專利名稱：在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法
技術領域：
本發明涉及一種重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法。更具體地說，涉及在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法。
背景技術：
乙醇氧化酶是甲醇代謝的重要用酶，它可以催化甲醇及其他低級醇類并將其氧化生成其相應的醛類與過氧化氫。乙醇氧化酶的活性形式為一個分子量為600kDa的同源八聚體，并定位于細胞的過氧化物酶體中。乙醇氧化酶的每一個亞基都含有一個黃素腺嘌呤二核苷酸輔酶。乙醇氧化酶的亞基是在細胞周質中形成，與黃素腺嘌呤二核苷酸結合后進入過氧化物酶體進行八聚體的組裝。乙醇氧化酶可以有效的通過消耗氧氣來催化甲醇及其他低級醇類，事實上，很多基于氧電極的乙醇檢測器都是利用固定化的乙醇氧化酶作為其主要介質。基于乙醇氧化酶的乙醇生物檢測器在發酵，環境及食品工業等方面有重要的應用。該生物檢測器存在以下幾個優點(1)對低級醇類的高度親和，檢測精密度高；( 該酶的活性形式具有高度穩定性，檢測壽命長；C3)在發酵工業，環境工程和食品工業方面檢測的實用性強。乙醇氧化酶的商業化應用的兩個重要瓶頸因素是酶的大批量生產與酶的純化工藝。從野生菌畢赤酵母，假絲酵母，漢遜酵母中分離純化乙醇氧化酶已有報道，但在這些野生菌中，乙醇氧化酶的表達均為胞內表達，胞內表達的酶相較于胞外來說更難純化，這樣會增加乙醇氧化酶的生產成本。僅嗜熱子囊菌NBRC31693可以在胞外表達乙醇氧化酶，但其產量很低，僅為133U/L。從重組表達方面來說，乙醇氧化酶的異源表達已有過報道，例如在釀酒酵母和大腸桿菌中都進行過乙醇氧化酶的重組表達，雖然表達是成功的，但表達的酶卻沒有活性。其原因主要歸結于乙醇氧化酶的活性結構的裝配不僅需要黃素腺嘌呤二核苷酸輔酶，還需要有特殊的裝配環境“過氧化物酶體”。因此，為滿足乙醇氧化酶的大量工業化生產及應用，首先需要克服的是乙醇氧化酶的高表達以及其純化工藝的簡化。本發明的目的是提供一種乙醇氧化酶的重組表達與純化的方法，以期利用該畢赤酵母工程菌大規模的發酵與純化乙醇氧化酶。
發明內容
針對現有乙醇氧化酶表達及純化存在的不足之處，本發明的目的是提供一種在畢赤酵母中重組表達和純化乙醇氧化酶的方法，利用增加乙醇氧化酶的拷貝數與對發酵條件優化來提高重組乙醇氧化酶的表達量，特別是以麥芽糖為碳源，解除碳源對乙醇氧化酶表達的抑制，使重組乙醇氧化酶的表達量得到提高，且重組乙醇氧化酶可部分分泌到胞外。利用添加的多聚組氨酸融合標簽可以達到簡化乙醇氧化酶的純化工藝的目的；另外，多聚組氨酸融合標簽的添加提高了重組酶的熱穩定性。該方法通過如下步驟實現的
1)乙醇氧化酶基因的擴增根據NCBI上的畢赤酵母GS115的乙醇氧化酶的基因序列，設計一對引物，上游引物5，-CCGGAATTCATGGCTATCCCCGAAGAGTT-3，，下游引物:5，-A TTTGCGGCCGCTTATTAATGGTGATGGTGATGGTGGATCTAGCAAGACCGGTC-3，，在兩條引物上分別加上 EcoR I和Not I限制性內切酶位點，并在下游引物上添加多聚組氨酸標簽的基因，利用聚合酶鏈式反應，得到帶組氨酸標簽的乙醇氧化酶的DNA ；2)重組表達載體的構建將目的基因定向克隆進用同樣的內切酶雙酶切過的表達載體pPIC9K上，得到含有乙醇氧化酶的重組表達載體PPIC9K-A0X-HIS，將該重組表達載體PPIC9K-A0X-HIS轉化到大腸桿菌DH5ci感受態中，然后，涂布在含氨芐霉素與卡那霉素的LURIA-BERTANL平板上，培養過夜，隨機挑取平板上生長的菌落，堿法抽提質粒DNA，雙酶切鑒定；3)將重組表達載體電轉化到畢赤酵母GS115中在透明的1. 5ml聚苯乙烯滅菌管中加入85 μ 1終濃度為1. 0 μ g/ μ 1的重組表達載體、3_5 μ 1線性化酶和10 μ 1緩沖液，輕輕混勻，37°C下放置3-6小時，進行重組表達載體的線性化，得到線性化重組質粒；同時，根據^witrogen公司的《畢赤酵母表達手冊》制備畢赤酵母GSl 15感受態，取出100 μ 1制備好的畢赤酵母GS115感受態與1-3 μ g上述的線性化重組質粒混合，轉入電轉杯，冰浴5分鐘，進行電轉化，電轉化結束后立即加入Iml酵母膏胨葡萄糖培養基，混合均勻后涂于最小葡萄糖培養基平板上，于條件下培養2-4天；上述酵母膏胨葡萄糖培養基為10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖， PH7. 0 ；上述最小葡萄糖培養基平板為13. 4g/L無氨基酵母氮源、0. %ig/L生物素、20g/L葡萄糖和15-20g/L瓊脂粉；4)多拷貝轉化子的篩選將最小葡萄糖培養基平板上的轉化菌落點在含抗生素 G418的酵母膏胨葡萄糖培養基選擇平板上，篩選出抗生素G418濃度為2. 0-4. Omg/ml的菌株；5)重組菌株的誘導表達將步驟4)篩選出的菌株接種于5ml酵母膏胨葡萄糖培養基中，在200轉/分鐘轉速、30°C下培養過夜，得到種子液，然后，把種子液接種到緩沖復合甘油培養基或YPM培養基的搖瓶中，種子液與緩沖復合甘油培養基或YPM培養基的體積比為1 100，在200轉/分鐘轉速、30°C下培養M小時；在1500-3000轉/分鐘轉速、室溫下離心5分鐘，收獲酵母沉淀，用體積濃度1 % -5%甲醇的緩沖復合甲醇培養基或YPM培養基懸浮酵母，使菌體細胞濃度=1-2，每隔M小時添加體積濃度-5%的甲醇，誘導表達48-96小時，得到表達重組乙醇氧化酶蛋白的發酵液；上述緩沖復合甘油培養基為20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，IOOmM(毫摩爾)， PH6. 0磷酸鉀緩沖液，13. 4g/L無氨基酵母氮源，體積濃度1 %甘油；上述緩沖復合甲醇培養基為20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100mM，pH6. 0磷酸鉀緩沖液，13. 4g/L無氨基酵母氮源；上述YPM培養基為10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和10-50g/L碳源，pH5. 0-9.0，碳源為葡萄糖，麥芽糖，淀粉，蔗糖或甘露糖；6)胞外重組乙醇氧化酶蛋白的純化將上述步驟幻所得到的表達重組乙醇氧化酶蛋白的發酵液離心，取上清用體積濃度33%丙酮在_20°C下沉淀，然后，在4°C、13000轉 /分鐘轉速下離心，得到的沉淀用平衡緩沖液進行重懸，再在4°C、13000轉/分鐘轉速下進行離心，取上清；用10倍柱體積的平衡緩沖液平衡鎳離子親和層析柱，加入上述上清并使
5其在柱內平衡，再用平衡緩沖液沖洗鎳離子親和層析柱，然后，用洗脫液洗脫結合到鎳離子親和層析柱上的重組乙醇氧化酶，得到純化的胞外重組乙醇氧化酶蛋白；上述的平衡緩沖液pH8. 0，其成分為20mM Tris-HCl,0. 5M NaCl，20mM咪唑，上述的洗脫液 pH8. 0，其成分為 20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，250mM 咪唑；7)胞內重組乙醇氧化酶蛋白的純化將上述步驟幻中所得到的表達重組乙醇氧化酶蛋白發酵液離心，所得的酵母沉淀經蒸餾水洗后用平衡緩沖液進行重懸，然后用超聲波進行破碎，超聲條件功率300瓦，工作7秒，間隔5秒，重復60次，超聲波破碎的溶液在 413000轉/分鐘條件下離心，取上清；用10倍柱體積的平衡緩沖液平衡鎳離子親和層析柱，加入上述上清并使其在柱內平衡，用平衡緩沖液沖洗鎳離子親和層析柱，然后，用洗脫液洗脫；用5倍柱體積的上樣緩沖液平衡凝膠層析柱。然后加入上述洗脫液并使其在柱內平衡，用上樣緩沖液對凝膠層析進行洗脫，得到純化的胞內重組乙醇氧化酶蛋白；上述的平衡緩沖液pH8. 0，其成分為20mM Tris-HCl, 0. 5M NaCl，20mM咪唑，上述的洗脫液PH8. 0，其成分為20mM Tris-HCl, 0. 5M NaCl，250mM咪唑；上述的上樣緩沖液pH8. 0， 成分為 0. IM KH2PO4-K2HPO4, 500mM NaCl。本發明的在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶AOX的表達與純化，與現有技術相比有以下優點1)本發明成功克隆獲得了畢赤酵母完整的乙醇氧化酶的基因序列，并保證表達獲得乙醇氧化酶的活力，且重組乙醇氧化酶的比活力與野生型來源的相近。2)本發明通過聚合酶鏈式反應技術使乙醇氧化酶基因帶上6個組氨酸標簽并克隆于pPIC9K質粒載體的EcoR I和Not I位點之間，使重組乙醇氧化酶得以快速純化，且純化所得酶純度高，純化過程的回收率高。3)本發明通過對重組菌乙醇氧化酶拷貝數篩選與搖瓶發酵條件的優化，使重組乙醇氧化酶的產量得到提高；特別以麥芽糖為碳源，解除了碳源對乙醇氧化酶表達的抑制，使重組乙醇氧化酶的表達量得到大幅度提高，其總產量最高可以達到1862U/L。4)此重組乙醇氧化酶可部分分泌表達于胞外，有利于該酶的快速純化。5)本發明所得到的重組乙醇氧化酶在50°C下的半衰期為50分鐘，相較于畢赤酵母野生型乙醇氧化酶的37°C下的半衰期10分鐘有很大的提高。本發明的產品穩定性好，特別適合于檢測用途。
圖1為本發明構建的重組乙醇氧化酶表達質粒pPIC9K-A0X-HIS。圖加和圖2b為重組乙醇氧化酶(rAOX)在畢赤酵母中的表達；其中圖加是 SDS-PAGE電泳圖譜；圖2b是蛋白質印跡圖；1-重組酵母胞內蛋白；2-重組酵母胞外蛋白； Marker 蛋白分子量標準。圖3-A、圖3-B和圖3_C為重組乙醇氧化酶表達的培養條件優化結果圖；其中圖
3-A是YPM培養基碳源優化圖；圖3-B是YPM培養基碳源添加量優化圖；圖3-C是YPM培養基初始PH值優化圖。圖4-A、圖4-B和圖4_C為重組乙醇氧化酶表達的誘導條件優化結果圖；其中圖
4-A是誘導時機優化圖；圖4-B是誘導劑量的優化圖；圖4-C是誘導時間的優化圖。
圖5為胞內及胞外的重組乙醇氧化酶rAOX純化的SDS-PAGE電泳圖譜；1_胞外的蛋白；2-經丙酮沉淀后得到的蛋白；3-親和層析柱未吸附的蛋白；4-純化的乙醇氧化酶； 5-胞內的蛋白；6-親和層析柱未吸附的蛋白；7-親和層析柱洗脫的蛋白；8-經凝膠層析純化得到的乙醇氧化酶；Marker 蛋白分子量標準。圖6為重組乙醇氧化酶的熱穩定性圖；□表示42°C ；Δ表示50°C ；O表示55°C。
具體實施例方式以下通過步驟進一步對本發明進行描述步驟1、畢赤酵母基因組提取方法1)接種畢赤酵母GSl 15到5ml酵母膏胨葡萄糖(YPD)培養基，30°C，培養16 18 小時，取1. 5ml酵母培養液，室溫下，5000轉/分鐘離心5_10分鐘收集菌體；2)菌體用滅菌水洗1次，5000轉/分鐘離心5分鐘；菌體用200 μ L TE緩沖液重懸，加入30 μ L 10mg/ml溶菌酶37°C溫浴1小時；加入100 μ L 2%十二烷基硫酸鈉(SDS) 混勻，-20°C冰凍，然后室溫震蕩溶解，反復3次；向懸浮液中加入150 μ L 5mol/L, pH8. 9的醋酸鉀輕輕混勻，然后10000轉/分鐘離心5分鐘；3)將上清轉移到一新的1. 5ml離心管中，加入2倍體積的乙醇，輕輕混勻，室溫放置5分鐘后12000轉/分鐘離心10分鐘，除去上清，將沉淀溶解在300 μ LTE緩沖液中，加入6 μ L 10mg/ml的RNA酶，37°C溫浴30分鐘；加入飽和酚和氯仿各150 μ L充分混勻，然后 10000轉/分鐘轉速下離心5分鐘；4)轉移上清到新的1. 5ml離心管中，加入1/2體積的7. 5mol/L, ρΗ7· 5的醋酸銨和等體積的異丙醇，_20°C放置20分鐘后12000轉/分鐘轉速下離心10分鐘；除去上清，加入300 μ L 70%乙醇漂洗沉淀一次，10000轉/分鐘離心5分鐘5)風干除去乙醇，用20 μ L，pH8. OTE緩沖液溶解酵母DNA上述TE 緩沖液為 pH8. 010mmol/L 的 Tris-Hcl 和 pH8. 0，10mmol/L 的乙二胺四乙酸(EDTA)。步驟2、構建 pPIC9K-A0X-HIS 工程菌1)乙醇氧化酶基因的獲得a)根據購于hvitrogen公司的pPIC9K的多克隆位點序列特點和NCBI數據庫上面提供的畢赤酵母GS115的乙醇氧化酶的序列，按照引物設計原則，設計一對引物，用于擴增乙醇氧化酶全長序列，其中在兩條引物上分別加上EcoR I和Not I限制性內切酶位點， 并在下游引物上添加6個組氨酸標簽基因；上游引物5，-CCGGAATTCATGGCTATCCCCGAAGAGTT-3，下游引物5’-ATTTGCGGCCGCTTATTA ATGGTGATGGTGATGGTG GATCTAGCAAGACCGGTC-3’其中，酶切位點用下劃線表示，組氨酸標簽基因用雙下劃線表示；b)利用聚合酶鏈式反應，得到帶組氨酸標簽的乙醇氧化酶的DNA 該反應程序如下預變性94°C，5分鐘；變性95 0C，30秒；復性58 °C，30秒；延伸72°C，2分鐘，共30個循環，最后一次反應延伸時間為10分鐘。取聚合酶鏈式反應產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳， 采用購于Qiagen公司的膠回收試劑盒回收瓊脂糖凝膠中的乙醇氧化酶的DNA ；
2)構建乙醇氧化酶的重組表達載體pPIC9K-A0X-HIS a)將乙醇氧化酶基因用EcoR I和Not I雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，回收乙醇氧化酶基因片段，PPIC9K空質粒同樣用這兩個酶進行酶切后回收雙酶切過的質粒片段；b)將回收的乙醇氧化酶基因片段和酶切過的質粒片段按濃度比4 1的比例加入 200 μ 1小離心管中，用Τ4連接酶在16°C下連接過夜；C)以上連接產物10 μ 1轉化200 μ 1 CaCl2法制備的DH5 α感受態細胞，然后，加入37°C預熱的LURIA-BERTANL培養基Iml后置于37°C搖床，在180轉/分鐘轉速下振蕩1 小時。d)上述菌液在4000轉/分鐘轉速下離心1分鐘后，棄去Iml上清，剩余溶液用移液器輕輕吹打混勻后涂布在含有氨芐霉素和卡那霉素的LURIA-BERTANL平板，并置于37°C 培養箱培養12小時以上；e)隨機挑取上述平板中的單菌落，小量擴增后提取質粒，然后用EcoR I和Not I 進行雙酶切鑒定，得到含有乙醇氧化酶的重組表達載體PPIC9K-A0X-HIS ；如圖1，此圖為將乙醇氧化酶的目的基因定向克隆進同樣經EcoRI和Not I 雙酶切過的畢赤酵母常用表達載體PPIC9K上，得到含有乙醇氧化酶的重組表達載體 PPIC9K-A0X-HIS。其中的&ic I為線性化位點。具體可參見hvitrogen公司的《畢赤酵母表達手冊》(Invitrogen Pichia Expression Kit)。3)構建生產重組乙醇氧化酶的工程菌a)在透明的1. 5ml聚苯乙烯滅菌管中加入85 μ 1終濃度為1. 0 μ g/ μ 1的重組表達載體、3-5 μ 1線性化酶和10 μ 1緩沖液，輕輕混勻，37°C下放置3-6小時，進行重組表達載體PPIC9K-A0X-HIS的線性化；b)同時，根據hvitrogen公司的《畢赤酵母表達手冊》(Invitrogen Pichia Expression Kit)制備畢赤酵母GSl 15感受態；c)取出100 μ 1制備好的畢赤酵母GSl 15感受態與1_3 μ g上述的線性化重組質粒混合，轉入0. 2cm電轉杯，冰浴5分鐘，用電轉儀在1500V，25 μ F條件下進行電轉化；d)電轉化結束后立即加入Iml酵母膏胨葡萄糖培養基，混合均勻后分別取50 μ 1， 100 μ 1，150 μ 1，200 μ 1涂于最小葡萄糖培養基(MD)平板上，于條件下培養2-4 天，觀察轉化子的生長；4)篩選多拷貝的乙醇氧化酶工程菌將最小葡萄糖培養基(MD)平板上的轉化菌落點在含有G418濃度為0，0. 5，1. 0,2. 0，和4. 0mg/ml的酵母膏胨葡萄糖培養基的選擇平板上，篩出G418濃度為2. 0-4. 0mg/ml的菌株；步驟3、乙醇氧化酶工程菌的誘導表達1)將步驟2篩選出的菌株接種于5ml酵母膏胨葡萄糖培養基中，在200轉/分鐘轉速、30°C下培養過夜，得到種子液，然后，把種子液接種到緩沖復合甘油(BMGY)培養基或 YPM培養基的搖瓶中，種子液與緩沖復合甘油培養基或YPM培養基的體積比為1 100，在 200轉/分鐘轉速、30°C下培養M小時；2)在1500-3000轉/分鐘轉速、室溫下離心5分鐘，收獲酵母沉淀，用體積濃度 -5%甲醇的緩沖復合甲醇(BMMY)培養基或YPM培養基懸浮酵母，使菌體細胞濃度=
1-2，每隔M小時添加體積濃度-5%的甲醇，誘導表達48-96小時，得到表達重組乙醇氧化酶蛋白的發酵液；3)并在0，24，36，72，96小時等時間點取500ul發酵液，并用膠濃度為12% SDS-PAGE電泳及蛋白質印跡鑒定分析胞內及胞外的重組表達產物，結果見蛋白電泳圖(圖 2a)與蛋白質印跡圖(圖2b)；步驟4、乙醇氧化酶活力的測定1)乙醇氧化酶活力測定是在0. 2ml的反應體系內，反應液中含有2. 5%甲醇，6mM 4-氨基安替比林，6mM苯酚，IU過氧化物酶和5uL酶液，反應在25°C下測定，采用酶標儀進行反應的在線測定；2)該方法主要是通過檢測生成的過氧化氫的含量來確定酶的活性，酶活定義為 在25攝氏度下，1分鐘生成1 μ mol過氧化氫所需要的酶量定義為一個酶活力單位。步驟5、重組乙醇氧化酶發酵條件優化在搖瓶發酵環境通過單因素實驗設計，改變培養過程中的一個因素，其他因素不變，優化表達重組乙醇氧化酶的基因工程菌發酵條件。重組乙醇氧化酶發酵條件優化的因素包括YPM培養基的碳源，YPM培養基的碳源添加量，YPM培養基初始pH值，誘導過程的誘導時機，誘導劑甲醇的體積濃度和誘導時間；1)YPM培養基碳源的優化在250ml的搖瓶中配置30ml的YPM培養基，其中的碳源用20g/L的葡萄糖，麥芽糖，淀粉，蔗糖，甘露糖，通過酶活測定來分析重組乙醇氧化酶在胞內外的表達情況，確定最佳碳源，結果見圖3-A ；從圖上可以看出，分別以20g/L的葡萄糖， 麥芽糖，淀粉，蔗糖，甘露糖為碳源來培養畢赤酵母工程菌，其中麥芽糖為其最適碳源，因為以麥芽糖為碳源所表達的重組乙醇氧化酶產量最高。^YPM培養基的碳源添加量的優化在250ml的搖瓶中配置30ml的YPM培養基，其中的碳源用麥芽糖，麥芽糖的添加量分別為10，20，30，40，50g/L，通過酶活測定來分析重組乙醇氧化酶在胞內外的表達情況，確定最佳碳源添加量，結果見圖3-B;從圖上可以看出， 分別以10，20，30，40，50g/L的麥芽糖為碳源來培養畢赤酵母工程菌，其中麥芽糖的添加量為50g/L時，畢赤酵母工程菌所表達的重組乙醇氧化酶產量最高。3) YPM培養基初始pH值的優化在250ml的搖瓶中配置30ml初始pH值在4. 0-9. 0 的YPM培養基，其中的碳源用50g/L麥芽糖，通過酶活測定來分析重組乙醇氧化酶在胞內外的表達情況，確定最佳培養基初始PH值，結果見圖3-C ；從圖上可以看出，畢赤酵母工程菌的培養基初始PH值在4. 0-9. 0之間，其中當培養基初始pH值為8. 0時，畢赤酵母工程菌所
表達的重組乙醇氧化酶產量最高。4)誘導時機的優化先做出重組畢赤酵母在初始PH值為8. 0的YPM培養基，其中的碳源用50g/L麥芽糖下的生長曲線，在重組畢赤酵母菌體生長的不同時期包括菌體細胞濃度0. 5，1. 0，2. 0，4. 0和6. 0下用1 % -5%甲醇誘導48-96小時，通過酶活測定來分析重組乙醇氧化酶在胞內外的表達情況，確定最佳誘導時機，結果見圖4-A;從圖上可以看出， 在菌體細胞濃度0. 5，1. 0,2. 0,4. 0和6. 0下對畢赤酵母工程菌進行甲醇誘導，當菌體細胞濃度為1. 0時，畢赤酵母工程菌所表達的重組乙醇氧化酶產量最高。5)誘導劑甲醇的體積濃度的優化重組畢赤酵母在初始PH值為8. 0的YPM培養基，其中的碳源用50g/L麥芽糖下生長到菌體細胞濃度1. 0時，分別用體積濃度1%，2%， 3%，4%和5%的甲醇誘導48-96小時，通過酶活測定來分析重組乙醇氧化酶在胞內外的表
9CN 102533808 A
說明書
7/8頁
達情況，確定最佳誘導劑甲醇的體積濃度，結果見圖4-B ；從圖上可以看出，分別用體積濃度1^,2^,3%, 4%和5%的甲醇對畢赤酵母工程菌進行誘導，當誘導的甲醇體積濃度為 4%時，畢赤酵母工程菌所表達的重組乙醇氧化酶產量最高。6)誘導時間的優化重組畢赤酵母在初始PH值為8. 0的YPM培養基，其中的碳源用50g/L麥芽糖下生長到菌體細胞濃度1.0時，用體積濃度4%甲醇進行誘導，誘導至乙醇氧化酶表達量下降為止，誘導期間，每隔5小時取一次樣，通過酶活測定來分析重組乙醇氧化酶在胞內外的表達情況，確定最佳誘導時間，見圖4-C;從圖上可以看出，用體積濃度4% 的甲醇對畢赤酵母工程菌誘導l5-65h，當誘導時間為55小時時，畢赤酵母工程菌所表達的重組乙醇氧化酶產量最高。另外，實驗結果表明，優化過程中胞外部分的重組乙醇氧化酶均占總重組乙醇氧化酶的30%左右；經過重組畢赤酵母的表達條件優化，得到最佳的培養基條件為YPM培養基中的碳源用50g/L的麥芽糖來替代，培養基初始pH為8. 0。最適的誘導條件為在菌體長到菌體細胞濃度1. 0時進行誘導，誘導劑甲醇的體積濃度為4%，誘導時間為55小時。在此發酵條件下胞內表達的酶活性總和為1300U/L，胞外表達的酶活性總和為562U/L。相較于野生菌所表達的乙醇氧化酶來說，該表達方式的優點在于可部分分泌表達，且表達量相對較高。步驟6、重組AOX的純化1)胞外重組AOX的純化a)將上述步驟5所得到的表達重組乙醇氧化酶蛋白的發酵液離心，取上清用體積濃度33%丙酮在-20°C下沉淀，然后，在4°C、13000轉/分鐘轉速下離心；b)得到的沉淀用平衡緩沖液進行重懸，再在4°C、13000轉/分鐘轉速下進行離心， 取上清；c)用10倍柱體積的平衡緩沖液平衡鎳離子親和層析柱，加入上述上清并使其在柱內平衡，用平衡緩沖液沖洗鎳離子親和層析柱；d)用洗脫液洗脫結合到鎳離子親和層析柱上的重組乙醇氧化酶，得到純化的胞外
重組乙醇氧化酶蛋白；e)用膠濃度為12% SDS-PAGE電泳分析純化情況，結果見圖5的1_4列；上述的平衡緩沖液pH8. 0，其成分為20mM Tris-HCl,0. 5M NaCl，20mM咪唑，上述的洗脫液 pH8. 0，其成分為 20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，250mM 咪唑；2)胞內重組乙醇氧化酶蛋白的純化a)將上述步驟5中所得到的表達重組乙醇氧化酶蛋白發酵液離心，所得的酵母沉淀經蒸餾水洗后用平衡緩沖液進行重懸；b)重懸后菌液用超聲波進行破碎，超聲條件超生功率300瓦，工作7秒，間隔5 秒，重復60次，在4°C，13000轉/分鐘條件下離心；c)取上清用10倍柱體積的平衡緩沖液平衡鎳離子親和層析柱，加入上述上清并使其在柱內平衡，用平衡緩沖液沖洗鎳離子親和層析柱后用洗脫液洗脫；d)用5倍柱體積的上樣緩沖液平衡凝膠層析柱，然后加入上述洗脫液并使其在柱內平衡，用上樣緩沖液進行洗脫，得到純化的胞內重組乙醇氧化酶蛋白；e)用膠濃度為12% SDS-PAGE電泳分析純化情況，結果見圖5的5_8列；8/8頁上述的平衡緩沖液pH8. 0，其成分為20mM Tris-HCl,0. 5M NaCl，20mM咪唑，上述的洗脫液PH8. 0，其成分為20mM Tris_HCl，0. 5M NaCl，250mM咪唑；上述的上樣緩沖液pH8. 0， 成分為 0. IM KH2PO4-K2HPO4, 500mM NaCl。經分析表明，純化的重組乙醇氧化酶的純度可以達到90%以上。通過計算可以得到，蛋白的總回收率為68.9%，比從野生菌中純化該蛋白的回收率高得多。總蛋白的比活力為12. 2U/mg蛋白，與野生菌來源的該酶的比活力相近。步驟7、重組乙醇氧化酶熱穩定性測定1)將上述純化的胞外重組乙醇氧化酶蛋白以及胞內重組乙醇氧化酶蛋白取三份， 分別在42°C，50°C，550C的溫度下保溫1小時，每隔5分鐘取3_5 μ 1酶液進行殘余的酶活力測定。2)熱穩定性分析結果見圖6，該重組乙醇氧化酶在50°C下的半衰期為50分鐘，而野生型來源的乙醇氧化酶在37°C下的半衰期為10分鐘，相比而言，本重組乙醇氧化酶的熱穩定性有很大的提高。
1權利要求
1.在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法，其特征在于，包括如下步驟1)乙醇氧化酶基因的擴增根據畢赤酵母GS115的乙醇氧化酶的基因序列，設計一對引物，上游引物5，-CCGGAATTCATGGCTATCCCCGAAGAGTT-3，，下游引物5，-ATTTGCGGCCGCTT ATTAATGGTGATGGTGATGGTGGATCTAGCAAGACCGGTC-3，在兩條引物上分別加上 EcoR I 和 Not I 限制性內切酶位點，并在下游引物上添加多聚組氨酸標簽的基因，利用聚合酶鏈式反應，得到帶組氨酸標簽的乙醇氧化酶的DNA ；2)重組表達載體的構建將目的基因定向克隆進同樣經EcoRI和NotI雙酶切過的表達載體pPIC9K上，得到含有乙醇氧化酶的重組表達載體PPIC9K-A0X-HIS，將該重組表達載體pPIC9K-A0X-HIS轉化到大腸桿菌DH5 α感受態中，然后，涂布在含氨芐霉素與卡那霉素的LURIA-BERTANL平板上，培養過夜，隨機挑取平板上生長的菌落，堿法抽提質粒DNA，雙酶切鑒定；3)將重組表達載體電轉化到畢赤酵母GS115中在透明的1.5ml聚苯乙烯滅菌管中加入85 μ 1終濃度為1. O μ g/ μ 1的重組表達載體、3_5 μ 1線性化酶和10 μ 1緩沖液，輕輕混勻，37°C下放置3-6小時，進行重組表達載體的線性化，得到線性化重組質粒；同時制備畢赤酵母GS115感受態，取出100 μ 1制備好的畢赤酵母GS115感受態與1-3 μ g上述的線性化重組質粒混合，轉入電轉杯，冰浴5分鐘，進行電轉化，電轉化結束后立即加入Iml酵母膏胨葡萄糖培養基，混合均勻后涂于最小葡萄糖培養基平板上，于條件下培養2-4天；4)多拷貝轉化子的篩選將最小葡萄糖培養基平板上的轉化菌落點在含抗生素G418 的酵母膏胨葡萄糖培養基選擇平板上，篩選出抗生素G418濃度為2. 0-4. Omg/ml的菌株；5)重組菌株的誘導表達將步驟4)篩選出的菌株接種于5ml酵母膏胨葡萄糖培養基中，在200轉/分鐘轉速、30°C下培養過夜，得到種子液，然后，把種子液接種到緩沖復合甘油培養基或YPM培養基的搖瓶中，種子液與緩沖復合甘油培養基或YPM培養基的體積比為 1 100，在200轉/分鐘轉速、30°C下培養M小時；在1500-3000轉/分鐘轉速、室溫下離心5分鐘，收獲酵母沉淀，用體積濃度-5%甲醇的緩沖復合甲醇培養基或YPM培養基懸浮酵母，使菌體細胞濃度=1-2，每隔M小時添加體積濃度-5%的甲醇，誘導表達 48-96小時，得到表達重組乙醇氧化酶蛋白的發酵液；6)胞外重組乙醇氧化酶蛋白的純化將上述步驟幻所得到的表達重組乙醇氧化酶蛋白的發酵液離心，取上清用體積濃度33%丙酮在_20°C下沉淀，然后，在4°C、13000轉/分鐘轉速下離心，得到的沉淀用平衡緩沖液進行重懸，再在4°C、13000轉/分鐘轉速下進行離心，取上清；用10倍柱體積的平衡緩沖液平衡鎳離子親和層析柱，加入上述上清并使其在柱內平衡，再用平衡緩沖液沖洗鎳離子親和層析柱，然后，用洗脫液洗脫結合到鎳離子親和層析柱上的重組乙醇氧化酶，得到純化的胞外重組乙醇氧化酶蛋白；7)胞內重組乙醇氧化酶蛋白的純化將上述步驟幻中所得到的表達重組乙醇氧化酶蛋白發酵液離心，所得的酵母沉淀經蒸餾水洗后用平衡緩沖液進行重懸，然后用超聲波進行破碎，超聲波破碎的溶液離心，取上清；用10倍柱體積的平衡緩沖液平衡鎳離子親和層析柱，加入上述上清并使其在柱內平衡，用平衡緩沖液沖洗鎳離子親和層析柱，然后，用洗脫液洗脫；用5倍柱體積的上樣緩沖液平衡凝膠層析柱，然后加入上述洗脫液并使其在柱內平衡，用上樣緩沖液對凝膠層析進行洗脫，得到純化的胞內重組乙醇氧化酶蛋白。
2.根據權利要求1所述的在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法， 其特征在于，步驟幻中所述酵母膏胨葡萄糖培養基為10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和 20g/L葡萄糖，pH7. 0 ；所述最小葡萄糖培養基平板為13. 4g/L無氨基酵母氮源、0. %ig/L生物素、20g/L葡萄糖和15-20g/L瓊脂粉。
3.根據權利要求1所述的在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法，其特征在于，步驟幻中所述緩沖復合甘油培養基為20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，lOOmM， pH6. 0磷酸鉀緩沖液，13. 4g/L無氨基酵母氮源，體積濃度甘油；所述緩沖復合甲醇培養基為20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，lOOmM，pH6. 0磷酸鉀緩沖液，13. 4g/L無氨基酵母氮源；步驟幻和步驟6)中所述YPM培養基為10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和10_50g/L 碳源，pH5. 0-9. 0，碳源為葡萄糖，麥芽糖，淀粉，蔗糖或甘露糖。
4.根據權利要求1所述的在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法，其特征在于，步驟6)和步驟7)中所述的平衡緩沖液pH8.0，其成分為20mM Tris_HCl，0. 5M NaCl，20mM 咪唑，所述的洗脫液 pH8. 0，其成分為 20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，250mM 咪唑。
5.根據權利要求4所述的在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法，其特征在于，步驟7)中所述的上樣緩沖液pH8. 0，成分為0. ImKH2PO4-K2HPO4, 500mm NaCl。
6.根據權利要求1所述的在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法，其特征在于，步驟7)中超聲波破碎的超聲條件為功率300瓦，工作7秒，間隔5秒，重復60 次。
7.根據權利要求6所述的在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法，其特征在于，步驟7)中超聲波破碎溶液的在4°C，13000轉/分鐘條件下離< 心。
8.根據權利要求1所述的在畢赤酵母中進行重組乙醇氧化酶的表達與純化的方法，其特征在于，對步驟6)和步驟7)純化所得的重組乙醇氧化酶重組乙醇氧化酶熱穩定性測定 將純化所得的重組乙醇氧化酶取三份，分別在42°C，50°C，550C的溫度下保溫1小時，每隔5 分鐘取3-5 μ 1酶液進行殘余的酶活力測定。
全文摘要
本發明公開了一種重組乙醇氧化酶rAOX的表達與純化的方法。本發明運用分子生物學技術先構建乙醇氧化酶-多聚組氨酸表達載體pPIC9K-AOX-HIS，然后將其線性化后轉入畢赤酵母GS115中，從而獲得能夠表達有活性的重組乙醇氧化酶的畢赤酵母工程菌，且重組乙醇氧化酶可以部分分泌表達。通過對重組乙醇氧化酶表達條件進行優化，該工程菌生產的乙醇氧化酶可達到1862U/L。同時，酶的分泌表達與多聚組氨酸標簽的引入簡化了重組乙醇氧化酶的純化工藝。通過測定，該工程菌表達的重組乙醇氧化酶熱穩定性較畢赤酵母野生型乙醇氧化酶有很大的提高。本發明的整個過程操作簡單，可適合于工業化生產，可帶來一定經濟效益。
文檔編號C12N15/81GK102533808SQ20121003819
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月20日 優先權日2012年2月20日
發明者劉云平, 徐志南, 朱建忠 申請人:浙江德清匯寧生物科技有限公司