專利名稱：白血病診療的基因芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子醫學領域，特別涉及用于白血病診療的基因芯片。
背景技術：
白血病的發病率逐年上升，已成為危害青少年健康的頭號殺手，對兒童白血病的治療目標已不再是簡單的追求緩解率，而要通過完善的實驗室檢查結果和預后評估體系，根據危險因素對患兒進行分組，使每個患兒都能得到適當強度的個體化治療，提高其遠期生活質量。近20年來，以形態學、免疫學、細胞遺傳學、分子生物學(MICM)和危險因素為基礎進行分型的規范化治療及中樞神經系統白血病的預防已成為兒童白血病治療成功的關鍵。盡量降低低危患兒化療不良反應和遠期并發癥，同時對高危患 兒實施適度或強有力的化療方案，對病人進行明確的亞型分類將有助于制定合適的治療方案并預測其治療效果，判斷預后。準確評估腫瘤的細胞基因學和早期化療反應是確保高危因素患兒不會錯誤地進入低危方案的關鍵。研究者們發現，即使是同一類型、同一治療方案、甚至是同一劑量強度的治療，不同的白血病患ノL會表現出不同的療效和藥物毒副反應。如果所有的兒童白血病患者都能進行免疫學、染色體及基因學方面的檢查，使所有患兒都能得到嚴格規范的診斷，危險度都能得到準確的評價，從而使患兒得到適度的規范化化療，將大大提高長期存活率，降低化療遠期不良反應及治療費用。因此，對白血病患兒的早期準確診斷、危險因素與預后評估對其實施個體化治療尤為重要。另ー方面，越來越突出的問題在于不同患者對同一化療的反應性不一，究其根本原因，是因為患者體內存在不同基因及基因的多態性，因此，對每個患兒的個體化治療需要對其治療反應相關的基因進行確定。但由于目前對患者分型、判斷預后等所使用的細胞形態檢測、流式細胞術、巢式RT-PCR、常規染色體顯帶技術等方法繁多，所需的實驗條件和對技術人員培訓的要求高，檢測費用昂貴，限制了 MICM分型與診斷在基層醫院的大規模開展，使得我國基層醫院住院的大部分白血病患兒仍然限于進行形態學檢測為主，不能完全而準確地對患兒進行早期診斷、危險評估和個體化治療，總體控制水平較低。因此，迫切需要ー種結果準確、簡單快速、費用較低、適宜于大規模推廣的實驗室檢測方法來將眾多白血病診斷方法統一與替代。
發明內容
本發明的目的在于提供ー種基因芯片，該基因芯片僅集合了少量的寡核苷酸探針就實現了多指標，其準確性高。上述芯片主要分為基因表達類檢測單元、基因多態性(SNP)檢測單元和染色體拷貝數(CNV)檢測單元，其中基因表達類檢測單元包含融合基因寡核苷酸探針18種和表達基因寡核苷酸探針48種；SNP單元包含基因SNP 47種探針；CNV檢測單元包含24種探針。本試劑盒基因表達類檢測單元的融合基因寡核苷酸探針能特異性檢測融合基因為白血病診斷、分型、臨床治療和預后判斷提供重要依據，同時也是白血病微小殘留病的檢測基礎，檢測對象包括包括 BCR/ABL a2b3、BCR/ABL a2el、BCR/ABL a2b2、TEL/ABL、TEL/PDGFR, E2A/PBX1、ETV6-RUNX1、TEL-AMLU CBFP -MYHlI、MLL-AFX, MLL-AFlp, MLL-AFlO,MLL-AF4、MLL-AF9、AML-ETO, PML/RARa、NPM/RAR 和 SET/CAN 中的任一中或多種。本試劑盒基因表達類檢測單元的表達基因寡核苷酸探針能特異性檢測MDR1、MRPl、LRP、GST- π、NPMl、c_myb、HOXlI、EVII、FLT3、H0XA9、H0XA10, GATAl、GATA2、MYC,Notch I、CEBPA、CD19、CD79a、CD3、CD7、CD2、CD5、CD8、CDla、CD4、CD20、CD23、CD64、CD34、CD13、CD33、CD38、CD56、CD117、CD41、CD61、GPA、T-I、T-II、T-III、T-IV、MP0、Ta / β ,Ty/δ、IgH、TCR δ , TCR y或IgG中的任ー種或多種；本試劑盒的基因多態性(SNP)檢測單元中，含有突變或缺失基因的寡核苷酸探針，能特異性的檢測以下基因Nras、P53、BRAF, SHIP、NPMU JAK2、FLT3、MGMT, Kras、WTUCDKN2A、RBI、TET2、PTEN、TPMT, MTHFR、CYP, TERT, MDRl。
本試劑盒的染色體拷貝數(CNV)檢測單元中，能檢測染色體拷貝數的變化，能檢測全部染色體的拷貝數改變。為實現上述目的，本發明的技術方案為I、基因芯片，所述基因芯片含有如SEQ ID NO :1-18中任一項或多項所示的融合基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :19-66中任一項或多項所示的表達基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :67-72中任一項或多項所示的Nras突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQID NO :73-78任一項或多項所示的P53突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :79所示的Braf突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQID NO 80所示的SHIP突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO 81所示的NPMl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO ，82-83中任一項或多項所示的JAK2突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :84-85任ー項或多項所示的MGMT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :,86-88中任一項或多項所示的FLT3突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :89-92中任一項或多項所示的Kras突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO 93-95中任一項或多項所示的WTl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID N0:96所示的⑶KN2A96突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO ，97-99中任一項或多項所示的RBl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :100所示的TET2突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :101所示的PTEN突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO =102-103中任一項或多項所示的TPMT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :104所示的MHTFR突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO =105-109中任一項或多項所示的CYP突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO =110-112中任ー項或多項所示的TERT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :113所示的MKRl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO =114-137所示的染色體CNV探針。2、根據I所述的基因芯片，所述基因芯片含有如SEQ ID NO : 1_18所示的融合基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :19-66所示的表達基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO :67-72所示的Nras突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :73-78所示的P53突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO 79所示的Braf突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQID NO :80所示的SHIP突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :81所示的NPMl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO:，82-83所示的JAK2突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :84-85所示的MGMT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO:，86-88所示的FLT3突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO ,89-92所示的Kras突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :，93-95所示的WTl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO:，96所示的⑶KN2A96突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :,97-99所示的RBl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :100所示的TET2突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO :101所示的PTEN突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO : 102-103所示的TPMT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :104所示的MHTFR突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQID NO :105-109所示的CYP突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :110-112所示的TERT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :113所示的MKRl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO =114-137所示的染色體CNV探針。本發明的目的之ニ在于提供上述基因芯片的運用，該運用能為白血病患者提供全面的診療。
為實現上述目的，本發明的技術方案為3、1所述的基因芯片在制備白血病診療試劑盒中的運用。4、進一歩，，所述基因芯片在制備白血病免疫學細胞表面分子標志診療試劑盒中的運用；5、進ー步，所述基因芯片在制備白血病遺傳學標志診療試劑盒中的運用；6、進ー步，所述基因芯片在制備白血病化療藥物代謝診療試劑盒中的運用；7、進ー步，所述基因芯片在制備殘留白血病診療試劑盒中的運用；8、進ー步，所述基因芯片在制備腫瘤耐藥多分子標志診療試劑盒中的運用。本發明的有益效果在于本芯片解決了我國血液系統腫瘤診療過程中的實際需求，通過篩選白血病免疫學、細胞遺傳學和分子生物學檢測指標中的關鍵指標來定制的基因芯片，其集合白血病的早期診斷、預警、預防、診治的多功能基因芯片，提高白血病個體化的診斷率和療效，縮短住院時間，降低醫療費用，提高基層醫療衛生機構技術水平。
具體實施例方式下面將結合具體實施例，進ー步闡述發明。應當理解的是，這些實施例僅用于說明本發明而不限于本發明的范圍。下述實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I基因芯片的制備一、探針設計與合成本上述芯片主要分為基因表達類檢測單元和基因多態性(SNP)檢測單元，其中基因表達類檢測單元包含融合基因寡核苷酸探針18種和表達基因寡核苷酸探針48種；SNP單元包含基因SNP 47種探針。本試劑盒基因表達類檢測單元的融合基因寡核苷酸探針能特異性檢測融合基因為白血病診斷、分型、臨床治療和預后判斷提供重要依據，同時也是白血病微小殘留病的檢測基礎，檢測對象包括包括 BCR/ABL a2b3、BCR/ABL a2el、BCR/ABLa 2b2、TEL/ABL、TEL/PDGFR、E2A/PBX1、ETV6-RUNX1、TEL-AMLU CBF^ -MYHlU MLL-AFX, MLL-AFIp, MLL-AFl0,MLL-AF4、MLL-AF9、AML-ETO、PML/RARa、NPM/RAR 和 SET/CAN 中的任一中或多種。本試劑盒基因表達類檢測單元的表達基因寡核苷酸探針能特異性檢測MDR1、MRPl、LRP、GST- π、NPMl、c_myb、HOXlI、EVII、FLT3、H0XA9、H0XA10, GATAl、GATA2、MYC,Notch I、CEBPA、CD19、CD79a、CD3、CD7、CD2、CD5、CD8、CDla、CD4、CD20、CD23、CD64、CD34、CD13、CD33、CD38、CD56、CD117、CD41、CD61、GPA、T-I、T-II、T-III、T-IV、MP0、Ta / β ,Ty/δ、IgH、TCR δ , TCR y或IgG中的任ー種或多種；本試劑盒的基因多態性(SNP)檢測單元中，含有突變或缺失基因的寡核苷酸探針，能特異性的檢測以下基因Nras、P53、BRAF, SHIP、NPMU JAK2、FLT3、MGMT, Kras、WTUCDKN2A、RBI、TET2、PTEN、TPMT, MTHFR、CYP, TERT, MDRl。本試劑盒的染色體拷貝數(CNV)檢測單元中，能檢測染色體拷貝數的變化，能檢測全部染色體的拷貝數改變。在Genebank里找到上述如SEQ IN. NO :1_1 37所示的基因序列，利用軟件進行探針設計，標記，合成，驗證合格后，溶解，稀釋，備用。ニ、芯片點陣方法將所有基因的寡核苷酸探針用探針緩沖液稀釋至ΙΟΟμπιοΙ/L，置384孔板中點樣，以序列的互補鏈作為陽性對照探針，以同等濃度無關探針(與靶序列無同源性的魚的寡核苷酸序列)作為陰性對照，用PixSys5500自動芯片制作機(Catesian Technologies,Inc，美國)在相対濕度為62 %的條件下將DNA樣品探針點樣在25mm X 75mm硅化玻片表面，樣品點之間的距離為250nm，所有探針排列成ー個16行7列的矩陣，每個基因有3個基因陣列重復。在60°C水浴箱中對DNA芯片進行重新水合化20s，在80°C加溫板上干燥5s，在65mJ 下用紫外交聯儀 Stratalinkerl 800 (Stratagene, LaJolla,美國)對 DNA 探針進行紫外交聯固定。之后進行封閉處理，封閉液的組成為4. 28g琥珀酸酐溶于239. 3mLト乙基-2-吡咯烷酮中，隨后加入10. 7mL硼酸鈉(pH8. O)。將載有DNA微陣列的玻片浸入95°C熱水中對DNA進行2min變性處理，在95%的酒精溶液中浸洗5次，室溫下空氣干燥，在室溫及黑暗條件下儲存備用。實施例2芯片性能檢測一、基因芯片雜交為測定特異性的雜交實驗進行2次重復，而其他芯片雜交實驗進行3次重復。15μ1的標準雜交液含有3Χ檸檬酸鈉緩沖溶液(SSC)，lyg未標記的青魚卵DNA (Promega，Madison，USA)、0· 3%十二烷基硫酸鈉(SDS)以及目的PCR產物5 μ I。用于測試靈敏度和檢測目的基因的雜交液體積為2 μ I，其所含成分的濃度同前。雜交液直接加在固定好的DNA陣列所在的準確位置，然后再蓋上蓋玻片。熒光素標記的DNA用雜交液稀釋后在100°C下變性2min，冷卻至環境溫度，先加到蓋玻片上，然后以DNA陣列面朝下放到蓋玻片上。將芯片翻轉后置放到防水的雜交盒，在雜交盒兩端的水孔中各加入15 μ I 3X SSC以保持濕度，將雜交盒加蓋密封后放人水浴箱進行雜交處理。雜交在45 V或者65 °C下進行12 15h。雜交后芯片分別在室溫下1XSSC+0. 2% SDS和0. 1XSSC+0. 2% SDS洗滌液中洗滌5min，在0. IXSSC中洗滌30s。接著將芯片置于黑暗中，在空氣中干燥。ニ、芯片掃描和雜交信號的定量分析雜交芯片用激光共聚焦芯片掃描儀系統(ScanArray⑩5000)進行掃描，首先在分辨率50 μ m下進行初步掃描以得到ー個快速顯示的圖像，然后對目標圖像在分辨率為5 μ m下進行精確掃描。激發光源為綠色HeNe或HeNe激光(分別用熒光素Cy3或cy5)，熒光素所發射的熒光由光電倍增管在570nm(Cy3)或670nm(Cy5)進行探測。對于靈敏度實驗和樣品的檢測激光強度和光電倍增率均為100%。對于其他芯片雜交實驗激光強度均為95%，光電倍增率均為90%。掃描獲得的圖像被儲存為16位TIFF文件，然后用計算機軟件ImaGene 3. O版對每ー個雜交點的光素密度(或強度)進行定量分析。一個用來定義陣列中每ー個DNA斑點圓圈的方格疊加在圖像上，用以確定每ー個需要定量的熒光斑點。分析獲得每一斑點的平均信號強度，數據文件輸出到Excel軟件和專用軟件進ー步分析。局部背景信號被自動地從每ー単獨的斑點雜交信號中減去。每ー個雜交信號的最后定量值中減去5個陰性対照的平均熒光強度值。用計算機軟件SPSS進行統計分析。
實施例3芯片的應用本基因芯片同其他含基因寡核苷酸探針的基因芯片的檢測流程相同。對188例白血病，其中35例急性髓細胞白血病(AML)、153例急性淋巴細胞白血病(ALL)患者標本進行檢測，提取樣本總RNA，接著將RNA反轉錄為cDNA，利用本芯片檢測結果
分析，詳見下表。
白血病芯片預實驗檢測結果與探針序列 基因分類—^基因名稱AML(35例)丨—~ALL(153例)jHf序列
融合基因卩日tt例 1 卩日14例!數！
—BCR/ABL _~_8__6__
——BCR/ABL a2b34SEQ ID.NO:l
——BCR/ABL a2el2 2SEQ ID.NO:2
——BCR/ABL a2b22 4SEQ ID.NO:3
TEL/ABL_ 4____SEQ iD.NO:4
TEL/PDGFR—SEO ID.NO:5
E2A/PBX116SEO ID.NO:6
ETV6-RUNX18SEO ID.NO:7
TEL-AMLl11SEQ ID.NO:8
CBFg-MYHll3SEQ ID.NO:9
MLL-AFX7SEQ ID.NOrlO
MLL-AFId4SEQ ID.NO:ll
MLL-AFlO3SEQ ID.NO:12
MLL-AF46SEQ ID.NO:13 :
MLL-AF94SEQ ID.NO]4 ~
. AML-ETO4SEQ ID.NO:15 —
PML/RARa9SEQ ID.NO:16
NPM/RAR3SEQ ID.NO:17
SET/CANI ISEQ ID.NO:18 —
表達基因 f_I_[_[_
權利要求
1.基因芯片，其特征在于所述基因芯片含有如SEQID NO :1-18中任一項或多項所示的融合基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :19-66中任一項或多項所示的表達基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO 67-72中任一項或多項所示的Nras突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :73-78任一項或多項所示的P53突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO 79所示的Braf突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQID NO 80所示的SHIP突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :81所示的NPMl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO:82-83中任一項或多項所示的JAK2突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO :84-85任ー項或多項所示的MGMT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :86-88中任一項或多項所示的FLT3突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :89-92中任一項或多項所示的Kras突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO 93-95中任一項或多項所示的WTl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO ，96所示的⑶KN2A96突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO :97-99中任一項或多項所示的RBl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :100所示的TET2突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO :101所示的PTEN突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO =102-103中任一項或多項所示的TPMT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :104所示的MHTFR突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO : 105-109中任一項或多項所示的CYP突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO =110-112中任ー項或多項所示的TERT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :113所示的MKRl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :114-137所示的染色體CNV探針。
2.根據權利要求I所述的基因芯片，其特征在于所述基因芯片含有如SEQID NO:1-18所示的融合基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :19-66所示的表達基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :67-72所示的Nras突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO 73-78所示的P53突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :79所示的Braf突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO 80所示的SHIP突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO 81所示的NPMl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :82-83所示的JAK2突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :84-85所示的MGMT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ IDNO 86-88所示的FLT3突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :89-92所示的Kras突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO ，93-95所示的WTl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQID NO ,96所示的CDKN2A96突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :97-99所示的RBl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :100所示的TET2突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :101所示的PTEN突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO : 102-103所示的TPMT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :104所示的MHTFR突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :105-109所示的CYP突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO =110-112所示的TERT突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :113所示的MKRl突變基因寡核苷酸探針，含有如SEQ ID NO :114-137所示的染色體CNV探針。
3.權利要求I所述的基因芯片在制備白血病診療試劑盒中的運用。
4.根據權利要求3所述的運用，其特征在于所述基因芯片在制備白血病免疫學細胞表面分子標志診療試劑盒中的運用。
5.根據權利要求3所述的運用，其特征在于所述基因芯片在制備白血病遺傳學標志診療試劑盒中的運用。
6.根據權利要求3所述的運用，其特征在于所述基因芯片在制備白血病化療藥物代謝診療試劑盒中的運用。
7.根據權利要求3所述的運用，其特征在于所述基因芯片在制備殘留白血病診療試劑盒中的運用。
8.根據權利要求3所述的運用，其特征在于所述基因芯片在制備腫瘤耐藥多分子標志診療試劑盒中的運用。
全文摘要
本發明涉及分子醫學領域，特別涉及用于白血病診療的基因芯片，所述芯片含有如SEQ ID NO1-137中所述序列的寡核苷酸探針，本芯片解決了我國血液系統腫瘤診療過程中的實際需求，通過篩選白血病形態學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學檢測指標中的關鍵指標來定制基因芯片，是集合白血病的早期診斷、預警、預防、診治的多功能基因芯片，可以提高白血病個體化的診斷效率和療效，縮短住院時間，降低醫療費用，提高基層醫療衛生機構技術水平。
文檔編號C12Q1/68GK102676648SQ20121004761
公開日2012年9月19日 申請日期2012年2月29日 優先權日2011年3月7日
發明者張鵬輝, 譚俊杰, 鄒琳 申請人:重慶醫科大學附屬兒童醫院