專利名稱：基因群檢測結構的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種基因群檢測結構，尤指涉及ー種改進原尼龍膜片操作平臺的缺點，特別是指建立全新低成本的WEnCA (Weighted Enzymatic Chip Array)操作平臺，可輔以自動化操作使檢測時間大幅降低，并減少人為操作誤差，以達突破芯片檢測技術在商品化過程所面臨的瓶頸。
背景技術：
對基因過渡表現(Overexpression)的分析已經導致疾病診斷的基本進步與臨床進展。而研究基因過渡表現的技術包含有北方墨點法(Northern Blot)、反轉錄聚合酶鏈鎖反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)及實時定量聚合酶鏈鎖反應(Real-Time PCR)。其中Northern Blot由于操作步驟十分敏瑣,所需檢體量又過多，因此僅限于研究操作上，無法實際應用于臨床診斷。至于RT-PCR及Real-Time PCR由于操作步驟簡便，因此在單一基因檢測的應用上，使用相當廣泛，例如肝炎病毒的檢測及感染癥病原菌的鑒定。然而，雖然PCR序列的發明作為整體最偉大的實驗，但多數PCR技術仍保有特定的共同問題，其主要問題包含有其一是污染，過渡靈敏偵察的偽陽性，例如霧式的DNA或先前的樣品殘余；其ニ是RT-PCR僅被認為半定量，因為當比較不同的樣品時，難以控制序列放大的效率；以及其三是由于所需引子(Primer)間黏合(Annearling)的干擾，無論RT-PCR或Real-Time PCR都僅廣泛應用于單一基因標的的檢測，當檢測標的為基因群時，則PCR相關的技術則有操作耗時、費事及高成本等缺點。隨著近幾年來生物科技的快速發展，生物芯片于臨床醫學診斷或藥效評估上的應用逐漸被重視，本發明的先前研究已開發并且評估ー尼龍膜芯片(Membrane Array)方法，能使用于癌癥診斷，在血液檢體(Peripheral Blood)中同時查出一多種mRNA標記引物的表達水平。其分子標志的表達水平由RT-PCR與尼龍膜芯片評估，數據從RT-PCR與尼龍膜芯片取得，且受制于線性回歸分析，顯示在這兩個方法結果之間的高度相互關系(r=0.979，P〈0.0001)。另外，以相關衍生技術的加權化學冷光型基因芯片(WeightedChemiluminescent Membrane Array, WCHMA)用于肺癌(Lung Cancer)患者的血液檢體分析標的治療藥物(Target Therapeutic Drug)的作用標的K_ras的異常情形，也已被接受刊登于肺癌期刊中。雖然尼龍膜芯片于分子診斷及藥效評估上的應用已有許多報告提出，然而，由于原始尼龍膜芯片所使用判讀方法上，對于每一基因在特定疾病的重要性皆等值的概念下，造成檢測特異性在達到一定程度之后便不易提升。另外，由于呈色型芯片(ColorimetricBiochip)操作平臺所需使用的洋地黃毒(Digoxigenin)系統成本十分昂貴,導致檢測成本過高，再加上芯片操作的高技術門坎，使得即使目前已經發展及評估成熟的診斷芯片仍不易普及于臨床醫學應用。故，一般無法符合使用者于實際使用時所需
發明內容
本發明的主要目的是針對現有技術所遭遇的上述問題，提供ー種基因群檢測結構，ー種快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易于結合自動化的WEnCA-Chipball操作平臺。本發明的次要目的在于，提供一種不需大型離心機而易于在各個實驗自動化操作的結構。本發明的另一目的在于，提供一種采用包含Poly-T引子的磁珠以利萃取的mRNA純度更高，使反應后的芯片背景值降低而準確度高的結構。本發明的再一目的在于，提供ー種以生物素-抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)取代Digoxigenin,不僅使用的酵素成本低，且以ニ氨基聯苯胺(Diaminobenzidine, DAB)作為呈色劑的穩定度亦高，使顔色容易保存的結構。本發明的又一目的在于，提供ー種以基因加權計算值的決定方式，配合ROC Curve 決定陽性判讀標準，并經臨床測試結果顯示的準確度能更準確地輔助疾病診斷的結構。為了達到上述目的，本發明所采用的技術方案是ー種基因群檢測結構，該結構包括
基因檢測芯片，選定與癌癥相關的標的基因群，將包含多種目標基因的標的基因群與內部對照組及空白對照組三重復點陣于ー尼龍膜片上，形成在該基因檢測芯片上被覆有標定特定序列；
檢體前處理單元，以包含Poly-T弓丨子的磁珠純化得檢體中的mRNA，將此mRNA經由反轉錄為cDNA后,再以酵素標定成探針；
雜合反應區，用以將該探針與該基因檢測芯片進行雜合反應；
芯片呈色単元，用以將該基因檢測芯片上雜合后的探針加上ニ氨基聯苯胺呈色劑進行呈色反應；以及
分析判讀單元，內建有分析軟件與影像擷取模式及數據傳輸模式，用以擷取該基因檢測芯片呈色反應后的影像，并對呈色反應后的影像結果進行自動化分析，將分析后所得的偵測值以基因加權計算方式，依據每個基因對于疾病形成或抗藥性發生的重要性給予個別加權分數，再經由陽性反應基因點乘上基因點的加權值而得到芯片的總分。上述標的基因群給予的個別加權分數分為四個等級，當基因點在80個以上的癌組織中呈現過渡表現的，加權值為4 ;當基因點在70 80個癌組織中呈現過渡表現的，カロ權值為3 ;當基因點在60 70個癌組織中呈現過渡表現的，加權值為2 ;以及當基因點在50 60個癌組織中呈現過渡表現的，加權值為I。且該分析判讀單元以接受者操作特性曲線方式算出該基因檢測芯片的陽性判讀標準值，該陽性判讀標準值為20±20%。如此，該結構提供了ー種快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易于結合自動化的WEnCA-Chipball操作平臺，易于在各個實驗操作，并易于自動化，可進行快速生物檢體檢測分析，完成傳統生醫檢測上所無法達成的目標。可于臨床上提高診斷靈敏性、特異性及準確性的同時，結合自動化操作系統更可使檢測時間大幅降低，并減少人為操作誤差，以達突破芯片檢測技術在商品化過程所面臨的瓶頸。
圖I是本發明的基因群檢測結構示意圖。
圖2是本發明基因檢測芯片的基因位置排列示意圖。圖3A是本發明的標的基因群在癌組織中過渡表現的比例示意圖。圖3B是本發明的接受者操作特性曲線示意圖。圖4是本發明癌癥組織反應后的芯片影像示意圖。圖5是本發明的檢測極限值的判讀結果示意圖。圖6是本發明的線性回歸統計分析示意圖。標號說明
基因群檢測結構100 基因檢測芯片10 檢體前處理單元20雜合反應區30
芯片呈色単元40分析判讀單元50
接受者操作特性曲線6
具體實施例方式 請參閱圖I及圖2所示，分別為本發明的基因群檢測結構示意圖及本發明基因檢測芯片的基因位置排列示意圖。如圖所示本發明為ー種基因群檢測結構(WEnCA-Chipball)100，至少包括基因檢測芯片10、檢體前處理單元20、雜合反應區30、芯片呈色単元40及分析判讀單元50所構成。上述所提的基因檢測芯片10上被覆有標定特定序列，為具有建構完整疾病診斷、藥效評估或遺傳性致病基因的篩檢芯片。該檢體前處理單元20將檢體加入裂解緩沖液打破細胞，萃取得mRNA，經由加入包含Poly-T引子的磁珠(Magnetic Particles)與細胞內的RNA結合,將磁珠上的核酸與裂解緩沖液沖洗分離，繼而洗提(Elute)出磁珠上的mRNA，并將此純化而得的mRNA經由反轉錄為cDNA后，再以酵素標定成探針(Probe)，其中，該檢體可為血液、體液、細胞培養及組織細胞等。該雜合反應區30用以將該探針與該基因檢測芯片10進行雜合(Hybridization)反應，并將未反應的探針由芯片上洗浄。該芯片呈色単元40用以將該基因檢測芯片10上雜合后的探針加上ニ氨基聯苯胺(Diaminobenzidine, DAB)呈色劑進行呈色反應(Color Development)。該分析判讀單元50內建有分析軟件與影像擷取模式及數據傳輸模式，用以影像擷取模式擷取該基因檢測芯片10呈色反應后的影像，并對呈色反應后的影像結果以分析軟件進行自動化分析，將分析后所得的偵測值以基因加權計算方式，依據每個基因對于疾病形成或抗藥性發生的重要性給予個別加權分數，經由陽性反應基因點乘上基因點的加權值而得到芯片的總分(Total Score).以上所述，構成全新的基因群檢測結構100。本發明主要是針對原尼龍膜片操作平臺的缺點，設計改進策略，例如在判讀時，針對芯片上每ー標的基因不同的重要性給予不同程度的加權(Lung Cancer Ref )，另以生物素-抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)呈色系統取代原洋地黃毒(Digoxigenin)系統,建立全新的WEnCA (Weighted Enzymatic Chip Array)操作平臺，另由于此結構易于結合流體控制平臺，以自動化操作系統進行，使得檢測時間大幅度降低，并減少人為操作差異所產生的誤差，進而突破芯片檢測技術在商品化過程所面臨的瓶頸。為進一歩了解基因群檢測結構于臨床醫學檢測上的實用性，本發明于一較佳實施例中，取得100個臨床病理科確認為大腸直腸癌(Colorectal Cancer, CRC)患者的血液檢體，以先前建構的活化K-ras致癌基因檢測芯片(Activated K_ras Detection Chip)10分別利用尼龍膜片及本結構100 (即WEnCA-Chipball)檢測檢體中K_ras路徑相關基因(K_ras Pathway Related Genes)過渡表現(Overexpression)的情形，并比較靈敏度(Sensitivity)、特異性(Specificity)及準確性(Accuracy)的差異，且分析本結構100與原尼龍膜片操作的檢測平臺于臨床應用時，操作時間與所需成本的不同，以更確立本結構100于臨床應用的發展潛力。上述建構的活化K-ras致癌基因檢測芯片10，如圖2所示，系選定與大腸直腸癌相關的標的基因群，將包含22種目標基因的標的基因群與一內部對照組(InternalControl)及一空白對照組(Blank Control)三重復點陣于ー尼龍膜片上,其中，該標的基因群為 ATP2A2、ATP6V0B、CXCR4、CYR61、RAP1B、RPL30、BMPR2、CALM2、DVL3、E2F4、SLC25A5、SPPI、CEBPB、CLSTNl、ETSI、H2AFZ、TAF12、TBX19、C0L4AI、CXCL11、LICAM 及 LRPI，且該內部對照組為P -肌動蛋白(P -actin)。
請參閱圖3A及圖3B所示，分別為本發明的標的基因群在癌組織中過渡表現的比例示意圖、及本發明的接受者操作特性曲線示意圖。如圖所示在加權冷光芯片反應的分析上，本發明首先整理芯片上22個基因點分別在100個具活化型K-ras突變的癌癥組織(cancer tissue)中過渡表現的比例，并將之分為四個等級,如圖3A所示,基因點在80個以上的癌組織中呈現過渡表現的，加權值為4 ;在70 80個癌組織中呈現過渡表現的，カロ權值為3 ;過渡表現僅在60 70個癌組織中存在的基因點，加權值為2 ;若僅能50 60個癌組織中測得過渡表現的基因點，加權值為I。經由兩組各100個反應后芯片上陽性反應的基因數，乘上加權值之后，先計算出每一反應后的芯片的總分，而后同樣以組織是否實際具有可測得的突變點作為標準參考值。經由生物統計學分析畫出接受者操作特性曲線(Receiver Operating Characteristic Curve, ROC Curve)6,如圖 3B所不，可看出當判斷此芯片陽性反應的基準值(Cutoff Value)定為20時，此芯片在組織中的檢測結果，其靈敏度可達96%，特異性亦可達97%。請參閱圖4所示，為本發明癌癥組織反應后的芯片影像示意圖。如圖所示為上述癌癥組織反應后的芯片影像圖，依帶有K-ras基因突變的癌癥組織(cancer tissue withK-ras mutation),以CAKM稱之；以及依帶有原生型K-ras基因的癌癥組織(cancer tissuewith wild type K_ras)以CAKWT稱之。其中CAKM-I及CAKM-2反應后的總分分別為36及32，皆大于20，因此芯片反應結果為陽性(Positive) ；CAKffT-1及CAKWT-2反應后的總分分別為8及6，皆小于20，因此芯片反應結果為陰性(Negative)。請參閱圖5所示，為本發明的檢測極限值的判讀結果示意圖。如圖所示在本發明基因群檢測結構的檢測極限值(Detection Limitation)的實驗結果判讀上，由圖中可見當5C. C全血分別加入100、50、25及12個具活化突變K_ras基因(activated mutant K-ras)的癌細胞所得的總分都大于20，僅在加入的細胞數為6吋，總分等于8，小于20，因此檢測極限值約2. 4cell/C. C Blood，遠較呈色型芯片所測得的5cell/C. C Blood更為靈敏。請參閱圖6所示，為本發明的線性回歸統計分析示意圖。如圖所示系本發明進一步分析上述兩種方法(即本發明與已知技木)所得結果的一致性，經線性回歸統計分析后可見，r值為0. 86，有統計學上顯著的一致性呈現，可見本發明相較已知技術明顯具有較高的靈敏度及較佳的準確度。據此，本發明揭露可提供一快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易于結合自動化的WEnCA-Chipball操作平臺，可進行快速生物檢體檢測分析，完成傳統生醫檢測上所無法達成的目標。由于本發明不需大型離心機，因此易于在各個實驗操作，并易于自動化，且采用包含Poly-T引子的磁珠以利萃取的mRNA純度更高，使反應后的芯片背景值降低，準確度高。此外，本發明以Biotin-Avidin取代Digoxigenin,不僅使用的酵素成本低，且以DAB作為呈色劑的穩定度亦高，顔色容易保存；再者，本發明亦在最后的結果判讀上以基因加權計算值的決定方式，配合ROC Curve決定陽性判讀標準，經上述臨床測試結果顯示本結構的準確度能更準確地輔助疾病的診斷。因此本發明可于臨床上提高診斷靈敏性、特異性及準確性的同時，結合自動化操作系統更可使檢測時間大幅降低，并減少人為操作誤 差，以達突破芯片檢測技術在商品化過程所面臨的瓶頸。綜上所述，本發明的基因群檢測結構，可有效改善現有技術的種種缺點，可提供一1決速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易于自動化的WEnCA-Chipball操作平臺，可進行快速生物檢體檢測分析，完成傳統生醫檢測上所無法達成的目標，進而能產生更進步、更實用、更符合使用者的所須，確已符合發明專利申請的要件，依法提出專利申請。惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之范圍；故，凡依本發明申請專利范圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之范圍內。
權利要求
1.一種基因群檢測結構，其特征在于該結構包括 基因檢測芯片，選定與癌癥相關的標的基因群，將包含多種目標基因的標的基因群與內部對照組及空白對照組三重復點陣于一尼龍膜片上，形成在該基因檢測芯片上被覆有標定特定序列； 檢體前處理單元，以包含Poly-T弓丨子的磁珠純化得檢體中的mRNA，將此mRNA經由反轉錄為cDNA后,再以酵素標定成探針； 雜合反應區，用以將該探針與該基因檢測芯片進行雜合反應； 芯片呈色單元，用以將該基因檢測芯片上雜合后的探針加上二氨基聯苯胺呈色劑進行呈色反應；以及 分析判讀單元，內建有分析軟件與影像擷取模式及數據傳輸模式，用以擷取該基因檢測芯片呈色反應后的影像，并對呈色反應后的影像結果進行自動化分析，將分析后所得的偵測值以基因加權計算方式，依據每個基因對于疾病形成或抗藥性發生的重要性給予個別加權分數，再經由陽性反應基因點乘上基因點的加權值而得到芯片的總分。
2.如權利要求I所述的基因群檢測結構，其特征在于所述基因檢測芯片為具有建構完整疾病診斷、藥效評估或遺傳性致病基因的篩檢芯片。
3.如權利要求I所述的基因群檢測結構，其特征在于所述標的基因群給予的個別加權分數分為四個等級，當基因點在80個以上的癌組織中呈現過渡表現的，加權值為4;當基因點在70 80個癌組織中呈現過渡表現的，加權值為3 ;當基因點在60 70個癌組織中呈現過渡表現的，加權值為2 ;以及當基因點在50 60個癌組織中呈現過渡表現的，加權值為I。
4.如權利要求I所述的基因群檢測結構，其特征在于所述分析判讀單元以接受者操作特性曲線方式算出該基因檢測芯片的陽性判讀標準值。
5.如權利要求4所述的基因群檢測結構，其特征在于所述陽性判讀標準值為20 ±20%。
6.如權利要求I所述的基因群檢測結構，其特征在于所述基因群檢測結構的檢測極限值為 2. 4cell/C. C Blood±20%。
7.如權利要求I所述的基因群檢測結構，其特征在于所述標的基因群為ATP2A2、ATP6V0B、CXCR4、CYR61、RAPIB、RPL30、BMPR2、CALM2、DVL3、E2F4、SLC25A5、SPPI、CEBPB、CLSTNI、ETSI、H2AFZ、TAF12、TBX19、C0L4AI、CXCL11、LICAM 及 LRPI。
8.如權利要求I所述的基因群檢測結構，其特征在于所述內部對照組為￠-肌動蛋白。
9.如權利要求I所述的基因群檢測結構，其特征在于所述檢體為血液、體液、細胞培養或組織細胞。
全文摘要
一種基因群檢測結構，至少包括基因檢測芯片、檢體前處理單元、雜合反應區、芯片呈色單元及分析判讀單元所構成。藉此，可提供一快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易于結合自動化的WEnCA-Chipball操作平臺，可進行快速生物檢體檢測分析，完成傳統生醫檢測上所無法達成的目標。
文檔編號C12M1/34GK102766573SQ20121003320
公開日2012年11月7日 申請日期2012年2月15日 優先權日2011年5月5日
發明者張惠人, 曹德安, 林繡茹 申請人:輔英科技大學附設醫院