專利名稱：一種微生物轉化黃體酮制備睪酮的工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物、醫藥技術領域，涉及一種青霉屬分枝青霉組菌株發酵轉化黃體酮制備睪酮的工藝。特別提供一株人工馴化的青霉屬分枝青霉組(Penicillium ramigena,YNCA0361，菌株保藏編號為CGMCC No. 4824)菌株，以及用該菌株在發酵罐中發酵轉化黃體酮制備睪酮的工藝。
背景技術：
睪酮(17a-羥基雄留-4-烯-3-酮)又稱睪丸素、睪丸酮或睪留酮，是一種雄性激素藥物，它對健康及有著重要的影響，具有促進男性性器官的形成、發育、成熟，并對抗雌激素，抑制子宮內膜生長及卵巢垂體功能。促進蛋白質合成代謝、興奮骨髓造血功能，刺激血細胞的生成。臨床用于男性性腺機能減退癥、無睪癥及隱睪征；婦科疾病，如月經過多、子宮 肌瘤、子宮內膜異位癥、老年骨質疏松及小兒再生障礙性貧血。還可用其作為制備丙酸酯和苯甲酸酯衍生物的中間體。國內外對睪酮及其衍生物應用已有大量研究，其應用范圍日益擴大。在留體藥物生產中微生物轉化技術一直占據重要地位，美國和日本從二十世紀八十年代開始以植物留醇為原料微生物轉化生產雄留烯二酮(4AD)，我國天藥股份現已掌握這一生產技術，再以此合成留體藥物，從而解決了植物資源有限的原料瓶頸，降低了制造成本，并大大減少了環境污染。睪酮的生產方法有兩種一是以薯芋皂甙為原料經過十二步反應得到睪酮；其二是以4AD為原料，經過四步反應得到睪酮。上述方法需要大量的有機溶劑和化工原料，反應復雜，環境污染大，且有的反應要求在無水條件和低溫冷凍條件下進行，總收率較低。國內外也進行了微生物轉化的研究，目前報到的主要有兩種方法一是雄留烯二酮為底物微生物氫化轉化為睪酮，該方法在國外已實現產業化；其二是以植物留醇為底物微生物直接轉化為睪酮，該方法尚處于實驗室階段。本發明涉及以價值比雄留烯二酮(4AD)低廉的黃體酮通過青霉屬分枝青霉組菌株轉化制備睪酮的研究，國內外尚未見文獻報道。
發明內容
為了簡便、高效、規模化發酵制備睪酮，本發明提供的轉化微生物是一株由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的青霉屬分枝青霉組(Penicilliumramigena, YNCA0361)菌株，菌株保藏編號為CGMCC No. 4824，保藏日期為2011年5月2日。在本發明青霉菌發酵黃體酮制備睪酮的方法中，青霉菌(Penicillium ramigena,YNCA0361)菌株經過長時間的馴化培養后，可在PDA培養基、察氏培養基、虎紅培養基上生長。在本發明青霉菌(Penicillium ramigena, YNCA0361)發酵轉化黃體酮制備睪酮的方法中，黃體酮的投料量比例為O. I 2% (w/v);發酵溫度25 40°C，通氣比O. I 10(v/V)，攪拌速率120 500r/min，發酵時間IOOh 200h。產物提取過程中添加I 5% (w/V)的Amberlite XAD 16大孔吸附樹脂，25 40°C處理2h。在本發明青霉菌(Penicillium ramigena, YNCA0361)發酵轉化黃體酮制備睪酮的
方法中，可以通過全自動發酵罐發酵黃體酮制備睪酮，經過柱層析分離后得到睪酮的單體。
權利要求
1.一株由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的青霉屬分枝青霉組(P. ramigena,YNCA0361)菌株,菌株保藏編號為CGMCC No. 4824，保藏日期為2011年5月6曰。
2.一種黃體酮生物轉化制備睪酮，式I的方法
3.一種用權利要求I所述菌株發酵轉化黃體酮制備睪酮的方法。
其特征在于 (1)所述培養基為PDA或察氏液體培養基。
(2)培養基中黃體酮投料量比例為O.I 2% (w/v);發酵溫度18 50°C，0. I 35%(w/v)氨水動態調節pH = 2 8,通氣比O. I 10(v/v),攪拌速率10 900r/min,發酵時間 20h 240h。
(3)在產物提取過程中添加O.I 30% (w/v)的Amberlite XAD-16或DlOl大孔吸附樹脂，18-50°C處理Ih 10h。發酵液經過固液分離所得菌絲體和大孔吸附樹脂在乙醇中超聲提取Ih 24h。
(4)青霉屬分枝青霉組(P.ramigena, YNCAO361)菌株發酵黃體酮,得到睪酮。
全文摘要
一株保藏編號為CGMCC No.4824的青霉屬分枝青霉組(P.ramigena，YNCA0361)菌株，以及用該菌株在發酵罐中發酵轉化黃體酮制備睪酮的方法。培養基選用PDA和察氏培養基。黃體酮的投料量比例為0.1～2％(w/v)；發酵溫度25～40℃，通氣比0.1～10(v/v)，攪拌速率120～500r/min，發酵時間100h～200h。產物提取過程中添加1～5％(w/v)的Amberlite XAD～16大孔吸附樹脂，25～40℃處理2h。本發明為規模化發酵轉化黃體酮制備睪酮提供一株性狀穩定、培養基簡單、生長良好的青霉菌菌株、實用簡便的發酵罐發酵及分離提取工藝。用該菌株及該工藝來規模制備睪酮，生產成本低、雜質少，產物得率高。
文檔編號C12R1/80GK102876583SQ20121004182
公開日2013年1月16日 申請日期2012年2月23日 優先權日2012年2月23日
發明者楊海英, 杜剛, 田孟華, 李干鵬, 袁明龍 申請人:楊海英