專利名稱：大腸埃希菌中tehA基因的檢測引物及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種大腸埃希菌(Escherichia coli,EC0)中耐消毒劑tehA基因攜帶情況的檢測方法，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
細菌的外排泵系統可分5類ATP結合盒轉運體家族(ATP-binding cassette family, ABC)、主要易化因子超家族(the major facilitator superfamily, MFS)、藥物與代Hi物轉運體 家族(the much larger drug/metabolite transporter superfamily, DMT)及與之相關的小多藥外排家族(the small multidrug resistance family, SMR)、多藥物與毒物夕卜排家方矣(the multidrug and toxic compound extrusion family, MATE) > 耐受-生節-分裂家族(the resistance-nodulation-division family, RND)。ABC 為能量泵，其余為質子泵。質子泵為細菌通過質子耦聯交換產生的質子驅動力(proton motive force, PMF)介導的次級藥物(化合物)轉運系統。細菌通過此類基因表達對多種化合物 (含消毒劑、滅菌劑)的耐藥。tehA基因表達細菌無機離子、多種化合物外排泵，陽性提示耐受亞碲酸鉀、氯化四苯砷、溴化乙啶、結晶紫、普魯黃。目前檢測tehA基因攜帶情況的方法主要有PCR后瓊脂糖凝膠電泳、測序。凝膠電泳法成本低、易操作，但靈敏度低，容易出現假陰性；測序是檢測基因突變的金標準，但測序技術步驟繁瑣、耗時長、容易污染。
發明內容
本發明的目的是提供大腸埃希菌中耐消毒劑tehA基因攜帶情況的PCR檢測引物及使用該引物的檢測方法。為了達到上述目的，本發明提供了一組大腸埃希菌中tehA基因的檢測引物，其特征在于，包括(A). tehA 基因正向弓丨物5' -tgagtttgtttcctgcaacg-3‘；(B). tehA 基因反向弓丨物5' _agcttcttcagggtgagatcc_3‘。本發明還提供了一種大腸埃希菌中tehA基因的檢測方法，其特征在于，采用上述大腸埃希菌中tehA基因的檢測引物，具體步驟為第一步取經培養后鑒定為大腸埃希菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶tehA基因的大腸埃希菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成tehA序列，構建攜帶tehA基因的重組質粒為陽性對照品；第二步用無菌水配制濃度為5-15umol/L的tehA基因正向引物溶液，濃度為5-15umol/L的tehA基因反向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的tehA基因檢測探針溶液；tehA基因正向引物的序列為5' -tgagtttgtttcctgcaacg-3 ‘，tehA基因反向引物的序列為5' -agcttcttcagggtgagatcc-3 ‘，tehA基因檢測探針的序列為 FAM-cgcccactggcggtg-MGBNFQ ；
第三步在每一個PCR反應孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的tehA基因正向引物溶液0. 1-lul.tehA基因反向引物溶液0. I-IuUtehA基因檢測探針溶液0. Ι-lul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品0. Ι-lul，用滅菌重蒸餾水補足25ul ；在熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為40-60°C保溫1-3分鐘，80-10(TC保溫1_3分鐘，再運行30-50個循環，每個循環包括在 80-100°C保溫 10-20 秒，再在 50-70°C保溫 0. 5-1. 5 分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進行結果分析，PCR結果呈S形曲線即為攜帶tehA基因。本發明是對大腸埃希菌中是否還有耐消毒劑tehA基因的檢測，細菌一旦獲得此基因即可對現用的消毒劑耐受，使消毒劑失效，通過檢測了解細菌中tehA基因的攜帶情況，有利于對含有耐消毒劑基因的菌株的監控，防止菌株繼續流行，同時從科研角度對其耐藥機理的進一步了解還有利于新的滅菌制劑的研制開發。本發明基于實時熒光定量PCR技術，應用具有分辨率更高、雜交特異性更強、重現性好等特點的Taqman-MGB探針，不僅檢測率高、可重復性強，檢測速度快，全部反應在封閉的反應管中完成，有效避免了交叉污染，且自動化程度高，能夠實時監控，提供質控標準品， 使結果判讀更直觀。
圖1為攜帶tehA基因的陽性對照品的Realtime PCR曲線圖；圖2為Realtime PCR陰性對照品的Realtime PCR曲線圖；圖3為攜帶tehA基因檢測樣品的Realtime PCR曲線圖；圖4為tehA基因檢測樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5為tehA基因檢測樣品的測序圖。
具體實施例方式以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。實施例1、采用固相亞磷酰胺三酯法制備一組用于檢測大腸埃希菌中tehA基因攜帶情況的引物，包括tehA 基因正向弓丨物5' -tgagtttgtttcctgcaacg-3‘；tehA 基因反向弓I物5' _agcttcttcagggtgagatce_3‘。2、檢測方法(1)取經培養后鑒定為大腸埃希菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，用商品化的細菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術有限公司，YP030(^)提取樣本DNA，稀釋至30ul(濃度lOng/ul)，置-20°C保存，待用；將標準大腸埃希菌株(保藏單位中國農業微生物菌種保藏管理中心，保藏編號ATCC Number :25922)，高溫滅活，用商品化的細菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術有限公司，YP030(^)提取樣本DNA，稀釋至 30ul(濃度lOng/ul)，作為陰性對照品；人工合成tehA序列(由上海生工合成)，構建攜帶 tehA基因的重組質粒，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，為陽性對照品。(2)根據tehA基因的保守區域，采用ABI Primer Express 3. O實時熒光定量PCR引物設計軟件，設計合成引物及Taqman探針，探針序列一端標記有報告熒光染料，另一端標記有淬滅熒光染料(由上海生工合成)，用無菌水配制濃度為lOumol/L的tehA基因正向引物溶液，濃度為lOumol/L的tehA基因反向引物溶液以及濃度為lOumol/L的tehA基因檢測探針溶液，其中，引物和檢測探針序列如下tehA 基因正向弓丨物5' -tgagtttgtttcctgcaacg-3‘；tehA 基因反向弓I物5' _agcttcttcagggtgagatcc_3‘；tehA 基因檢測探針FAM_cgcccactggcggtg-MGBNFQ ；(3)在每一個 PCR 反應孑L中力口入 PCR Master Mix (Applied Biosystems 公司生產的 iTaqman Universal PCR Master Mix 2X，包括 10XPCR 緩沖液、MgC12、dNTP、DNA 聚合酶)12. 5ul，tehA基因正向引物溶液0. 5ul，tehA基因反向引物溶液0. 5ul，tehA基因檢測探針溶液0. 5ul。然后在不同的PCR反應孔中分別加入步驟(1)得到的檢測樣品、陰性對照品或陽性對照品0. 5ul，最后用滅菌重蒸餾水補足25ul。在ABI7300型熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為50°C保溫2分鐘，95°C保溫2分鐘，再運行40個循環，每個循環包括在95°C保溫15秒，再在60°C保溫1分鐘；(4)用軟件SDS2. 2進行結果分析，如圖1所示，為陽性對照品的Realtime PCR曲線，呈S形。如圖2所示，為陰性對照品的Realtime PCR曲線，為非S形。如圖3所示，為檢測樣品的Realtime PCR曲線，呈S形。得出判斷，該樣品為攜帶tehA基因菌株。攜帶tehA基因菌株可使多種消毒劑如亞碲酸鉀、氯化四苯砷、溴化乙啶、結晶紫、 普魯黃等的MIC值幾倍或幾十倍的升高，對消毒劑表現為耐受。利用本發明對超過100例大腸埃希菌樣本的檢測結果顯示，根據上述方法進行的 tehA基因攜帶情況檢出率可達99%以上，可重復性達到100%。而瓊脂糖凝膠電泳法的檢出率約70%，如圖4所示，為tehA基因檢測樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖；本發明與直接測序法相比，結果一致性可達到99. 5%以上，如圖5所示為tehA基因檢測樣品的測序圖。
權利要求
1.大腸埃希菌中tehA基因的檢測引物，其特征在于，包括 ⑷· tehA 基因正向引物5' -tgagtttgtttcctgcaacg-3‘； (B). tehA 基因反向弓丨物5' -agcttcttcagggtgagatcc-3‘。
2.一種大腸埃希菌中tehA基因的檢測方法，其特征在于，采用權利要求1所述的大腸埃希菌中tehA基因的檢測引物，具體步驟為第一步取經培養后鑒定為大腸埃希菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本 DNA,作為檢測樣品；取不攜帶tehA基因的大腸埃希菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成tehA序列，構建攜帶tehA基因的重組質粒為陽性對照品；第二步用無菌水配制濃度為5-15umol/L的tehA基因正向引物溶液，濃度為 5-15umol/L的tehA基因反向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的tehA基因檢測探針溶液；tehA基因正向引物的序列為5' -tgagtttgtttcctgcaacg-3 ‘，tehA基因反向引物的序列為5 ‘ -agcttcttcagggtgagatcc-3 ‘，tehA基因檢測探針的序列為 FAM-cgcccactggcggtg-MGBNFQ ；第三步在每一個PCR反應孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的 tehA基因正向引物溶液0. I-Iul、tehA基因反向引物溶液0. 1-lul、tehA基因檢測探針溶液0. Ι-lul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品0. Ι-lul，用滅菌重蒸餾水補足25ul ；在熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為40-60°C保溫1-3分鐘，80-10(TC保溫1_3分鐘，再運行30-50個循環，每個循環包括在 80-100°C保溫 10-20 秒，再在 50-70°C保溫 0. 5-1. 5 分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進行結果分析，PCR結果呈S形曲線即為攜帶tehA基因。
全文摘要
本發明公開了一組大腸埃希菌中tehA基因的檢測引物及其檢測方法。所述的大腸埃希菌中tehA基因的檢測引物其特征在于，包括tehA基因正向引物5′-tgagtttgtttcctgcaacg-3′；tehA基因反向引物5′-agcttcttcagggtgagatcc-3′。檢測方法取經培養后鑒定為大腸埃希菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶tehA基因的大腸埃希菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成tehA序列，構建攜帶tehA基因的重組質粒為陽性對照品；分別進行PCR反應。本發明檢測率高、可重復性強。
文檔編號C12R1/19GK102534032SQ201210034068
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月14日 優先權日2012年2月14日
發明者傅詠南, 張奕, 王校 申請人:上海中優醫藥高科技有限公司