專利名稱：薇甘菊萎蔫病毒基因診斷試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及植物病毒的診斷試劑盒及檢測方法，具體是針對薇甘菊萎蔫病毒 (Mikania micrantha wilt virus, MMWV)的基因診斷試劑盒及檢測方法。
背景技術：
薇甘菊(Mikaniamicrantha H. B. K.)是菊科(Compositae)假澤蘭屬 (Mikaniaffilld)多年生藤本植物。目前已生物入侵到我國華南地區，對生態環境造成嚴重的危害。薇甘菊萎蔫病毒屬于豇豆花葉病毒科(Comoviridae)蠶豆病毒屬(Fabavirus)。薇甘菊感染該病毒后出現葉片萎蔫、頂枯、節間矮化等癥狀，可以嚴重地抑制薇甘菊的生長。 該病毒與蠶豆萎蔫病毒-1 (Broad bean wilt virus_l，BBWV_l)和蠶豆萎蔫病毒-2 (Broad bean wilt virus-2,BBWV-2)有較高的遺傳同源性，可以感染蔬菜作物、豆科作物等多種重要的經濟作物，造成嚴重地經濟損失。目前對于薇甘菊萎蔫病毒尚無有效的檢測方法。因此簡便快速、特異性強、靈敏度高的診斷試劑盒及其方法是早期快速診斷薇甘菊萎蔫病毒及有效監控該病毒傳播途徑的有效方法。聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是利用DNA片段兩側的單鏈引物，在體外快速擴增特異DNA片段的技木。該方法具有快速、靈敏和特異性強等特點，被廣泛應用到各項科研工作和生產實踐中。
發明內容
為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種薇甘菊萎蔫病毒基因診斷試劑盒。本發明的另一目的在于提供ー種利用上述試劑盒檢測薇甘菊萎蔫病毒基因的方法。本發明的目的通過下述技術方案實現一種薇甘菊萎蔫病毒基因診斷試劑盒，包含兩對特異性引物，分別是MMWV RNAl F :5，-TGAGGAATTGGGAAGGTC ；MMWV RNAl R :5，-CGACTCGGCGTCATAAAC ；MMWV RNA2 F :5，-GGAATCCCTGAAACTATGC ；MMWV RNA2 R :5，-TGCTCCACCAATCACAACA ；上述兩對弓I物是以MMWV RNAl和MMWV RNA2的保守區域設計的，可以特異性地擴增攜帶MMWV病毒的待測樣品的相關基因片段；所述的薇甘菊萎蔫病毒基因診斷試劑盒還包括dNTP混合物、含mg2+的10倍反應緩沖液和聚合酶；所述的聚合酶優選TaqE。一種應用上述試劑盒檢測薇甘菊萎蔫病毒的方法，包括以下步驟(1)按照常規通用方法提取待測植物樣品的RNA ；
(2)往步驟(1)得到的RNA中分別加入引物MMWV RNAl FiPMMWVRNAl R、引物MMWV RNA2 F 和 MMWV RNA2 R, PCR 擴增后分別得到 MMWV RNAl cDNA 和 MMWV RNA2 cDNA ；(3)往 MMWV RNAl cDNA 中加入引物 MMWV RNAl F 幣 MMWV RNA1R，進行 PCR 擴增得到擴增產物1;往MMWV RNA2 cDNA中加入引物MMWVRNA2 F和MMWV RNA2 R，進行PCR擴增得到擴增產物2 ；將兩種擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，若擴增產物1在329bp出現明亮的條帶，同時擴增產物2在364bp出現明亮的條帶，則MMWV為陽性，說明待測植物樣品中攜帯薇甘菊萎蔫病毒；否則MMWV為陰性，表明待測植物樣品沒有攜帯薇甘菊萎蔫病毒。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果本發明的薇甘菊萎蔫病毒的基因診斷試劑盒及檢測方法，是以MMWVRNA1和MMWV RNA2的基因保守區域設計的兩對特異性引物為主體而設計的。利用兩對引物，可以特異性地擴增攜帯MMWV病毒的待測樣品的相關基因片段，所建立的PCR反應體系保證檢測結果的快速性、穩定性和準確性。因此使用本發明的試劑盒及檢測方法，可以簡便、快速、靈敏地檢測感染MMWV的樣品，可以用于該病毒的跟蹤檢測，潛在寄主植物的檢測，避免病毒的傳播流行，加強對薇甘菊生物入侵的生態管理，具有廣闊的應用前景。
圖1是PCR擴增產物電泳結果圖。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進ー步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
實施例1
薇甘菊萎蔫病毒的基因診斷試劑盒，包括以下組分
1).模板抽提液1，1瓶，內裝Trizol ；
2).去蛋白液II，1瓶，內裝氯仿；
3).RNA沉淀液III，1瓶，內裝異丙醇；
4).洗滌液IV，1瓶，內裝75%乙醇；
5).洗脫液V，1瓶，內裝滅菌雙蒸水；
6).反應液VI，1瓶，內裝PCR反應液，包括ddH20、dNTP、含mg2+的IOXBuffer, TaqE,弓丨物 MMWVRNA1F 為5，-TGAGGAATTGGGAAGGTC 禾Π MMWVRNA1R 為
5，-CGACTCGGCGTCATAAAC ；7).反應液VII，1瓶，內裝PCR反應液，包括ddH20、dNTP、含mg2+的 10XBuffer, TaqE,弓| 物 MMWVRNA2F 為5，-GGAATCCCTGAAACTATGC，MMWVRNA2R 為 5，-TGCTCCACCAATCACAACA ；8).陽性對照液VIII，1瓶，內裝MMWV RNAl和MMWV RNA2相關基因片段的質粒 DNA ；9). ー塊泡沫板，泡沫板上有不少于上述小瓶數量的圓孔，各小瓶可以分別置于相應的小孔中；10).盒子，可容納上述所有試劑和材料等。
該試劑盒中的陽性對照液VIII是PCR擴增MMWV RNAl和MMWV RNA2后，分別得到 MMWV RNAl cDNA (序列為 SQE ID NO. 5)和 MMWV RNA2cDNA (序列為 SQE ID NO. 6) JfMMWV RNAl cDNA和MMWV RNA2 cDNA分別連接到pMD18_T載體上，轉入大腸桿菌E. coli，經氨芐青霉素培養基平板培養，挑取陽性克隆，測序分析驗證，提取其質粒DNA，溶于50 μ 1 ddH20 中即為陽性對照液。實施例2一種應用實施例1的試劑盒檢測薇甘菊萎蔫病毒的方法，包括以下步驟1).取待測植物樣品，加入適量液氮充分研磨至粉末狀；2).將研磨好的粉末移至RNase-free的2ml滅菌離心管中，加入Iml模板抽提液 I液，充分混勻，室溫靜置6min ；3).加入200 μ 1去蛋白液II液，蓋緊離心管，劇烈震蕩30s充分混勻，室溫靜置 5min ；4) · 40C，12000r/min 離心 12min ；5).取上清液至另ー RNase-free的2ml滅菌離心管中，加入500 μ 1 RNA沉淀液 III液，輕輕混勻，室溫下放置IOmin ；6) · 40C，12000r/min 離心 12min ；7).棄上清，加入Iml洗滌液IV沖洗，12000r/min離心12min，沖洗兩次；8).棄上清，在超凈工作臺上吹干或室溫下風干aiiin ；9).加入20 μ 1洗脫液V液重懸至充分溶解，得到待測植物樣品的RNA ；10).在兩個PCR管中分別加入步驟(9)待測植物樣品的RNA 1μ 1和PCR反應液 VI 9 μ 1、步驟(9)待測植物樣品的RNA 1μ 1和PCR反應液VII 9 μ 1，混勻后離心數秒，進行 PCR 擴增，37°C 20min，98°C 5min ;4°C 保存；分別得到 MMWVRNA1 cDNA 和 MMWV RNA2 cDNA ；11).取 2 μ 1 步驟(10)得到的 MMWV RNAl cDNA 與 PCR 反應液 VI 18 μ 1 混合； 取2 μ 1步驟(10)得到的MMWV RNA2 cDNA與PCR反應液VII 18 μ 1混合；進行PCR擴增， 940C 5min 預變性；94°C 30sec，57°C 30sec，72°C Imin ；；35 個循環，72°C 10min，4°C保存。擴增后分別得到擴增產物1和2。12).分別取5 μ 1擴增產物1、擴增產物2，加入1 μ 1溴酚藍混勻，經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳25 40min，電泳結果如圖1 (泳道1為擴增產物1 ；泳道3為擴增產物2 ；泳道2 和4分別為相應的陰性對照，即不加cDNA模板的擴增產物)所示，擴增產物1在329bp出現明亮的條帶，同吋，擴增產物2在364bp出現明亮的條帶，待測樣品MMWV為陽性，說明待測植物樣品中攜帯薇甘菊萎蔫病毒。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種薇甘菊萎蔫病毒基因診斷試劑盒，其特征在于包含兩對特異性引物，分別是MMWV RNAl F :5’ -TGAGGAATTGGGAAGGTC ；MMWV RNAl R :5’ -CGACTCGGCGTCATAAAC ；MMWV RNA2 F :5’ -GGAATCCCTGAAACTATGC ；MMWV RNA2 R :5’ -TGCTCCACCAATCACAACA。
2.根據權利要求1所述的薇甘菊萎蔫病毒基因診斷試劑盒，其特征在于所述的薇甘菊萎蔫病毒基因診斷試劑盒還包括dNTP混合物、含mg2+的10倍反應緩沖液和聚合酶。
3.根據權利要求2所述的薇甘菊萎蔫病毒基因診斷試劑盒，其特征在于所述的聚合酶為iTaqE。
4.ー種應用權利要求1-3任一項所述的試劑盒檢測薇甘菊萎蔫病毒的方法，其特征在于包括以下步驟(1)提取待測植物樣品的RNA；(2)往步驟(1)得到的RNA中分別加入引物MMWVRNAl FiPMMWVRNAl R，引物MMWV RNA2 F 和 MMWV RNA2 R, PCR 擴增后分別得到 MMWV RNAl cDNA 和 MMWV RNA2 cDNA ；(3)往MMWVRNAl cDNA中加入引物MMWV RNAlF和MMWV RNA1R，進行PCR擴增得到擴增產物1 ；往MMWV RNA2 cDNA中加入引物MMWVRNA2 F和MMWV RNA2 R，進行PCR擴增得到擴增產物2 ；將兩種擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，若擴增產物1在329bp出現明亮的條帶， 同時擴增產物2在364bp出現明亮的條帶，則MMWV為陽性，說明待測植物樣品中攜帯薇甘菊萎蔫病毒；否則MMWV為陰性，表明待測植物樣品沒有攜帯薇甘菊萎蔫病毒。
全文摘要
本發明公開了一種薇甘菊萎蔫病毒基因診斷試劑盒及檢測方法，該試劑盒包含兩對特異性引物，分別是MMWV RNA1 F5’-TGAGGAATTGGGAAGGTC；MMWV RNA1 R5’-CGACTCGGCGTCATAAAC；MMWV RNA2 F5’-GGAATCCCTGAAACTATGC；MMWV RNA2 R5’-TGCTCCACCAATCACAACA。檢測方法包括以下步驟(1)提取待測植物樣品的RNA；(2)往RNA中分別加入兩種引物，PCR擴增后分別得到兩種cDNA；(3)往兩種cDNA中分別加入兩種引物，PCR擴增得到兩種擴增產物；電泳，若擴增產物1在329bp出現明亮的條帶，同時擴增產物2在364bp出現明亮的條帶，則MMWV為陽性，說明待測植物樣品中攜帶薇甘菊萎蔫病毒。本發明的試劑盒和方法可以特異性地擴增攜帶MMWV病毒的待測樣品的相關基因片段，所建立的PCR反應體系保證檢測結果的快速性、穩定性和準確性。
文檔編號C12R1/94GK102534049SQ20121002797
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月9日 優先權日2012年2月9日
發明者宋圓圓, 曾任森, 梁笑婷, 王瑞龍, 蘇貽娟, 辛效威, 駱世明 申請人:華南農業大學