專利名稱：水稻散穗基因pac1調控序列及分子標記應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種培育散穗水稻的方法，特別涉及一種基于新發現的水稻散穗性狀基因調控序列的培育散穗水稻的方法。
背景技術：
水稻是重要的糧食作物，我國雜交水稻在生產上的成功應用大幅度提高了水稻產量，為我國和世界糧食生產的安全做出了巨大貢獻。然而，雜交水稻的制種成本，尤其是雜交種的產量較低的現狀，是進一步提高水稻雜種優勢經濟效益的限制因子之一。野生稻中雖然有高產、抗病等基因，但是不利基因的含量也較高，難于直接利用。目前已從野生稻中定位到高產、抗病、抗蟲、耐旱、耐冷等有利于水稻品種改良的基因。同時篩選出攜帶控制株型等基因、表型優良的野生稻滲入系材料，拓寬了水稻種質資源。水稻株型影響產量，最好的先例是著名的半矮桿基因sd-Ι在生產上的利用解決了水稻倒伏難題，從而使水稻單產大幅度提高。穗型是理想株型的重要內容，理想的穗型能顯著提高水稻產量。野生稻(0.rufipogon Griff.)馴化為栽培稻(0.sativa L.)的過程中，許多形態和生理性狀發生深刻的改變。其中，生殖方式由野生稻的異花授粉轉變成栽培稻的自花授粉，這一轉變是由于水稻穗形態和穎花結構的改變引起的。栽培稻與其祖先野生稻相比，穗型由松散變緊湊，花藥變小，柱頭外露率降低。這些性狀降低了花粉散發以及柱頭接收花粉的能力，從而降低了異花授粉的幾率。然而，這些有利于異花授粉的性狀可以用來改良恢復系和不育系，從而提高雜交水稻的制種產量。而且，從野生稻中分離這些基因后，可以采用回交與分子標記輔助選擇的方式，直接進行應用，避開了轉基因的安全風險，因此控制這些性狀的相關基因的遺傳及分子機理研究一直是水稻遺傳育種的熱點。相關基因的克隆具有重要的應用價值和經濟效益。分子標記(Molecular Markers)廣義是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質；狹義是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記一形態學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有的優越性有:大多數分子標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學技術的發展，現在DNA分子標記技術已有數十種，廣泛應用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。目前為止， 尚未有控制野生稻散穗表型性狀的基因克隆的報道，更沒有相關分子標記基因的報道。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種培育散穗水稻的方法。本發明所提供的培育散穗水稻的方法包括如下步驟:將含有6bp調控序列且穗型松散的水稻作為供體親本，和不含有所述6bp調控序列的穗型緊湊的水稻作為受體親本進行雜交，得到含有所述6bp調控序列且穗型松散的水稻。所述6bp調控序列為位于GenBank號為NC_008397.2的水稻基因組的第33874675-33874680位的CATATC序列。所述GenBank號為NC_008397.2的水稻基因組的序列為2010年6月8日公開的序列。實際應用中，作為供體親本的所述含有6bp調控序列且穗型松散的水稻常為野生稻；作為受體親本的所述不含有所述6bp調控序列的穗型緊湊的水稻通常為具有優良性狀的栽培稻。在實際操作中，所述培育散穗水稻的方法還包括將所述雜交水稻與作為雜交親本的所述不含有所述6bp調控序列 的穗型緊湊的水稻進行回交，得到回交子代的步驟。回交的目的是為了增大具有優良性狀的受體親本基因在散穗子代中的比例，其理想狀態為散穗子代能夠保留受體親本自身的所有優良性狀。實際應用中，所述培育散穗水稻的方法還包括將上述回交子代自交的步驟。自交是為了在具備受體親本優良性狀的基礎上，進一步得到散穗純合水稻，從而保證散穗這一性狀在自交后代中能夠穩定遺傳。在本發明的一個實施例中，所述含有6bp調控序列且穗型松散的水稻具體為野生稻品種云南元江(散穗)；所述不含有所述6bp調控序列的穗型緊湊的水稻具體為栽培稻品種特青(緊穗)。具體為，將云南元江普通野生稻為供體親本，栽培稻品種特青作為受體親本，雜交并連續回交兩次，得到具有散穗性狀的散穗滲入系YIL31。本發明的另一個目的是提供一種與水稻穗型性狀相關的分子標記。所述分子標記的序列為CATATC，位于GenBank號為NC_008397.2的水稻基因組(2010 年 6 月 8 日公開)的第 33874675_33874680 位。所述的分子標記在調控水稻穗型中的應用也屬于本發明的保護范圍。所述的分子標記在培育散穗水稻中的應用也屬于本發明的保護范圍。實驗證明，本發明所提供的方法，將含有6bp調控序列，且穗型松散的水稻(如野生稻品種云南元江)，和不含有所述6bp調控序列的穗型緊湊的水稻(如栽培稻品種特青)作為親本，進行雜交并連續回交兩次，得到了含有所述6bp調控序列，且穗型松散的水稻(如YIL31)。本發明所提供的方法不需轉基因，因而安全實用。
圖1為獲得穗型松散的優良性狀水稻的實驗流程圖。圖2為以云南元江野生稻為供體，栽培稻特青為受體構建散穗滲入系，進而構建分離群體中各水稻表型。其中，A為三種水稻的稻穗的表型，I為云南元江野生稻的稻穗表型(散穗)，2為栽培稻特青的稻穗的表型(緊穗)；3為野生稻散穗滲入系YIL31的稻穗表型(散穗)』為散穗滲入系HL31與栽培稻特青回交各水稻表型，I為散穗滲入系YIL31 (散穗)，2為散穗滲入系YIL31與栽培稻特青回交所得雜交稻表型(散穗)，3為栽培稻特青表型(緊穗)。C為散穗滲入系YIL31的基因型圖示。
圖3為PACl基因的精細定位圖。其中，A為利用滲入系群體的初步定位結果；B為利用2400個隱性單株對PACl基因進行的定位，目標基因PACl被定位在分子標記76.8和SP33之間大約26kb區間內；C為利用14000個F2單株進一步進行定位的結果，最終將PACl基因的突變位點定位到分子標記86.5和89.6之間1.5kb的區間內；D為1.5kb區間內YIL31與特青的基因組序列間的差異，即6bp調控序列的插入。圖4為實時定量PCR檢測穗發育及抽穗時PACl基因在散穗滲入系YIL31和特青中的表達量結果。其中，I表示抽穗前10天的檢測結果；2表示抽穗當天的檢測結果；3表示抽隨后10天的檢測結果。圖5為V1、V2、V3片段及BAC克隆在日本晴基因組(NC_008397.2)物理圖中的位置。其中，倒三角所對應33874675表示6bp調控序列(CATATC)的第一位對應于日本晴基因組(NC_008397.2)的第33874675位；V3片段中含有PACl基因。圖6為Ttl代轉入PACl基因及調控序列的水稻品種中花17 (pCAMBIAl300-BAC/中花17)植株表型(散穗)。圖7為Ttl代轉入pCAMBIA1300空載體的轉基因水稻中花17 (pCAMBIAl300/中花17)的植株表型(緊穗)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。野生稻品種云南元江普通野生稻(Tan Lubin, Zhang Peijiang, Liu Fengxia,Wang Guijuan, Ye Sheng, Zhu Zuofeng, Fu Yongcai，Cai Hongwei，and Sun Chuanqing*.Quantitative trait loci underlying domestication and yield-related traits inOryza rufipogonXOryza sativa advanced backcross population.Genome,2008, 51(I):692-704)栽培稻品種特青(TanLubin, Zhang Peijiang，Liu Fengxia，Wang Guijuan，Ye Sheng，Zhu Zuofeng，Fu Yongcai, Cai Hongwei, and Sun Chuanqing^.Quantitativetrait loci underlying domestication and yield-related traits in OryzarufipogonXOryza sativa advanced backcross population.Genome，2008，51(I):692-704)兀江普通野生稻BAC(YJ0510607) (Li Xianran, Tan Lubin, Huang Haiyan, ZhuZuofeng, Li Chenji，Hu Songnian，Sun Chuanqing^.Construction of a bacterialartificial chromosome (BAC) library of common wild rice (Oryza rufipogon Griff.)for map-based cloning of genes selected during the domestication of rice.Biotechnol Lett.2008，30 (3):555_561)。所述 BAC(YJ0510607)為含有 PACl 基因和 6bp調控序列的環形克隆。植物表達載體pCAMBIA1300 (Tan Lubin，Xianran Li, Liu Fengxia, Sun Xianyou，Li Chenggang，Zhu Zuofeng, Fu Yongcai, Cai Hongwei, Wang Xiangkun，Xie Daoxin，SunChuanqing氺.Control of a key transition from prostrate to erect growth in ricedomestication.Nature Genetics，2008，40(11):1360_1364)
栽培稻中花17 (緊穗)(Tan Lubin, Xianran Li, Liu Fengxia, Sun Xianyou, LiChenggang, Zhu Zuofeng, Fu Yongcai, Cai Hongwei, Wang Xiangkun, Xie Daoxin, SunChuanqing*.Control of a key transition from prostrate to erect growth in ricedomestication.Nature Genetics,2008,40(11):1360_1364)實施例1、優良散穗水稻的獲得本實施例以野生稻品種云南元江為供體親本，栽培稻品種特青為受體親本通過雜交、回交、自交獲得了具有6bp調控序列，且穗型松散的優良性狀水稻，其實驗流程如下(流程圖如圖1所不):1、以野生稻品種云南元江(含有6bp調控序列，且穗型松散的顯性純合體，穗型性狀基因型記作AA)為供體親本，優良栽培稻品種特青(不含有6bp調控序列，穗型緊湊的隱性純合體，穗型性狀基因型記作aa)為受體親本進行雜交，得到F1子代。F1子代穗型松散(Aa)。2、用F1子代(Aa)與受體親本特青(aa)回交，得到BC1F1子代。穗型出現性狀分離比(Aa: aa=l:1)，50%具有散穗性狀，另外50%具有緊穗性狀。3、用具有散穗性狀的BC1F1子代(Aa)與受體親本特青(aa)回交，得到BC2F1子代。BC2F1子代同樣出現性狀分離比(Aa: aa = I: I)，50%具有散穗性狀，另外50%具有緊穗性狀。4、用有散穗性狀的BC2F1子代(Aa)與受體親本特青(aa)，得到BC3F1子代。BC3Fi子代同樣出現性狀分離比(Aa: aa = I: I)，50%具有散穗性狀(如圖2B中2所示)，另外50 %具有緊穗性狀。5、用具有散穗性狀的BC3F1子代(Aa)自交，得到BC3F2子代。BC3F2子代(AA: Aa: aa = I: 2: I)中約75%為散穗(AA: Aa = I: 2)。從中篩選得到散穗滲入系YIL31。以下為利用上述散穗滲入系YIL31對散穗基因進行定位，進而發現6bp調控序列的方法:利用上述散穗滲入系YIL31與特青回交得到F1, F1自交得到F2，利用該分離群體將散穗基因定位到1500bp的物理區間內，上述1500bp區間內的散穗滲入系YIL31和栽培稻品種特青基因組進行測序，并進行序列比對。結果發現，與散穗滲入系YIL31相比，栽培稻品種特青中存在一個6bp的缺失(圖3中D)，同時對云南元江野生稻相應區間進行測序結果顯示云南元件野生稻中含有此6bp，然而已有的野生稻和栽培稻基因組序列均沒有注釋基因，而位于所述6bp缺失下游約13kb的地方有個與穗發育有關的轉錄因子基因，將其命名為PACl。利用實時定量PCR檢測穗發育及抽穗時PACl基因在YIL31和特青的表達，結果發現該基因在穗一次枝梗基部的表達差異明顯，散穗滲入系YIL31中的表達量約是栽培稻的3倍(圖4)，因此該基因(PACl)是控制散穗的候選基因，而上游的6bp缺失是調控序列，調控序列的改變引起基因的差異表達，從而造成野生稻和栽培稻穗型的轉變。PACl基因的編碼序列為序列表中序列I所示。序列I所示基因編碼得到序列表中序列2所示蛋白，即PacI蛋白；6bp調控序列為GATATC，對應于2010年6月8日公開的GenBank號為NC_008397.2 的水稻基因組的第 33874675-33874680 位。實施例2、 PACl基因及調控序列轉基因水稻的獲得
—、重組表達載體的構建(I)重組表達載體pCAMBIAl300-V1的構建用HindIII和Sac I雙酶切元江普通野生稻BAC (YJ0510607)，獲得大小約為14kb的片段，將其命名為Vl (圖5，含有6bp調控序列，但不含有PacI基因);將Vl與經同樣雙酶切得到的植物表達載體PCAMBIA1300的骨架片段(大片段)相連，得到重組質粒，對其進行酶切和測序鑒定，證實含有上述Vl的陽性重組質粒命名為pCAMBIAl300-V1。(2)重組表達載體pCAMBIAl300-V2的構建用Sal I單酶切元江普通野生稻BAC(YJ0510607)，獲得大小約為12kb (11620bp，)的片段，將其命名為V2(圖5，含有6bp調控序列，但不含有Pacl基因);將V2與經同樣酶切得到的植物表達載體PCAMBIA1300的骨架片段相連，得到重組質粒，對其進行酶切和測序鑒定，證實含有上述V2，且插入方向正確的陽性重組質粒命名為pCAMBIAl300-V2。(3)重組表達載體 pCAMBIAl300-V3的構建用SalI酶切元江普通野生稻BAC(YJ0510607)，獲得大小約為6kb的片段，將其命名為V3(圖5，含有PACl基因，但不含有6bp調控序列)；將乂3與經同樣酶切得到的植物表達載體pCAMBIA13003的骨架片段相連，得到重組質粒，對其進行酶切和測序鑒定，證實含有上述V3且插入方向正確的陽性重組質粒命名為pCAMBIAl300-V3。二、PacI及調控序列轉基因水稻的獲得將上述步驟一獲得的3種重組表達載體(pCAMBIAl300-V1、pCAMBIAl300-V2和PCAMBIA1300-V3)以及將元江普通野生稻BAC (YJ0510607)(同時含有PACl基因和6bp調控序列)與pCAMBIA1300空載體(提供潮霉素抗性)DNA按5: I比例混合所得的混合載體，分別通過基因槍法轉化到栽培稻中花17 (緊穗)中。轉基因植株在含有潮霉素的培養基上萌發，篩選到的抗性苗再通過分子生物學實驗方法鑒定確認。具體操作步驟如下:利用基因槍轉化，轉化受體為粳稻(0.sativa ssp.japonica)品種“中花17”。采用Bio-Rad公司生產的roS-1000/He基因搶。1、微粒子彈制備(I)稱取60mg金粉(Ψ = Ι.Ομπι)加入1.5ml滅菌的離心管中，加入Iml無水乙醇，振蕩lmin, IOOOrpm離心IOs,棄上清,重復洗一次后,將金粉懸浮于Iml無菌水中現用或-20°C保存；(2)吸取 50 μ I 金粉懸浮液，20 μ I 0.1M 亞精胺，50 μ I 2.5MCaCl2，2.5 μ g DNA,振蕩5min, IOOOOrpm離心20s,棄上清，以無水乙醇漂洗兩次，加入60 μ I無水乙醇,懸浮。2、轟擊受體材料(I)基因槍放于一較大型號的超凈工作臺上，以利于無菌操作，用70%酒精擦凈真空室，并用浸泡消毒法將可裂圓片，微粒子彈載體，阻擋網于70%酒精中消毒I 2h，然后用無菌濾紙吸干或吹凈酒精殘余；(2)打開電源開關，真空泵及氦氣瓶閥；(3)將可裂圓片裝入固定、旋緊；(4)取6 μ I包被DNA的金屬顆粒無水乙醇懸浮液均勻涂布于微彈載體中心，在工作臺上吹干；(5)將載有微彈的載體及阻擋網裝入微彈發射裝置；
(6)培養皿放在托盤上，使愈傷集中于培養皿中央；(7)打開氣瓶，調節壓力IlOOPsi ；(8)抽真空，當真空度(VAC)達到需要值時，將VAC鍵轉到Hold位置；(9)轟擊按放氣鍵使真空表讀數回零，取出樣品，每皿轟擊I 2次。3、抗性愈傷的篩選及植株再生打槍后先將愈傷組織在不含篩選劑的培養基中恢復生長一周，再轉入含50mg/L潮霉素的繼代培養基中篩選30d左右，挑取抗性突起，再在含50mg/L潮霉素的繼代培養基中篩選30d左右，在預分化培養基(50mg/L潮霉素)光照培養20d左右，在分化培養基中(50mg/L潮霉素)中分化，最后在含50mg/L潮霉素的壯苗培養基中(三角瓶)繼續篩選30d左右，再轉到含壯苗培養基的試管中培養30 40d，然后移栽到土壤。轉基因水稻中花17陽性植株的鑒定:從上述表現出潮霉素抗性的Ttl代轉基因水稻中花17的新鮮葉片中提取微量總DNA。采用PCR擴增潮霉素抗性基因(HYG)片段，檢測陽性轉基因植株。潮霉素抗性基因(HYG)檢測引物為:HYG_F:5/ -TACTTCTACACAGCCATC-3'HYG_R:5/ -CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3'(退火溫度 54O )。 將轉入重組表達載體pCAMBIAl300-V1的Ttl代陽性水稻中花17植株命名為pCAMBIAl300-V1/中花17 ;轉入重組表達載體pCAMBIA1300_V2的Ttl代陽性水稻中花17植株命名為PCAMBIA1300-V2/中花17 ;轉入重組表達載體pCAMBIA1300_V3的Ttl代陽性水稻中花17植株命名為pCAMBIA1300-V3/中花17 ;轉入BAC的Ttl代陽性水稻中花17植株命名為pCAMBIAl300-BAC/中花17 ;轉pCAMBIA1300空載體的轉基因水稻中花17命名為pCAMBIAl300/ 中花 17。鑒定陽性的Ttl代BAC轉基因水稻中花17 (pCAMBIAl300-BAC/中花17)的穗型如圖6所示，為很明顯的散穗表型；而轉入重組表達載體PCAMBIA1300-V1的轉基因水稻中花17 (pCAMBIAl 300-V1/中花17)、轉入重組表達載體pCAMBIA1300_V2的轉基因水稻中花17 (pCAMBIAl300-V2/中花17)、轉入重組表達載體pCAMBIA1300_V3的轉基因水稻中花17 (pCAMBIAl300-V3/中花17)、轉入pCAMBIAl300空載體的轉基因水稻中花17 (pCAMBIAl300/中花17)，與未轉基因的中花17穗型一致，為很明顯的緊穗表型(圖7)。這表明，單獨轉入含有6bp調控序列或PACl基因的片段均不能改變水稻植株的穗型，但同時轉入含有6bp調控序列和 PACl基因的BAC能夠改變水稻植株的穗型，使水稻中花17的穗型由緊湊變松散。
權利要求
1.培育散穗水稻的方法，包括如下步驟:將含有6bp調控序列且穗型松散的水稻，和不含有所述6bp調控序列的穗型緊湊的水稻進行雜交，得到含有所述6bp調控序列且穗型松散的雜交水稻； 所述6bp調控序列為GenBank號為NC_008397.2的水稻基因組的第33874675-33874680 位的 CATATC 序列。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法還包括將所述雜交水稻與作為雜交親本的所述不含有所述6bp調控序列的穗型緊湊的水稻進行回交，得到回交子代的步驟。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述方法還包括將所述回交子代自交的步驟。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述含有6bp調控序列且穗型松散的水稻為野生稻品種云南元江。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述不含有所述6bp調控序列的穗型緊湊的水稻為栽培稻品種特青。
6.與水稻穗型性狀相關的分子標記，其特征在于:所述分子標記的序列為CATATC。
7.權利要求6所述的分子標記在調控水稻穗型中的應用。
8.權利要求6所述的分子標記在 培育散穗水稻中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種培育散穗水稻的方法。本發明所提供的方法包括如下步驟將含有6bp調控序列且穗型松散的水稻，和不含有所述6bp調控序列的穗型緊湊的水稻進行雜交，得到含有所述6bp調控序列且穗型松散的雜交水稻；所述6bp調控序列為位于GenBank號為NC_008397.2的水稻基因組的第33874675-33874680位的CATATC序列。利用本發明所提供的方法得到具有散穗性狀的水稻新品種，不涉及轉基因，因而安全實用。
文檔編號C12N15/11GK103210832SQ20121004664
公開日2013年7月24日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者朱作峰, 孫傳清, 付永彩, 李顯然, 譚祿賓, 劉鳳霞 申請人:中國農業大學