專利名稱：一株對草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地涉及一株具有固氮作用及高抗草甘膦能力的克雷伯氏細菌及其應用。
背景技術：
充分發揮農業微生物資源寶庫的作用，積極發掘新的生防微生物資源是農業微生物資源開發研究的重要內容。近年來，大量施用化肥、農藥造成的資源浪費及土壤、地下水體污染已引起了世界各國的廣泛重視。利用生物固氮是減少氮肥施用量最為有效的途徑， 生物固氮資源的研究、開發和利用在我國農業可持續發展中占有重要地位。聯合固氮效率雖不及共生固氮高，但其分布廣，受益作物多，因而是一類不可忽視的固氮體系。目前已發現大多數具有重要價值的作物如甘蔗、水稻、小麥、玉米、牧草等禾本科植物均可與固氮菌進行聯合固氮作用。聯合固氮菌除了能為宿主提供氮素以外，還同時具有分泌生長素、溶磷、增強植株抗病性、抗逆境等多方面的促進植物生長的作用。針對長期單一施用化學肥料帶來的土壤肥力下降，農產品品質下降和農業環境污染加劇等一系列對農業可持續發展的負面影響，積極發掘和利用聯合固氮作用的潛力對農業可持續發展更具特殊的意義。草甘膦是一種內吸傳導型，廣譜滅生性除草劑，對40多種一年生，多年生，單子葉和雙子葉木本，草本植物有殺傷作用，對多年生草的地下組織破壞力尤強，廣泛用于橡膠園，果樹，茶園，桑園，甘蔗田和林業除草。草甘膦理化性質穩定，具有高效、廣譜、低毒、低殘留、不破壞土壤環境、對大多數植物具有滅生性等其它除草劑所不可比擬的優點，是全世界除草劑使用量最大的品種之一。但是草甘膦在殺滅雜草的同時對農作物同樣有著殺死作用，從而限制了其使用范圍和使用時間。草甘膦進入植物體內，抑制5—烯醇丙酮基莽草酸一 3 一磷酸合酶(EPSP合酶)，使植物不能合成它生存所必需的某些芳香氨基酸，導致植物死亡。而人及動物與植物的代謝不同不需要合成那些芳香氨基酸，因此草甘膦對人及動物安全。生物降解是草甘膦降解的最主要途徑。許多微生物對草甘膦具有降解作用，草甘膦微生物降解的主要中間產物是毒性極低的氨甲基磷酸(AMPA)，最終產生為水、二氧化碳與磷酸。在自然環境中特別是在長期使用草甘膦等除草劑地區的土壤中，存在種類繁多的能耐受或降解草甘膦的細菌。單株細菌降解草甘膦的研究從八十年代初開始，在根瘤菌科、節桿菌、肺炎克氏桿菌等均分離到草甘膦降解菌。在土壤、垃圾和水體樣品中也能分離到高抗或降解草甘膦的細菌菌株。若將來源于微生物的草甘膦抗性基因克隆后轉入農作物，可加強植物對草甘膦的抗性，或增加植物降解甘膦的能力，從而可解除草甘膦對農作物的危害。如果能有高抗或降解草甘膦的農作物出現，則既能大大地節省農業生產費用，又能極大地促進草甘膦工業的發展。
發明內容
本發明目的針對農業生產實踐的實際問題和需要，篩選出對甘蔗生長具有顯著促進作用，同時對草甘膦具有高抗活性的聯合固氮菌，為研制促甘蔗生長微生物菌劑及抗草甘膦轉基因作物的研究、應用提供新的微生物資源。本發明采取的技術方案
本發明所述的甘鹿內生固氮菌屬于克雷伯氏菌(Klebsiella sp.),該菌株已于2011年11月3日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 5439。該菌株由甘蔗根際分離獲得，通過無氮培養基篩選、固氮酶活性測定、固氮酶基因nifH擴增及序列分析，確定其為聯合固氮菌；經菌株形態、16S rDNA序列分析，把該菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)細菌。菌株命名為GG08160，其最適生長溫度為30°C，最適生長pH為7. O 7. 2。本發明菌株GG08160具有聯合固氮能力及降解無機磷的功能，對甘蔗幼苗生長具 有顯著促進作用，在草甘膦含量達250mM的培養基質中仍能正常生長，具有高抗草甘膦的活性，具有良好的應用前景，可作為植物生長的促生菌，同時可為草甘膦的生物降解研究提供新的微生物資源或基因資源，為促進農業可持續發展提供資源和保障。
圖I菌株GG08160在不同濃度草甘膦液體培養基中的生長情況；
圖2菌株GG08160在Pikovaskaia’ s培養基平板上的生長情況；
圖3菌株GG08160對甘蔗組培苗生長的促進作用(增加植株的干重);
圖4菌株GG08160對甘蔗組培苗生長的促進作用(增加植株含氮量)；
圖5菌株GG08160對甘蔗組培苗生長的促進作用(植株長勢及聯合固氮效率)。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明。實施例I本發明菌株的分離
稱取附著在甘鹿根表土 5g放入45mL滅菌水中，搖床上180r/min, 28°C恒溫振蕩30min分散微生物細胞，靜置lOmin，即得KT1稀釋液，用滅菌水10倍系列稀釋，各取100 μ L涂在Ashby 培養基(成分為蔗糖 10g, NaCl O. 2g，KH2PO4 O. 2g，MgSO4 · 7H20 O. 2g，CaSO4 · 2H20O.lg，CaCO3 5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0)平板上，在28°C培養2_3d至長出單菌落。用接種針挑取不同單菌落，在Ashby平板上劃線純化3次得到單一菌落。將純化后的單菌落接種于LB培養基(成分為胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，pH 7.0)平板上，4°C存放，供近期使用；純化的單菌落接種于LB液體培養至對數生長期，將菌液與終濃度為15%甘油混合，_80°C冰箱長期保存。實施例2本發明菌株的固氮酶活性
采用乙炔還原乙烯法(acetylene reduction assay,ARA)測定固氮酶活性。將GG08160活化后在Ashby液體培養基中生長48h，取ImL菌液接種于滅菌的含IOmL Ashby液體培養基的60mL磨口小口瓶中，培養24h后從瓶內抽出5mL氣體，然后再注入5mL乙炔氣體，繼續培養24h，用氣相色譜儀檢測乙烯生成量，以nmolC2H4/h. mL表示固氮酶活性。以巴西甘蔗內生固氮菌G. diazotrophicus PAL5為陽性對照，以接種ImL滅活菌液的處理作為空白對照。實驗結果表明，本發明菌株的固氮酶的乙炔還原乙烯活性為1632nmol C2H4/h，與陽性對照巴西甘鹿內生固氮菌模式菌株G. diazotrophicus PAL5的固氮酶活性1675nmol
C2H4/h 相當 ο實施例3本發明菌株的nifH基因及16S rDNA的克隆分析
PCR擴增模板的制備將菌株GG08160活化后接種到LB液體培養基(成分為胰蛋白胨IOg,酵母浸出物5g,氯化鈉IOg,蒸懼水IOOOmL, pH 7. O),培養20h后離心收集菌體備用。用細菌基因組DNA提取試劑盒，按產品說明書從新鮮的細菌LB培養物中提取本發明菌株的基因組DNA，保存于-20°C，DNA含量約為50_100ng/ μ L。nifH 基因分析擴增引物為 PolyF (TGCGAYCCSAARGCBGACTC)和 PolyR (ATSGCCATCATYTCRCCGGA)，PCR 反應程序為94°C 3min 預變性，然后進行 94°C Imin，55 °Clmin，72°C lmin，30個循環，最后72°C IOmin0 PCR擴增產物進行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以固氮葡糖醋酸桿菌G. diazotrophicus PAL5菌株(Gillis et al. , 1989)為陽性對照，以大腸桿菌E. coli DH5a菌株為陰性對照。將nifH擴增產物回收以后克隆到T載體上，按寶生物工程(大連)有限公司(簡稱TaKaRa)的pMDTM18_T Vector克隆試劑盒說明來操作。經PCR驗證的陽性克隆送上海生工生物工程公司測序，測序結果在GenBank登錄和比對分析。菌株的16S rDNA序列分析利用細菌16S通用引物27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)擴增細菌的 16S rRNA 基因。PCR 反應程序為94°C 3min預變性，然后進行94°C 55s, 50°C 50s, 72°C lmin，35個循環，最后72°C IOmin0 PCR擴增產物進行I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物回收以后克隆到T載體上，選擇陽性克隆送上海生工生物工程公司測序，測序結果在GenBank登錄和比對分析。nifH PCR擴增得到的片段測序分析結果表明GG08160菌株含有鑰鐵固氮酶鐵蛋白基因nifH序列(登錄號FJ823000) ；16S rDNA序列分析結果(登錄號FJ823051)表明本發明菌株與克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)細菌的同源性達98%。綜合菌株的菌落形態、nifH基因及16S rDNA的序列分析結果，將本發明菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)細菌。實施例4本發明菌株對草甘膦的耐受能力測定
以LB為基礎培養基，向LB液體培養基中加入草甘膦銨鹽(購自廣西自主化工有限公司)，配制含草甘膦終濃度分別為0，50，100，150，200，250，300mM的系列培養基。菌株GG08160接種到LB液體培養基于30°C，180rpm培養24h作為母液，取20 μ L母液加入50mL上述含不同濃度草甘膦的培養基中，30°C, 180rpm條件下培養48h后,測定培養液的OD600。測定結果見圖1，GG08160對草甘膦具有較強的耐受能力，在草甘膦濃度達250mM的培養基上能保持良好的生長，在300mM草甘膦培養上仍有少量生長。實施例5本發明菌株對無機磷的降解特性
待測菌株活化培養后取Iml菌液，IOOOOrpm離心5min，除去上清，然后用滅菌水IOOOOrpm離心5min洗菌2次，用滅菌水稀釋10倍得到菌懸液。取供試菌株菌懸液10 μ I點接種于盛有 Pikovaskaia’s 培養基(成分葡萄糖 10g, (NH4)2SO4 0. 5g，NaCl 0. 3g，KClO. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 3g, MnSO4 · 4H20 0. 03g, FeSO4 · 7H20 0. 03g, Ca3(PO4)2 5g,瓊脂粉 15g,蒸餾水1000mL，pH 7.0)的培養皿中，重復4次，置于28°C下培養3d。觀察接種菌株周圍有無透明圈形成，測量透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的大小，根據溶磷圈的透明度D/d的比值大小判斷細菌解磷能力強弱。實驗結果見圖2,GG08160菌株可在Pikovaskaia’ s平板培養基上形成透明圈,表明該菌株可分泌一些酸性物質，并向周圍的培養基擴散，使菌落周圍的磷酸鹽[Ca3 (PO4) 2]溶解，即該菌株具有降解無機磷特性，菌株的溶磷圈直徑D (菌落+透明圈)與菌落直徑(d)的比值(D/d)為I. 32。實施例6本發明菌株對甘蔗組培苗生長的促進作用
供試菌株分別為GG08160以及巴西甘鹿內生固氮菌G. diazotrophicus PAL5菌株。以蛭石甘蔗組培苗移栽后的栽培基質，按比例每kg基質加入IOmg (15NH4) 2S04 (15N原子百分超
10.11)，分裝到塑料盆中。將供試菌株分別活化后在LB液體培養基上培養過夜，離心收集菌體，用滅菌水懸浮離心清洗2次后稀釋到每毫升1-2X IO8個細胞。將煉苗后生長一致的甘蔗組培苗移栽到裝有栽培基質的塑料盆中，每盆澆入上述供試菌株GG08160的菌懸液IOOmL,置于28V、光周期14h光-IOh暗光照培養箱培養。IOd后再以IOOmL同樣濃度的菌懸液灌根接種，繼續在限菌條件下培養。以接種等量同樣濃度的PAL5菌株的菌懸液為陽性對照，空白對照接種等量滅菌水。50d后對甘蔗組培苗的生長情況進行記錄，收獲植株并洗凈栽培基質，冷凍干燥后測定植株干重、含氮量及15N含量，計算固氮效率。固氮效率根據公式Ndfa =100X [l-(atom% 15N接種植株/atom% 15N對照植株)]計算。試驗測定結果表明接種GG08160能顯著促進甘蔗組培苗的生長(圖3_圖5)，甘蔗組培苗的干重和總氮含量分別比空白對照增加了 42. 56%和38. 64% (圖3、圖4);植株從空氣中獲得氮的百分率(固氮效率)平均為9. 75% (圖5);而接種PAL5菌株的甘蔗組培苗的干重及總氮含量增長率分別為29. 35%和35. 25%，固氮效率為10. 09%。
權利要求
1.一株對草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌，其特征在于菌株命名為GG08160，具有高抗草甘膦的活性，能與甘蔗聯合固氮并顯著促進甘 蔗幼苗的生長。
全文摘要
本發明涉及一株具有固氮作用及高抗草甘膦能力的克雷伯氏細菌及其應用。該菌株由甘蔗根際分離獲得，通過無氮培養基篩選、固氮酶活性測定、固氮酶基因nif H擴增及序列分析，確定其為聯合固氮菌；經菌株形態、16S rDNA序列分析，把該菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)細菌。菌株命名為GG08160。本發明菌株具有聯合固氮能力及降解無機磷的功能，對甘蔗幼苗生長具有顯著促進作用，在草甘膦含量達250mM的培養基質中仍能正常生長，具有高抗草甘膦的活性，具有良好的應用前景，可作為植物生長的促生菌，同時為草甘膦的生物降解研究提供新的微生物資源或基因資源，為促進農業可持續發展提供資源和保障。
文檔編號C12R1/22GK102965296SQ20121002982
公開日2013年3月13日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者胡春錦, 李楊瑞, 史國英, 林麗, 魏源文, 鄧智年, 李楠 申請人:廣西壯族自治區農業科學院微生物研究所