲除體X3和互補體W6的RT-PCR驗證。其中，P131為野生型，X3為PCG16的敲除體，W6為PCG16敲除體X3的互補體，Actin為對照。圖7為野生型稻瘟菌菌株P131、敲除體X3和互補體W6的菌落生長外觀。圖8為野生型稻瘟菌菌株P131、敲除體X3和互補體W6的菌落直徑大小。圖9為野生型稻瘟菌菌株P131、敲除體X3和互補體W6的菌絲及分生孢子產生量。 其中，A為野生型稻瘟菌菌株P131、敲除體X3和互補體W6的分生孢子梗以及分生孢子產生情況，標尺為50微米；B為野生型稻瘟菌菌株P131、敲除體X3和互補體W6的分生孢子產生量。圖10為野生型稻瘟菌菌株P131、敲除體X3和互補體W6對水稻侵染能力的比較。圖11為PCG16的表達情況。其中，左列DIC為相差視野下明視場下拍攝，右列GFP 為熒光視野下暗視場藍光下拍攝，標尺長度為20微米;A為含有PCG16-GFP融合載體的互補體W6的分生孢子，B為含有PCG16-GFP融合載體的互補體W6的附著胞。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所使用的野生型稻痕菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131、pKNH、 pKNTG和水稻(Oryzae sativa)小種麗江新團黑谷(Lijiangxintuanheigu)與如下文獻中所使用的相同，公眾可從中國農業大學獲得Jun Yang et al. A Novel ProteinComl Is Required for Normal Conidium Morphology and Full Virulence inMagnaporthe oryzae. Mol Plant Microbe Interact. 2010Jan ；23(1) :112-23.實施例I、稻瘟菌PCG16基因的克隆
一、突變體的篩選與鑒定I、分生孢子的制備使用涂菌產孢的方法制備分生孢子，具體方法如下將野生型稻痕菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131的各根癌農桿菌介導(ATMT) 的轉化體的菌絲充分打斷，均勻地涂布到西紅柿汁燕麥片培養基平板上，26°C -28°C培養， 當肉眼可見新生菌絲長出培養基表面時，用棉簽輕輕將菌絲洗下，并用水沖洗干凈，蓋上單層紗布，于26°C _28°C光照培養48小時后，在培養基表面即可見大量的稻瘟菌孢子。西紅柿汁燕麥片培養基的配制取150ml西紅柿汁、30_50克燕麥片煮沸30分鐘過濾后的濾液和20克瓊脂,用水定容至I升。2、分生孢子產孢量相關突變體的篩選將各ATMT轉化體通過步驟I的方法制備得到的分生孢子用30ml水洗、收集，利用血球記數板在顯微鏡下測定其分生孢子數；并以野生型稻瘟菌菌株P131為對照，篩選產孢量有顯著差異的菌，結果獲得一個產孢量顯著降低的突變體CD8069。取野生型菌株P131和突變體⑶8069各6皿進行產孢量測定，結果發現突變體 CD8069的產孢量顯著降低，只有野生型菌株的7% (見表I)，其菌落生長速度較野生型菌株P131也有了明顯的下降，為P131的87% (圖1)，圖I為各菌株在西紅柿汁燕麥片培養基平板上活化后，采用打孔器分別挖取大小一致的菌絲塊，繼續轉移到西紅柿汁燕麥片培養基板上，28°C培養120小時后照相。表I.突變體與野生型菌分生孢子產量的區別
權利要求
1.序列表序列3所示的蛋白質在調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生中的應用。
2.調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生的方法,包括調控所述稻痕菌中序列表序列3所示蛋白質的表達水平，或調控所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質編碼基因的轉錄水平的步驟。
3.降低稻痕菌(Magnaporthe oryzae)對植物致病力的方法,包括抑制所述稻痕菌中序列表序列3所不蛋白質的編碼基因表達的步驟。
4.一種篩選植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)殺菌劑的方法,包括以所述稻痕菌中序列表序列3所示的蛋白質為靶點對待檢測物質進行篩選，將得到的抑制序列表序列3所示蛋白質表達的待檢測物質作為候選的植物稻瘟菌殺菌劑的步驟；或，包括以所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的編碼基因為靶點對待檢測物質進行篩選，將得到的抑制序列表序列3所示蛋白質編碼基因轉錄的待檢測物質作為候選的植物稻瘟菌殺菌劑的步驟。
5.一種鑒定或輔助鑒定植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)候選殺菌劑的方法,包括如下步驟檢測待測物質能否抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的表達，如所述待測物質能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的表達，則所述待測物質為候選的所述植物稻瘟菌殺菌劑；如所述待測物質不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的表達，則所述待測物質為非候選的所述植物稻瘟菌殺菌劑；或，檢測待測物質能否抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的編碼基因的轉錄，如所述待測物質能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的編碼基因的轉錄，則所述待測物質為候選的所述植物稻瘟菌殺菌劑；如所述待測物質不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白質的編碼基因的轉錄，則所述待測物質為非候選的所述植物稻瘟菌殺菌劑。
6.具有如下1)-4)中至少一種功能的物質在制備植物稻痕菌(Magnaportheoryzae)殺菌劑中的應用.1)抑制序列表序列3所示氨基酸序列組成的蛋白質的表達；.2)抑制將序列表序列3所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/ 或添加、且具有調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生功能的蛋白質的表達；.3)抑制序列表序列3所不氣基酸序列組成的蛋白質的編碼基因的轉錄；.4)抑制將序列表序列3所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加、且具有調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生功能的蛋白質的編碼基因的轉錄。
7.具有如下5)-8)中至少一種功能的物質在制備植物稻痕菌(Magnaportheoryzae)殺菌劑中的應用.5)降低序列表序列3所示氨基酸序列組成的蛋白質的表達水平；.6)降低將序列表序列3所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加、且具有調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生功能的蛋白質的表達水平；.7)降低序列表序列3所示氨基酸序列組成的蛋白質的編碼基因的轉錄水平；8)降低將序列表序列3所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加且、具有調控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生功能的蛋白質的編碼基因的轉錄水平。
8.具有如下功能的物質在制備植物稻痕菌(Magnaportheoryzae)殺菌劑中的應用 使序列表序列3所示氨基酸序列組成的蛋白質失活或使將序列表序列3所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加、且具有調控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子產生功能的蛋白質失活。
9.敲除載體、重組稻痕菌或應用，所述敲除載體為敲除稻痕菌(Magnaportheoryzae) 中序列表序列3所示蛋白質編碼基因的重組載體；所述重組稻瘟菌為將稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白質編碼基因敲除得到的重組菌；所述應用為所述敲除載體在敲除稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白質編碼基因中的應用。
10.DNA分子或應用，所述DNA分子的核苷酸序列是序列表序列I中的第I位至第1990 位的核苷酸序列；所述應用為所述DNA分子在作為啟動子中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種病原真菌致病性新基因PCG16及其用途。該基因PCG16表達的蛋白質如序列表序列3所示，該蛋白可用于調控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子的產生。實驗證明，蛋白Pcg16的編碼基因PCG16被潮霉素磷酸轉移酶基因(hph)置換后得到的敲除體X3產生分生孢子極少，且在菌絲塊接種劃傷的水稻葉片上不能形成病斑，而PCG16基因的互補體W6與野生型稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131的分生孢子產生量相同，且在菌絲塊接種劃傷的水稻葉片上均能形成病斑。更進一步地說，基因PCG16的缺失即蛋白Pcg16不表達，可導致稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)的分生孢子產生量減少，對水稻的侵染能力喪失。本發明所提供的方法和應用在植物稻瘟菌病害的控制方面具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102586168SQ201210048248
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日
發明者左玉山, 張燕, 彭友良, 楊俊 , 王大偉, 趙文生 申請人:中國農業大學