專利名稱：一種含抗體模擬物的新型抗生素及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，特別涉及一種含抗體模擬物的新型抗生素及其制備方法與應用。
背景技術：
自1944年青霉素等抗生素投入使用以來，不僅僅是腦膜炎雙球菌，其它很多威脅生命的致病菌，如金葡球菌、肺炎鏈球菌、綠膿桿菌、結核桿菌都已對其產生了耐藥性。據美國疾病控制中心(⑶C)歷年發表的有關報告預測，再過10年至20年，這些抗生素將可能完全失效。目前常用的抗生素主要通過抑制細胞壁合成、抑制或干擾細菌的核酸和蛋白質代謝與合成途徑來達到抗菌目的。然而這些抗菌方式容易誘導細菌發生突變而產生耐藥性。 因此人們一直在致力于開發新型的抗生素。模仿同種異株細菌之間互相殺傷的工作方式來開發新型抗生素是比較有前途的方向之一。自然界中有不少細菌毒素直接在細菌胞膜上形成離子通道來殺死細菌。其模式標本就是大腸桿菌分泌的一種細菌毒素-大腸菌素。其中大腸菌素Ia自1952年被Jacob發現之后，經過數代人的努力，1996年終于揭示了大腸菌素Ia在人工脂質雙分子膜上所形成離子通道開放和關閉時的跨膜立體結構Oiiu et al, Major transmemebrane movement soociated with colicin Ia channel gating. J. Gen. Physiology, 107 :313-3 (1996))，為在分子水平上設計和制備新型的抗菌素奠定了理論 ■石出。如上所述，大腸菌素是一種理想的離子通道抗生素原型，但野生型大腸菌素只能作用于同種異株的大腸桿菌，因此必需改變它的靶向性，才能使大腸菌素轉而攻擊其它致病菌；膜孔蛋白Porin是存在于細菌質膜的外膜、線粒體和葉綠體的外膜上的通道蛋白，它們允許較大的分子通過，，具有較強的免疫原性，能在宿主體內誘導出特異性的高水平的單抗，如能利用對抗細菌表面Porin蛋白的抗體作為原型，設計出具有更理想識別性能的抗體模擬物，用這個模擬物來改變大腸菌素的靶向性，應該是一種理想的抗生素開發方向。
發明內容
本發明針對上述領域的空白，提供一種的新型抗生素，該抗生素的殺菌能力是常用抗生素千倍以上，由于其作用機理特殊，因此致病菌很難產生耐藥性，殺菌過程中不會傷害人體正常細胞。一種含抗體模擬物的新型抗生素，由大腸菌素El、la、lb、A、B、N或其水性孔道結構域及共價連接在所述大腸菌素或其水性孔道結構域的肽鏈羧基端的抗體模擬物構成，所述抗體模擬物是由免疫球蛋白的VhCDRI的羧基端連接VhFR2的氨基端，VhFR2的羧基端再連接&CDR的氨基端構成；所述免疫球蛋白特異性識別細菌膜孔蛋白。所述細菌指腦膜炎雙球菌，所述膜孔蛋白指腦膜炎雙球菌表面的膜孔蛋白PorA。所述免疫球蛋白指在具有PUBMED登錄號為2MPA_H所記載的氨基酸序列的肽鏈與具有登錄號為2MPA_L所記載的氨基酸序列的肽鏈共價結合而得的抗體蛋白。所述大腸菌素為la。一種肽鏈分子，其特征在于由大腸菌素El、la、lb、A、B、N或其水性孔道結構域的肽鏈及共價結合在其羧基端的抗體模擬物肽鏈連接而成，所述抗體模擬物肽鏈由免疫球蛋白的三個區域VHOTRl、VHFR2、VfDR3的肽鏈順次以羧基端連接下一區域肽鏈的氨基端構成； 所述免疫球蛋白特異性識別細菌膜孔蛋白。所述肽鏈分子，具有kq ID No. 6所示氨基酸序列。編碼上述肽鏈分子的核苷酸序列。所述核苷酸序列，如kq ID No. 5所示。包含上述核苷酸序列的重組表達載體。上述的新型抗生素的制備方法，指將上述的重組表達載體導入到表達系統中進行表達；分離純化表達的多肽獲得抗生素。所述的新型抗生素在制備抗細菌藥物中的應用。所述抗細菌藥物指抗腦膜炎雙球菌、抗耐萬古霉素腸球菌、抗耐甲氧西林金葡菌或抗多重耐藥綠膿桿菌的藥物。本發明利用大腸菌素能在靶細菌膜上形成離子通道，使靶細胞內胞質泄漏而死， 而本發明中起靶向性作用的結構是對抗細菌表面膜孔蛋白即Porin蛋白的免疫球蛋白的部分區域被重構后獲得的模擬抗體物，包含該免疫球蛋白的重鏈可變區的第一互補決定區 VhCDRI、重鏈可變區的第二骨架區VHFR2、輕鏈可變區的第三互補決定區\CDR3，三個區域順次以羧基端鏈接下一區域的氨基端構成VhCDR1-VhFR2-\CDR3的線性分子；眾所周知，免疫球蛋白起識別作用的活性區域稱為互補決定區，互補決定區僅有幾個到十幾個氨基酸組成，與完整的免疫球蛋白或者目前有報道的單鏈抗體seFv、Fab等人工改造抗體相比，本發明的分子量極小，組織透過性好，同時由于其結構簡單，去除了完整免疫球蛋白分子的大部分框架結構及Fc段，使其對患者的免疫原性大大降低，非常利于帶領大腸菌素到達致病部位識別致病菌。在治療中，大腸菌素被引向致病菌細胞膜表面，大腸菌素在靶細菌膜上形成離子通道，使靶細胞內胞質泄漏而死，對于目前已經產生耐藥性的菌株也具有相同的殺菌能力。由于其識別位點為細菌表面特有的抗原物質，人體組織細胞膜上不存在這樣的識別位點，因此其對于人體是安全的。相對于其他易于產生耐藥性的抗生素，本發明的抗生素， 由于其起靶向作用的抗體模擬物僅僅需將大腸菌素引向致病菌就完成了任務，我們并不需要通過膜孔蛋白位點作用致死細菌，而是通過大腸菌素作用于細菌的生物膜，使生物膜產生離子通道導致細胞泄漏而死，傳統的細菌耐藥性一般通過改變膜孔蛋白的結構對抗生素進入細菌細胞內造成障礙而產生耐藥性，而本發明僅僅需要膜孔蛋白的抗體識別位點的活性即可到達殺菌的目的，可以說，是一種聲東擊西的策略，即識別膜孔蛋白位點，但大腸菌素結合在細胞膜的另外一個位點形離子通道致死細菌，真正的作用位點不在Porin蛋白， 因此細菌很難通過變異、進化而丟掉或改變膜孔蛋白這種生存必須的結構，因此細菌很難對本發明的抗生素產生耐藥性。由于本發明根據不同細菌表面膜孔蛋白的多樣性及與其識別的免疫球蛋白的多樣性，根據本發明這一設計構思獲得的新型抗生素也是多樣的。由于腦膜炎雙球菌引起的腦膜炎對國內外的嬰兒以及青少年的健康造成了極大的威脅，且其對目前常用藥的抗藥性表現非常明顯，為了有效抑制該菌而使藥劑量越來越高，這嚴重危害患者健康，因此，發明人采用本發明的構思，針對腦膜炎雙球菌的膜孔蛋白 PorinA的抗體，其重鏈肽鏈的PUBMED登錄號為2MPA_H，輕鏈肽鏈的PUBMED登錄號為2MPA_ L，進行重構獲得抗體模擬物，即如^^ ID No. 2所示的氨基酸序列；并可操作地連接在大腸菌素Ia的肽鏈的羧基端，獲得具有如^^ ID No. 6所示的氨基酸序列的新型抗生素 PMC-AMl0如圖7所示，在腦膜炎雙球菌致死量感染小鼠的存活實驗中，注射本發明抗生素 PMC-AMl的小鼠的8天存活率為90%，說明本發明的抗生素比現用抗生素青霉素、慶大霉素等具有無法比擬的抗菌活性和體內保護效果；同時，通過殺菌效果比較，如圖6A所示，比較本發明的抗生素PMC-AMl與頭孢它啶、氨芐青霉素對腦膜炎雙球菌的最低抑菌濃度(MIC 值)，實驗結果顯示PMC-AMl的MIC 0. llnMol，頭孢它啶的MIC 3. 02nMol，氨芐青霉素的 MIC1. 35nMol ；說明其殺菌能力明顯高于目前常用于抑制腦膜炎雙球菌的抗生素。發明人用本發明的新型抗生素PMC-AMl對其他目前產生耐藥性嚴重的致病菌進行試探性實驗，發現PMC-AMl還對多重耐藥綠膿桿菌、耐萬古霉素腸球菌、耐甲氧西林金葡菌有極強的抗菌效力，如圖5所示，PMC-AMl對多重耐藥綠膿桿菌的殺菌效果比頭孢它啶、 左氧氟沙星、慶大霉素等現用抗菌素強127 3800倍以上；PMC-AMl對耐萬古霉素腸球菌、 耐甲氧西林金葡菌有明顯的抑制效果，如圖6B、C所示。本發明的抗生素可用于制備抗菌藥物，特別是在制備抗腦膜炎雙球菌、抗綠膿桿菌、抗耐萬古霉素腸球菌及抗耐甲氧西林金葡菌的藥物中的應用。可將編碼本發明抗生素的核苷酸克隆到表達載體中構建重組表達載體，這些載體可在宿主中表達融合蛋白，分離融合蛋白獲得本發明的抗生素蛋白。根據密碼子的兼并性，編碼本發明的抗生素或者抗體模擬物的核苷酸序列是可調整的，可根據宿主細胞對密碼子的偏好性調整核苷酸序列，只要編碼的氨基酸不變，都屬于本發明要求保護的范圍。
圖1含抗體模擬物和大腸菌素Ia的重組質粒pBHC-PorAl的結構其中抗體模擬物的肽鏈連接在Ia的肽鏈羧基端，抗體模擬物的氨基酸序列如Seq ID No. 2 所示。圖2含抗體模擬物肽鏈和大腸菌素Ia的重組質粒pBHC_PorA2的結構其中抗體模擬物肽鏈連接在Ia的羧基端，抗體模擬物肽鏈是重鏈可變區的第一互補決定區的羧基端鏈接重鏈第二骨架區，輕鏈可變區的第三互補決定區的肽鏈羧基端氨基酸鏈接在重鏈第二骨架區的羧基端氨基酸上，如kq ID No. 4所示。圖3本發明新型抗生素的結構其中T和R是大腸菌素Ia位于氨基端的兩個信號識別結構域；channel-forming 是大腸菌素Ia位于羧基端的形成離子通道結構域；AM是抗體模擬物。圖4為本發明新型抗生素PMC-AMl對腦膜炎雙球菌的抑制實驗圖中曲線從左到右依次為對照，5 μ g/ml氨芐青霉素，5 μ g/ml PMC-AM2, 5 μ g/ mlPMC-AMl，10 μ g/ml PMC-AMI。本圖橫座標為細菌生長時間，單位為小時；縱座標為培養液600nm光密度，顯示細
菌生長數量。
圖5瓊脂二倍稀釋法測定新型抗生素的最低抑菌濃度(MIC)平皿顯示(Con)，空白對照，(A)，頭孢它啶為16μ g/ml、(B)，左氧氟沙星為8 μ g/ ml、(C)，慶大霉素大于512yg/ml、(D)，新型抗生素(PMC-AMl)對多重耐藥綠膿桿菌的最低抑菌濃度為8yg/ml。圖6本發明新型抗生素與常用抗菌素對耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA-42)、耐萬古霉素腸球菌(ATCC 700802)、多重耐藥綠膿桿菌(華西醫院臨床分離株13578)和腦膜炎雙球菌(中國菌種保存中心四33幻最小抑菌濃度的比較實驗縱座標為最小抑菌濃度(nMol)；其中A圖為腦膜炎雙球菌，(l)PMC-AMl，MIC = 0. 1 InMol, (2)頭孢它啶，MIC = 3. 02nMol, (3)氨節青霉素，MIC = 1. 35nMol ；B圖為耐萬古霉素腸球菌，(1)PMC-AMl，MIC = 0. 23nMol，(2)萬古霉素，MIC = 21. 54nMol, (3)氨節青霉素，MIC = 10. 78nMol ；C圖為耐甲氧西林金葡菌，(1)PMC-AMl，MIC = 0. 06nMol, (2)氨芐青霉素，MIC = 21. 55nMol, (3)苯唑西林，MIC = 14. InMol ；D圖為多重耐藥綠膿桿菌，(l)PMC-AMl, MIC = 0. 9InMol, (2)左氧氟沙星，MIC = 43. 2nMol, (3)頭孢它啶，MIC = 29. 3nMol, (4)慶大霉素，MIC > 889. 4nMol。圖7本發明新型抗生素與野生型大腸菌素、抗金葡菌多肽(ZL 01128836. 1)對耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA-42)、耐萬古霉素腸球菌(ATCC 700802)、多重耐藥綠膿桿菌 (華西醫院臨床分離株13578)抑制作用的比較之生存曲線縱座標為最小抑菌濃度(nMol)；其中A圖為耐萬古霉素腸球菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0. 9InMol, (2)野生型大腸菌素 Ia，MIC = 0. 9InMo 1, (3) PMC-AMl, MIC = 0. 23nMol ；B圖為耐甲氧西林金葡菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0. 06nMol, (2)野生型大腸菌素 Ia，MIC = 0. 23nMol, (3)PMC-AMI, MIC = 0. 06nMol ；C圖為多重耐藥綠膿桿菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0. 9InMol, (2)野生型大腸菌素 Ia, MIC = 0. 9InMol, (3) PMC-AMl, MIC = 0. 23nMol。圖8本發明新型抗生素對腦膜炎雙球菌感染動物的體內保護試驗之生存曲線橫座標為鼠存活時間，單位為天；縱座標為動物存活數，單位為每只鼠1) PMC-AMl，本發明新型抗生素；2)Gen，慶大霉素；3) PEN，青霉素；4) Con.，對照； 所有藥物注射濃度均為1. 5mg/kg。
具體實施例方式結合附圖，通過本發明較佳實施例的描述具體說明本發明。實施例1表達新型抗生素的質粒的構建和新型抗生素制備原始質粒為裝載了大腸菌素和immunity蛋白基因的pSELECT -l質粒(8. 3kb)。 經雙鏈寡聚核苷酸點突變技術(QuickChange Kit, Strategene公司)將編碼抗體模擬物基因，如^^ ID No. 1和％(1 ID No. 3所述的核苷酸序列分別插入到大腸菌素變構多肽基因的6 位點上，制備了新型抗生素的突變質粒pBHC-PorAl、pBHC-PorA2 (如圖1-圖2所示)。突變質粒轉染入E. coli BL-21工程菌里制備新型抗生素。
突變禾呈序按 Strategene QuickChange SiteDirected Mutagenesis Kit (catalog #200518)藥箱手冊進行即1.準備點突變反應物5ul IOX buffer2ul (IOng)裝載了大腸菌素變構多肽和immunity蛋白基因的原始質粒1. 25ul (125ng)設計的5’ _3’寡聚核苷酸引物(見所列引物序列)1. 25ul (125ng)設計的3’ _5’寡聚核苷酸引物(見所列引物序列)Iul dNTP雙蒸水50ulIul pfu(除質粒、引物和雙蒸水外，均為藥箱所備試劑)2.進行PCR擴增，擴增條件變性950C，35秒，退火53°C，70秒，延伸68°C，17分， 共20個循環；3.加入Dpn 1內切酶Iul消化母體DNA鏈后(37°C，1小時)，取Iul反應物與 XLl-Blue感受態細胞50ul冰孵30分鐘，熱沖擊42°C，45秒，再置入冰中2分鐘；4.加入NZY培基0. 5ml，220rpm，37°C搖菌1小時，取50_100ul反應物鋪板(LB培基加瓊脂，加50ug/ml氨芐青霉素，37 °C過夜)；5. 18小時后挑菌，提取質粒后測序確定突變成功；6.將突變質粒IOOng與制備的BL-21工程菌感受態細胞40ul冰孵5分鐘，熱沖擊 42°C，30秒，再置入冰中2分鐘，加入SOC培基160ul，220rpm，37°C搖菌1小時后鋪板(LB 培基加瓊脂，加50ug/ml氨芐青霉素，37°C過夜)，挑取單克隆菌落大量增菌；7.大量增菌，8-10 升 FB 培基，250rpm，30°C，3-4 小時；升溫至 42°C，250rpm 生長 0. 5小時；降溫至37°C,250rpm生長1. 5小時；4°C，6000g，20分鐘離心沉淀菌體，取4°C， 50mM硼酸緩沖液(pH 9. 0, 2mMEDTA) 80-100ml懸浮菌體，加入PMSF 50ug后超聲破碎菌體 (4°C,400ff, 1分鐘，重復4-5次，間歇2-3分鐘確保菌液溫度)，高速離心沉淀破碎的菌體 (475, OOOg,90分鐘)，取上清加入硫酸鏈霉素500萬單位沉淀DNA0°C攪拌1小時)， 10，000g, 40C，10分鐘離心沉淀后，取上清裝入分子量15，000透析袋于4°C，50mM硼酸緩沖液10升透析過夜后，再次10，000g, 40C，10分鐘離心沉淀，取上清上樣于CM離子交換柱，充分沖洗后，0.3M NaCl+50mM硼酸緩沖液洗脫即可得到所制備的新型抗生素。對應于以上2 種質粒，可分別獲得PMC-AMl和PMC-AM2兩種抗生素，其氨基酸序列分別如kq ID No. 6、 Seq ID No. 8 所示。其中AMl是重鏈可變區的第一互補決定區、重鏈第二骨架區、輕鏈可變區第三互補決定區，三個區域順次以羧基端鏈接下一區域的氨基端，氨基酸序列如^^ ID No. 2所示；AM2是重鏈可變區的第一互補決定區的羧基端鏈接重鏈第二骨架區，輕鏈可變區的第三互補決定區的肽鏈羧基端氨基酸鏈接在重鏈第二骨架區的羧基端氨基酸上，氨基酸序列如kqlD No. 4所示。將PMC-AM2作為PMC-AMl的對照，驗證本發明設計的抗體模擬物的氨基酸區段之間在不同連接方式下產生的抗生素的功能。上述制備質粒中所設計的寡聚核苷酸引物序列如下
5，-3，(SEQ ID NO. 9)gcg aat aag ttc tgg ggt att TCT TAT TGG CTG CAT TGG ATT AM CAG taa ata aaa tat aag acaggc3，-5，(SEQ ID NO. 10)gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG TTT AAT CCA ATG CAG CCA ATA AGA aat acc cca gaa ctt att cgc5，-3，(SEQ ID NO. 11)tgg ctg cat tgg att aaa cag AGA CCT GGT CAG GGA CTG TGG ATC GGA taa ata aaa tat aag acaggc3，-5，(SEQ ID NO. 12)gcc tgt ctt ata ttt tat tta TCC GAT CCA CAG TCC CTG ACC AGG TCT ctg ttt aat cca atg cag cca5，-3，(SEQ ID NO. 13)ggt cag gga ctg tgg ate gga TCT CAG TCC ACG CAT GTG CCG AGA ACC taa ata aaa tat aag acaggc3，-5，(SEQ ID NO. 14)gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT TCT CGG CAC ATG CGT GGA CTG AGA tcc gat cca cag tcc ctgaccpBHC-PorA 25，-3，(SEQ ID NO. 15)gcg aat aag ttc tgg ggt att TCT TAT TGG CTG CAT TGG ATT AM CAG taa ata aaa tat aag acaggc3，-5，(SEQ ID NO. 16)gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG TTT AAT CCA ATG CAG CCA ATA AGA aat acc cca gaa ctt att cgc5，-3，(SEQ ID NO. 17)tgg ctg cat tgg att aaa cag AGA CCT GGT CAG GGA CTG TGG ATC GGA taa ata aaa tat aag acaggc3，-5，(SEQ ID NO. 18)gcc tgt ctt ata ttt tat tta TCC GAT CCA CAG TCC CTG ACC AGG TCT ctg ttt aat cca atg cag cca5，-3，(SEQ ID NO. 19)ggt cag gga ctg tgg ate gga ACC AGA CCG GTG CATACG TCC CAG TCT taa ata aaa tat aagaca ggc3，-5，(SEQ ID NO. 20)gcc tgt ctt ata ttt tat tta AGA CTG GGA CGT ATG CAC CGG TCT GGT tcc gat cca cag tcc ctgacc實施例2新型抗生素對腦膜炎雙球菌的抑制作用細菌為中國菌種保存中心29332腦膜炎雙球菌株，菌液2微升(105CFU/ml)加入兔血巧克力培養液10毫升(牛肉浸膏50mg、胰蛋白胨lOOmg、KH2PO4 30mg、NaCl 50mg、脫纖維兔血0. 5-0. 8ml)中，共準備5組，第一組加入0. 3M NaCl+50mM硼酸緩沖液(即新型抗生素的空白保存液，量與實驗組中加入的新型抗生素液體量相同)作為對照，第二組加入 5 μ g/ml氨芐青霉素，第三組加入5 μ g/ml PMC-AM1，第四組加入5 μ g/mlPMC_AM2，第五組加入 10 μ g/ml PMC-AMI。上述各組液體分別置于100毫升三角燒瓶中，200rpm, 37°C C生長，每小時采樣100 微升加入96孔酶表板中經分光光度計(A 595nm)比色測試細菌生長濁度，畫出細菌生長曲線來比較新型抗生素的抑菌效力，結果如圖4所示，顯示所試腦膜炎雙球菌只能被PMC-AMl 所抑制。實施例3新型抗生素對多重耐藥綠膿桿菌的最低抑菌濃度與現用抗菌素的最低抑菌濃度之比較。采用瓊脂二倍稀釋法測定新型抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。用多點接種儀 (DeneleyA400)將細菌接種于含不同藥物濃度的瓊脂平皿表面，每點含菌量為105CFU/ml， 37°C孵育18- 小時觀察結果，以無細菌生長平皿培養基中所含藥物的最低濃度為藥物對該菌的最低抑菌濃度(MIC值)。所用菌種為多重耐藥綠膿桿菌(華西醫院臨床分離株13578)，培養基為MH培養基 (每百毫升牛肉浸膏500mg、酪蛋白酸水解物1. 75g、可溶性淀粉150mg、瓊脂1. 7g)。結果如圖5所示，新型抗生素⑶(PMC-AMl)對多重耐藥綠膿桿菌的最低抑菌濃度為8 μ g/ml、頭孢它啶㈧為16 μ g/ml、左氧氟沙星⑶為8μ g/ml、慶大霉素(C)大于 512 μ g/ml0若以分子量標化，PMC-AMl對多重耐藥綠膿桿菌的最低抑菌濃度為0. 23nMol、 頭孢它啶為四.3nMol、左氧氟沙星為43. 2nMol、慶大霉素大于890nMol ； S卩，PMC-AMl對多重耐藥綠膿桿菌的抗菌效力強過頭孢它啶、左氧氟沙星、慶大霉素等現用抗菌素127-3800余倍。實施例4新型抗生素的體外抗菌活性與現用抗菌素的比較采用瓊脂二倍稀釋法測定新型抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。用多點接種儀 (DeneleyA400)將細菌接種于含不同藥物濃度的瓊脂平皿表面，每點含菌量為105CFU/ml， 37°C孵育18- 小時觀察結果，以無細菌生長平皿培養基中所含藥物的最低濃度為藥物對該菌的最低抑菌濃度(MIC值)。所用菌種為多重耐藥綠膿桿菌(華西醫院臨床分離株13578)，MH培養基(每百毫升含牛肉浸膏500mg、酪蛋白酸水解物1. 75g、可溶性淀粉150mg、瓊脂1. 7g)；耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA-42)，BM培養基(每百毫升含胰蛋白胨lg、酵母0. 5g、葡萄糖0. lg.NaCl lg、KH2PO4 lOOmg、瓊脂lg)；耐萬古霉素腸球菌(ATCC 700802)，MH培養基；腦膜炎雙球菌 (中國菌種保存中心四33幻，培基同實施例2 (另加哥倫比亞血瓊脂基礎3. 9g)。結果如圖6所示，A圖為腦膜炎雙球菌，(1)PMC-AMl，MIC = 0. IlnMol，(2)頭孢它啶，MIC = 3. 02nMol, (3)氨芐青霉素，MIC = 1. 35nMol ；B圖為耐萬古霉素腸球菌， (1)PMC-AMl，MIC = 0. 23nMol, (2)萬古霉素，MIC = 21. MnMol，(3)氨芐青霉素，MIC = 10. 78nMol ；C圖為耐甲氧西林金葡菌，(1)PMC-AMl，MIC = 0. 06nMol, (2)氨芐青霉素，MIC =21. 55nMol, (3)苯唑西林，MIC = 14. InMol ；D 圖為多重耐藥綠膿桿菌，(1) PMC-AMl，MIC =0. 9InMol, (2)左氧氟沙星，MIC = 43. 2nMol，(3)頭孢它啶，MIC = 29. 3nMol，(4)慶大霉素，MIC > 889. 4nMol。實施例5新型抗生素的體外抗菌活性與抗金葡菌多肽和野生型大腸菌素Ia的比較采用瓊脂二倍稀釋法測定新型抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。以無細菌生長平皿培養基中所含藥物的最低濃度為藥物對該菌的最低抑菌濃度(MIC值)。所用菌種為多重耐藥綠膿桿菌(華西醫院臨床分離株13578)，耐甲氧西林金葡菌 (ATCC BAA-42)，耐萬古霉素腸球菌(ATCC 700802)，MH培養基；腦膜炎雙球菌(中國菌種保存中心四332)，培基同實施例4。結果如圖7所示，A圖為耐萬古霉素腸球菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0.91nMol， (2)野生型大腸菌素 Ia，MIC = 0. 9InMo 1, (3) PMC-AMl，MIC = 0. 23nMol ；B 圖為耐甲氧西林金葡菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0. 06nMol, (2)野生型大腸菌素la,MIC = 0. 23nMol，(3) PMC-AM1,MIC = 0. 06nMol ；C圖為多重耐藥綠膿桿菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0. 9InMol, (2)野生型大腸菌素 Ia，MIC = 0. 9InMo 1, (3) PMC-AMl, MIC = 0. 23nMol。實施例6新型抗生素的腦膜炎雙球菌感染動物的體內保護試驗一、實驗材料(1)藥物PMC-AMl、慶大霉素、青霉素。(2)細菌腦膜炎雙球菌(中國菌種中心(北京天壇國家藥監局中檢所)29332)。二、實驗方法如圖7所示，實驗組共40只昆明小鼠，分為4個實驗組，每組10只。腹腔注射葡萄糖亞鐵溶液(20mg/kg) 1個小時后，再注射0. 5ml菌液。該菌液由1份腦膜炎雙球菌培養液(CFU為2. 36xl09)比1. 5份滅活5%干酵母溶液組成。腹腔注射致死劑量的細菌1小時后，尾靜脈注射藥物以及對照生理鹽水(所有藥物注射濃度均為1. 5mg/kg)，每2小時觀察結果，連續8天，以小鼠死亡為陽性結果。如圖7所示1PMC_AM1，本發明新型抗生素；2Gen，慶大霉素；3PEN，青霉素； 4Con.，對照。三、結果如圖7所示小鼠生存曲線，腹腔注射致死劑量腦膜炎雙球菌后，1)，對照組在2天內全部死亡，2)，青霉素組在2天內全部死亡，3)，慶大霉素組8天存活率為50 %，4)，本發明新型抗生素的8天存活率為90%。結果顯示，對腦膜炎雙球菌致死性感染，本發明的新型抗生素PMC-AMl表現出了所試現用抗生素無法比擬的抗菌活性。
權利要求
1.一種含抗體模擬物的新型抗生素，由大腸菌素El、la、Ib、A、B、N或其水性孔道結構域及共價連接在所述大腸菌素或其水性孔道結構域的肽鏈羧基端的抗體模擬物構成，所述抗體模擬物是由免疫球蛋白WVhCDRI的羧基端連接VhFR2的氨基端，VhFR2的羧基端再連接 VLCDR的氨基端構成；所述免疫球蛋白特異性識別細菌膜孔蛋白。
2.根據權利要求1所述的新型抗生素，所述細菌指腦膜炎雙球菌，所述膜孔蛋白指腦膜炎雙球菌表面的膜孔蛋白PorA。
3.根據權利要求2所述的新型抗生素，所述免疫球蛋白指在具有PUBMED登錄號為 2MPA_H所記載的氨基酸序列的肽鏈與具有登錄號為2MPA_L所記載的氨基酸序列的肽鏈共價結合而得的抗體蛋白。
4.根據權利要求1或2或3所述的新型抗生素，所述大腸菌素為la。
5.一種肽鏈分子，其特征在于由大腸菌素El、la、Ib、A、B、N或其水性孔道結構域的肽鏈及共價結合在其羧基端的抗體模擬物肽鏈連接而成，所述抗體模擬物肽鏈由免疫球蛋白的三個區域VfDRl、VhFR2、VfDR3的肽鏈順次以羧基端連接下一區域肽鏈的氨基端構成； 所述免疫球蛋白特異性識別細菌膜孔蛋白。
6.根據權利要求5所述肽鏈分子，具有kqID No. 6所示氨基酸序列。
7.編碼權利要求5或6所述肽鏈分子的核苷酸序列。
8.根據權利要求7所述核苷酸序列，如kqID No. 5所示。
9.包含權利要求7或8所述核苷酸序列的重組表達載體。
10.權利要求1至4任一所述的新型抗生素的制備方法，指將權利要求9所述的重組表達載體導入到表達系統中進行表達；分離純化表達的多肽獲得抗生素。
11.權利要求1至4任一所述的新型抗生素在制備抗細菌藥物中的應用。
12.根據權利要求11所述的應用，所述抗細菌藥物指抗腦膜炎雙球菌、抗耐萬古霉素腸球菌、抗耐甲氧西林金葡菌或抗多重耐藥綠膿桿菌的藥物。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥領域，特別是涉及“一種含抗體模擬物的新型抗生素及其制備方法與應用”，一種含抗體模擬物的新型抗生素，由大腸菌素E1、Ia、Ib、A、B、N或其水性孔道結構域及抗體模擬物構成，所述抗體模擬物是由免疫球蛋白的VHCDR1的羧基端連接VHFR2的氨基端，VHFR2的羧基端再連接VLCDR的氨基端構成；所述免疫球蛋白特異性識別細菌膜孔蛋白。該抗生素的殺菌能力是常用抗生素千倍以上，由于其作用機理特殊，因此致病菌很難產生耐藥性，殺菌過程中不會傷害人體正常細胞；可用于制備抗抗腦膜炎雙球菌、抗耐萬古霉素腸球菌、抗耐甲氧西林金葡菌或抗多重耐藥綠膿桿菌的藥物中。
文檔編號C12N15/63GK102558361SQ20121002770
公開日2012年7月11日 申請日期2009年9月2日 優先權日2009年9月2日
發明者丘小慶 申請人:畿晉慶堂國際生物技術有限公司