唾液酸在植物中的合成的制作方法

專利名稱：：唾液酸在植物中的合成的制作方法
技術領域：
：本發明涉及唾液酸在植物中的合成。此外，本發明提供了產生唾液酸的方法和植物，以及由這些植物產生的唾液酸化的蛋白。
背景技術：
：對于重組藥用蛋白的生產，植物是潛在的低成本并且無污染的工具。植物中生產的大多數重組蛋白與它們的哺乳動物對應物在氨基酸序列、構象和生物活性方面沒有區別。此外，當哺乳動物糖蛋白在轉基因植物中表達的時候能夠被有效地糖基化。然而，由植物產生的分子上具有的N-聚糖與存在于動物糖蛋白上的N-聚糖是不同的(Lerougeetal.，1998)。這一點可能限制了從植物制備的藥物的應用，這是因為除了缺乏哺乳動物型表位(例如唾液酸化序列)可導致它們被快速地從血流中清除之外，這些蛋白上的植物特異性糖表位會引起人的免疫反應(Bardoretal.，2003)。因此，對從植物制備的藥物的N-糖基化進行控制是將它們用于治療人類的前提條件。最近已經出現了植物內重塑方法，以用于獲得具有與人類相容的糖類特征的來源于植物的抗體。一些方法包括植物抗體在內質網中的駐留(Koetal.,2003；Sriramanetal.,2004,Trigueroetal.，2005)，還有一些方法涉及用哺乳動物糖基轉移酶來對植物進行轉化。例如，通過用人β(I，4)_半乳糖轉移酶來轉化植物可以部分地將植物N-糖基化人源化(Palacpacetal.,1999；Bakkeretal.,2001)。鼠類抗體在轉化植物中的表達可以產生來源于植物的抗體，所述抗體具有的半乳糖基化特征與在相應的鼠IgG所觀察到的特征類似(Bakkeretal.,2001)。哺乳動物IgG在位于Fe區的N-糖基化保守位點帶有二天線(bi-antennary)N-聚糖。這些低聚糖被輕度唾液酸化，并且缺少末端Neu5Ac時也不會影響抗體的功能和穩定性。相反，大部分的其他血液循環糖蛋白具有唾液酸化的二天線N-聚糖、三天線(tri-antennary)N-聚糖或四天線(tetra-antennary)N-聚糖。在這些聚糖上存在末端唾液酸是多種生物功能必需的，其中首要一點是調控所述蛋白在循環系統中的半衰期。不存在末端唾液酸時，糖蛋白會被肝的無唾液酸糖蛋白受體檢測到并且被從血清中清除，使得這些蛋白在生物中存在很短暫且沒有效力(KelmandSchauer，1997)。因此，由植物制備的非唾液酸化的藥物在注射至人體后可被快速地從血液中清除——例如來源于煙草的Epo在體外有生物活性而在體內無功能，這是因為它在到達紅細胞生成組織之前就被從循環中去除(Matsumotoetal.,1995)。通過人β(1，4)_半乳糖轉移酶(一種利用內源UDP-Gal作為協同底物的轉移酶)的表達(Palacpacetal.,1999；Bakkeretal.,2001),已經在植物中部分地實現將連接于植物抗體的N-聚糖重塑為類似人的N-聚糖。哺乳動物唾液酸轉移酶已經被導入植物中，并且被證明有功能且被正確地定位于高爾基體上(Weeetal.，1998)。然而，沒有觀察到內源寡糖的唾液酸化。在植物中是否存在唾液酸以及唾液酸化機制仍然是有爭議的問題。然而，Neu5Ac(在人體內存在的主要的唾液酸)以及其前體N-乙酰甘露糖胺(D-ManNAc)在植物中合成的量似乎不足以被檢測(S6venoetal.，2004)。因此，將植物N-聚糖進行糖工程改造成唾液酸化寡糖需要能夠催化Neu5Ac合成、激活和在高爾基體中轉移的外源性酶的共表達。在哺乳動物和細菌中，Neu5Ac的合成代謝和分解代謝通過不同途徑發生(AngataandVarki,2002)。Neu5Ac的形成主要需要兩類酶。通過在可逆反應中催化Neu5Ac分解成N-乙酰甘露糖胺(D-ManNAc)和丙酮酸，N-乙酰神經氨酸裂合酶(Neu5Ac裂合酶)參與唾液酸的分解代謝。在高濃度的D-ManNAc和丙酮酸下，上述平衡轉向Neu5Ac合成的方向。來自大腸桿菌的Neu5Ac裂合酶與葡糖胺2-差向異構酶活性相結合,被用于從D-GlcNAc大規模生產Neu5Ac(Maruetal.，1998)。或者，Neu5Ac合酶(例如NeuB)催化ManNAc與憐酸烯醇丙酮酸(PEP)的縮合，并且直接參與唾液酸的生物合成(在Tanner，2005中綜述)。
發明內容本發明涉及唾液酸在植物中的合成。此外，本發明提供了產生唾液酸的方法和植物，以及由這些植物產生的唾液酸化的蛋白。本發明的一個目標是提供改進的在植物中產生唾液酸的方法。根據本發明，提供了一種合成唾液酸——例如N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)的方法⑷，包括i)提供包含編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列的植物,所述核苷酸序列與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接，以及ii)使所述植物生長并且表達所述核苷酸序列，從而合成所述唾液酸。此外，在所述使植物生長的步驟后可以從所述植物中回收所述唾液酸。所述調控區可以選自于組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子和發育相關的啟動子。本發明還涉及上文定義的方法(方法A)，其中在所述提供植物的步驟中，所述植物還包含與在所述植物中有活性的一個或多個第二調控區可操作地連接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列編碼下述一種或多種蛋白質差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶或唾液酸轉移酶，并且所述第二核苷酸序列與所述核苷酸序列共表達。此外，所述第二調控區可以選自于組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子和發育相關的啟動子。本發明還涉及上文描述的方法(方法A)，其中為了在所述植物中表達，可以對編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的所述核苷酸序列，編碼差向異構酶、CMP_Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac運載蛋白中的一種或多種的所述第二核苷酸序列，或者所述核苷酸序列和所述第二核苷酸序列兩者進行密碼子優化。本發明提供了一種產生目的蛋白的方法(B)，包括i)提供一種表達一個或多個第一核苷酸序列和編碼目的蛋白的第二核苷酸序列的植物，所述第一核苷酸序列編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP_Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶，ii)使所述植物生長并且表達所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列，從而產生所述目的蛋白，其中所述目的蛋白是唾液酸化的。優選地，唾液酸化的目的蛋白包含二天線N-聚糖、三天線N-聚糖或四天線N-聚糖。本發明還涉及上文定義的方法(方法B)，其中所述唾液酸化的蛋白提取自所述植物。此外，所述唾液酸化的蛋白可以被分離和純化。本發明提供了下述的植物、植物細胞或種子，它們包含編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列與與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接。所述植物、植物細胞或種子還可以包含與在所述植物中有活性的一個或多個第二調控區可操作地連接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列編碼下述一種或多種蛋白質差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶。此外，所述調控區和所述第二調控區可以選自于組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子和發育相關的啟動子。本發明涉及上文描述的方法(方法B)，其中為了在所述植物、植物細胞或種子中表達,可以對編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP_Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶、唾液酸轉移酶的所述一個或多個的第一核苷酸序列，編碼所述目的蛋白的第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列兩者進行密碼子優化。本發明包括包含下述植物、植物細胞或種子，它們包括編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接。所述植物、植物細胞或種子還可以包含與在所述植物中有活性的一個或多個第二調控區可操作地連接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列編碼下述一種或多種蛋白質差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶。此外，為了在所述植物、植物細胞或種子中表達，可以對編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的所述核苷酸序列，編碼差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP_Neu5Ac運載蛋白中的一種或多種的所述第二核苷酸序列，或者所述核苷酸序列和所述第二核苷酸序列兩者進行密碼子優化。本發明還提供了包含一個或多個第一核苷酸序列和編碼目的蛋白的第二核苷酸序列的植物、植物細胞或種子，所述第一核苷酸序列編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶，并且所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的一個或多個調控區可操作地連接。所述一個或多個調控區可以選自于組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子和發育相關的啟動子。此外，為了在所述植物、植物細胞或種子中表達，可以對編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP_Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶、唾液酸轉移酶的所述一個或多個第一核苷酸序列，編碼所述目的蛋白的第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列兩者進行密碼子優化。本發明還提供了一種合成唾液酸的方法(方法C)，包括用編碼N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列瞬時轉化植物或所述植物的一部分,所述核苷酸序列與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接，以及表達所述核苷酸序列從而合成唾液酸。此外，可以從所述植物中或所述植物的一部分中回收Neu5Ac或Neu5Ac裂合酶。本發明還涉及上文描述的方法(方法C)，其中在瞬時轉化所述植物或所述植物的一部分的步驟中，還包含與在所述植物中有活性的一個或多個第二調控區可操作地連接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列編碼下述一種或多種蛋白質差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP_Neu5Ac運載蛋白，并且所述第二核苷酸序列與所述核苷酸序列共表達。本發明提供了一種產生目的蛋白的方法(方法D)，包括i)用一種構建體瞬時轉化植物或所述植物的一部分,所述構建體表達一個或多個第一核苷酸序列和編碼所述目的蛋白的第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶、唾液酸轉移酶，并ii)產生所述目的蛋白，其中所述目的蛋白是唾液酸化的。唾液酸化的目的蛋白可以包含二天線N-聚糖、三天線N-聚糖或四天線N-聚糖。此外，可以從所述植物或所述植物的一部分提取所述唾液酸化的蛋白。所述唾液酸化的目的蛋白也可以被分離和純化。本發明還涉及上文描述的方法(方法D)，其中在所述產生步驟后，將包含所述唾液酸化的目的蛋白的植物材料通過口服給予受試者。例如，在所述產生步驟之后，所述植物或所述植物的一部分被最低限度地處理以產生最低限度處理的植物材料，并且將包含所述唾液酸化的目的蛋白的所述最低限度處理的植物材料通過口服給予受試者。如本文所述，合成Neu5Ac的酶、Neu5Ac裂合酶和NeuB2在植物中的表達可導致功能性酶在植物組織中的累積。合成Neu5Ac的酶可以在任何植物中表達，例如但不限于煙草和紫花苜猜(Medicagosativa)((alfalfa)),受益于在分子農業應用的數個農業優勢的多年生豆類植物(Busseetal.,2001)本發明的這些
發明內容不必描述本發明的所有的特征。本發明的這些特征和其他特征通過下文的說明將更加顯而易見，下文的說明參考了以下的附圖，其中圖Ia顯示使用FLAG抗體對從野生型煙草BY2細胞(列I)或表達Neu5Ac裂合酶-FLAG的轉基因煙草BY2細胞(列2)提取的可溶性蛋白的蛋白印跡分析。圖Ib和圖Ic顯示無Neu5Ac(圖Ib)或有Neu5Ac(圖Ic)時，從表達Neu5Ac裂合酶的煙草BY2細胞分離的胞質蛋白在PH7和37°C下孵育得到的終產物的氣相層析譜。圖Id顯示在37°C下48小時過程中加入IOmM外源的Neu5Ac，表達Neu5Ac裂合酶的煙草BY2細胞的胞質單糖的GC譜。圖Ie和圖If顯示在譜(圖Ic)中檢測到的峰1(圖Ie)以及峰2和3(圖If)的電子轟擊質譜。D-ManNAc的1_0_甲基全甲娃燒基(1-0-methylpersilyl)衍生物的主碎片離子被標出。圖2a和圖2b顯示無D-ManNAc和丙酮酸(圖2a)時或者有D-ManNAc和丙酮酸(圖2b)時，從表達Neu5Ac裂合酶的煙草BY2細胞分離的胞質蛋白在pH7和37°C下孵育得到的終產物的氣相層析譜。圖2c顯示譜(圖2b)中出現的峰的電子轟擊質譜。N-乙酰神經氨酸的i-ο-甲基甲酯全甲硅烷基衍生物的主碎片離子被標出。圖3a顯示使用FLAG抗體對從野生型煙草BY2細胞(列I)或表達Neu5Ac裂合酶-FLAG的轉基因煙草BY2細胞(列2)提取的胞質蛋白的蛋白印跡分析。圖3b和圖3c顯示無D-ManNAc和PEP(圖3b)或者有D-ManNAc和PEP(圖3c)時，從表達NeuB2的苜蓿植物的葉中提取的可溶性蛋白在PH8和37°C下孵育后得到的終產物的氣相層析譜。圖3d顯示譜(圖3c)中出現的峰的電子轟擊質譜。N-乙酰神經氨酸的1-0-甲基甲酯全甲硅烷基衍生物的主碎片離子被標出。具體實施例方式本發明涉及唾液酸在植物中的合成。此外，本發明提供了表達唾液酸的方法和植物，以及由這些植物產生的唾液酸化的蛋白。以下的描述是優選的實施方案。本發明提供了在植物中合成N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)的方法。通過在可逆反應中催化Neu5Ac分解成ManNAc和丙酮酸，Neu5Ac裂合酶在細菌中分解代謝唾液酸。因為這個反應是可逆的，所以在存在合適的前體情況下Neu5Ac裂合酶可被用于Neu5Ac的合成。產生Neu5Ac的另一種方法涉及使用Neu5Ac合酶。Neu5Ac合酶催化D-ManNAc和PEP的縮合形成Neu5Ac。因此，本發明提供了一種合成Neu5Ac的方法，包括提供包含編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列的植物，所述核苷酸序列與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接，使所述植物生長并且表達所述核苷酸序列以合成Neu5Ac。或者，所述方法可以包括在植物中或所述植物的一部分中的瞬時產生Neu5Ac。使用本領域已知的方法，如此產生的Neu5Ac可以從所述植物中回收，并且在體外被用于蛋白的唾液酸化。或者，Neu5Ac可以用作對在所述植物中共表達的目的蛋白進行唾液酸化的內源性底物。如果需要，可以通過一個或多個另外的核苷酸序列在所述植物中共表達來提高所述植物中用于合成Neu5Ac的底物(包括但不限于N-乙酰甘露糖胺(D-ManNAc))的水平，所述另外的核酸序列編碼差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶和CMP-Neu5Ac運載蛋白中的一種或多種。例如，可以通過在植物中表達UDP-GlcNAc2-差向異構酶(例如細菌UDP-GlcNAc2-差向異構酶或其他來源的差向異構酶形式)來合成ManNAc，該酶將內源性的UDP-GIcNAc轉換成ManNAc。或者，可以先產生ManNAc_6-磷酸，之后用磷酸酶進行水解。用這種方法，在植物中表達GlcNAc-6-磷酸2-差向異構酶，例如細菌GlcNAc-6-磷酸2-差向異構酶或哺乳動物UDP-GlcNAc2-差向異構酶/ManNAc激酶。通過將該第二核苷酸序列與編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列共表達，可以使Neu5Ac的水平增加。然而,對一個或多個的上述核苷酸序列共表達的需求將依賴于所選擇的宿主植物，這是因為所述植物中可能存在上述一種或多種酶的內源活性。為了保證由胞質唾液酸對N-聚糖的唾液酸化，可以在植物中共表達細菌或哺乳動物的CMP-Neu5Ac合酶、哺乳動物CMP-Neu5Ac運載蛋白、哺乳動物半乳糖轉移酶(用于在唾液酸被轉移至N-聚糖之前加成半乳糖)和哺乳動物唾液酸轉移酶。在根據本發明的植物中產生的Neu5Ac可以被用作通過CMP-Neu5Ac合酶合成CMP-N-乙酰神經氨酸(CMP-Neu5Ac)的底物，然后所述CMP-Neu5Ac被用作對在所述植物中共表達的目的蛋白進行唾液酸化的底物。在這種情況下，所述植物還可以包含編碼唾液酸轉移酶的核苷酸序列。已經證明了在植物中可表達哺乳動物唾液酸轉移酶和哺乳動物CMP-Neu5Ac合酶(Weeetal.,1998,Misaki,R.,etal.，2006，所述文獻通過引用的方式納入本文)。然而，對一個或多個的上述核苷酸序列共表達的需求將依賴于所選擇的宿主植物，這是因為所述植物中可能存在上述一種或多種酶的內源活性。在核苷酸序列在所述植物中共表達的情況下，可以使用標準的轉化技術或瞬時轉化技術將每種目的核苷酸序列導入所述植物，或者可以將每株都表達一個或多個目的核苷酸序列的兩株植物雜交，以獲得能夠組合共表達目的核苷酸序列的植物。因此，本發明還提供了一種產生植物的方法，所述植物可以被用作產生目的唾液酸化蛋白的平臺。該方法包括提供表達一個或多個第一核苷酸序列的植物，所述第一核苷酸序列編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP_Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶，以及表達所述一個或多個核苷酸序列。通過以下兩種方式產生目的蛋白使用標準的技術例如轉化，將編碼目的蛋白的第二核苷酸序列導入所述平臺植物，并且表達所述第二核苷酸序列；或者，將所述平臺植物與表達目的蛋白的植物雜交，使得雜交植物的子代中產生的目的蛋白是唾液酸化的。本發明還提供了一種產生目的蛋白的方法，包括提供一種表達一個或多個第一核苷酸序列和編碼目的蛋白的第二核苷酸序列的植物，所述第一核苷酸序列編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶，使所述植物生長，以及表達所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列，從而產生所述目的蛋白，其中所述目的蛋白是唾液酸化的。優選地，唾液酸化的所述目的蛋白包含二天線N-聚糖、三天線N-聚糖或四天線N-聚糖。可以從所述植物提取所述唾液酸化的蛋白，并且根據需要，可以使用標準的方法分離并純化所述的唾液酸化的蛋白。再者，所述植物可以是用所需構建體穩定轉化的，或者所述植物或所述植物的一部分可以是用所需構建體瞬時轉化的。可以對編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP_Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶的核苷酸序列進行密碼子優化，以增加在所述植物中的表達水平。密碼子優化是指選擇合適的DNA核苷酸用于寡核苷酸結構嵌段的合成，并且它們隨后被酶組裝成結構基因或其片段以接近于植物中的密碼子選擇。為了優化所述外源序列在植物中的表達，可以根據需要使用或者改變所述核苷酸序列(可以是野生序列或合成序列)，使得產生的相應蛋白例如Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶、唾液酸轉移酶、目的蛋白或其組合產生的水平高于由未改變的核苷酸序列編碼能產生的水平。例如(但不應作為限制)，所述序列可以是針對植物中的密碼子選擇進行過優化的合成序列，與所述野生序列有至少約80%的同源性一這由序列比較技術確定，所述序列比較技術例如但不限于BLAST(從GenBank獲得；使用默認參數)。還應理解的是，編碼目的蛋白或其衍生物(表現出有用的生物性質，例如但不限于抗原性的性質)的序列的片段或部分可以在植物組織中表達。為了使Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP_Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶、唾液酸轉移酶和目的蛋白的表達水平和轉基因蛋白的產生最大化，可以檢查所述核酸序列并且修改所述編碼區以優化所述基因在植物中的表達，所使用的方法類似于Sardana等所述的方法(PlantCellReports15:677-681;1996)。來自雙子葉植物的高表達基因的密碼子選擇表有多個來源，其中包括Murray等所述的來源(NucAcidsRes.17=477-498；1989)。因此，本發明提供了一種合成唾液酸的方法，包括提供包含編碼N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列的植物，所述核苷酸序列與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接，使所述植物生長并表達所述核苷酸序列，從而合成唾液酸。為了在所述植物中表達，可以對編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列進行密碼子優化。此外，在所述提供植物的步驟中，所述植物還包含與一個或多個在所述植物中有活性的第二調控區可操作地連接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列編碼下述一種或多種蛋白質差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP_Neu5Ac運載蛋白，并且所述第二核苷酸序列與所述核苷酸序列共表達。為了在所述植物中表達，可以對編碼差向異構酶、CMP-NeU5Ac合酶或CMP-Neu5Ac運載蛋白中的一種或多種的所述第二核苷酸序列進行密碼子優化。此外，本發明另外提供了一種產生目的蛋白的方法，包括提供一種表達一個或多個第一核苷酸序列和編碼目的蛋白的第二核苷酸序列的植物，所述第一核苷酸序列編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP_Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶、唾液酸轉移酶，使所述植物生長并表達所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列，從而產生所述目的蛋白。為了在所述植物中表達，可以對編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶、唾液酸轉移酶的所述一種或多種第一核苷酸序列、編碼所述目的蛋白的第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列兩者進行密碼子優化。此外，本發明涉及下述植物、植物細胞或種子它們包含編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接。所述植物、植物細胞或種子還可以包含與一個或多個在所述植物中有活性的第二調控區可操作地連接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列編碼下述一種或多種蛋白質差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶。為了在所述植物、植物細胞或植物種子中表達，可以對編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的所述核苷酸序列、編碼差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP_Neu5Ac運載蛋白中一種或多種的所述第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列兩者進行密碼子優化。本發明還包括包含一個或多個第一核苷酸序列和編碼目的蛋白的第二核苷酸序列的植物、植物細胞或種子，所述第一核苷酸序列編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶，并且所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列與一個或多個在所述植物中有活性的調控區可操作地連接。為了在所述植物中表達，可以對編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶、唾液酸轉移酶的所述一個或多個第一核苷酸序列，編碼所述目的蛋白的所述第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列兩者進行密碼子優化。“可操作地連接”是指具體的序列之間直接或間接地相互作用以完成預定的功能——例如介導或調節基因表達。可操作連接的序列之間的相互作用可以被例如與所述可操作連接的序列相互作用的蛋白介導。若序列之間功能連接從而使目的序列的轉錄被轉錄調控區介導或調節，則所述轉錄調控區和所述目的序列是可操作地連接的。所述術語“植物物質”是指任何從植物獲得的材料。植物物質可以包括全植株、組織、細胞或它們的任何部分。此外，植物物質可以包括細胞內的植物組分、細胞外的植物組分、植物的液體提取物或固體提取物或其組合。此外，植物物質可以包括植物、植物細胞、組織、液體提取物或其組合，它們來自植物葉、莖、果實、根或其組合。植物物質可以包括沒有經過任何處理步驟的植物或其部分。然而，也應理解，所述植物材料可以經過下文定義的最低限度處理的步驟，或者更嚴格的處理——包括部分的蛋白純化或高度的蛋白純化，使用的是本領域公知的技術——包括但不限于色譜法、電泳等。所述術語“最低限度處理的”是指植物物質(例如包含目的蛋白的植物或其部分)被部分地純化以產生植物提取物、勻漿物、植物勻漿物的級分等。部分的純化可以包括但不限于破壞植物細胞結構從而形成包含可溶性植物組分和不溶性植物組分的組合物，所述組分可以通過例如但不限于離心、過濾或其組合進行分離。在該方面，使用真空或離心提取可以容易地獲得分泌到葉或其他組織的細胞外空間中的蛋白，或者可以在壓力下通過滾軸或通過研磨等進行組織提取以從細胞外空間中擠壓或釋放所述蛋白。最低限度處理也可以包括可溶性蛋白的粗提取物的制備，這樣這些制品中來自第二植物產物的污染的量就可以忽略不計。此外，最低限度處理可以包括從葉中水提取水溶性蛋白，然后用任何合適的鹽進行沉淀。為了直接使用所述提取物，其他的方法可以包括大規模的離析和汁提取。植物材料或植物組織形式的所述植物物質可以通過口服被送遞至受試者。所述植物物質可以被作為膳食添加劑的一部分與其他食物共同給予，或者被裝入膠囊。所述植物物質或植物組織也可以被濃縮以改善或增加口味，或者根據需要與其他材料、成分、藥物輔料一起被提供。根據具體需求或具體情況，考慮到了可以使用多種方式將包含目的異源蛋白的植物給予動物或人等受試者。例如，如果所述蛋白是通過口服給予，那么可以收集所述植物組織并直接喂食受試者，或者收集的植物組織可以在喂食前預先進行干燥，或者可以不預先進行收集而在所述植物的區域放牧動物。將收集的植物組織作為動物飼料的食品添加劑提供也被認為在本發明的范圍內。如果用經過很少進一步處理的或者不進行進一步處理的所述植物組織喂食動物，那么所述被給予的植物組織優選是可食用的。此外，在作為食品添加劑使用前，來自所述植物的目的蛋白可以以粗制的形式、部分純化的形式或者純化的形式被提取。對于后一種情況，所述蛋白可以在可食用植物或不可食用植物中產生。如在實施例中更加詳細描述的那樣，將Neu5Ac裂合酶和Neu5Ac裂合酶-FLAG(Neu5Ac裂合酶的C-端被FLAG表位標記，從而可對轉化體中的重組蛋白進行免疫檢測)導入植物中。使用抗FLAG抗體的蛋白印跡分析證明了所述轉化的細胞中存在MWr32kDa的蛋白(圖Ia)。此外，在表達Neu5Ac裂合酶或Neu5Ac裂合酶-FLAG的植物或者從這些植物獲得的提取物中檢測到了體內的和體外的裂合酶活性。在非轉化的植物中沒有檢測到內源的裂合酶活性。然而，在存在D-ManNAc和丙酮酸時，觀察到了利用重組產生的Neu5Ac裂合酶進行的Neu5Ac的合成(見圖2b)。因此，重組表達的Neu5Ac裂合酶在植物中是有生物活性的。將Neu5Ac合酶(例如但不限于NeuB2)和Neu5Ac合酶-FLAG(Neu5Ac合酶的C-端被FLAG表位標記，從而可對轉化體中的重組蛋白進行免疫檢測)導入植物中。使用抗FLAG抗體的蛋白印跡分析證明了所述轉化的細胞中存在MWr37kDa的蛋白。在表達Neu5Ac合酶或Neu5Ac合酶-FLAG的植物或者從這些植物獲得的提取物中檢測到了體內的和體外的合酶活性。在非轉化的植物中沒有檢測到內源的合酶活性。然而，在存在D-ManNAc和PEP時，觀察到了利用重組產生的Neu5Ac合酶進行的Neu5Ac的合成(見圖3b、3c)。因此，重組表達的Neu5Ac合酶在植物中是有生物活性的。“類似物”或“衍生物”包括在沉默核苷酸序列中的任何的置換、缺失或插入，只要所述核苷酸序列以下的性質被保留沉默靶基因或靶序列的表達，減少靶序列的表達，或者降低由所述靶序列編碼的蛋白的合成或活性。例如，核酸序列的衍生物和類似物與沉默核酸序列一般有超過80%的相似性。序列相似性可以使用BLAST算法(GenBankncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/)確定，使用的是默認參數(程序blastn;數據庫nr;期望值10;過濾低復雜度；比對成對比對；字長11)。類似物或其衍生物還包括在嚴格雜交條件下(參見Maniatisetal.,MolecularCloning(ALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory,1982,page,387-389;或Ausubel,etal.(eds),1989,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.I,GreenPublishingAssociates,Inc.,和JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,page2.10.3)與本文描述的任一條序列雜交的那些核苷酸序列，只要所述序列有沉默靶基因表達的性質即可。這樣的嚴格雜交條件的一個實例可以是與合適的探針(例如但不限于[Y_32P]dATP標記的探針)在以下緩沖液中于65EC雜交16-20小時7%SDSUmMEDTA、0.5MNa2HPO4(pH7.2)。隨后在5%SDSUmMEDTA、40mMNa2HPO4(pH7.2)中洗滌30分鐘，然后在1%SDSUmMEDTA、40mMNa2HPO4(pH7.2)中洗滌30分鐘。可以反復在該緩沖液中洗滌以降低背景。“調控區”、“調控元件”或“啟動子”是指通常(但并非總是)位于基因的蛋白編碼區上游的核酸部分，可以包括DNA或RNA或者DNA和RNA兩者。如果調控序列是有活性的，并且可操作地關聯于目的基因或者可操作地與目的基因連接，那么這將導致所述目的基因的表達。調控元件能介導器官特異性，或者控制發育基因或時序基因的激活。“調控區”包括啟動子元件、有啟動子基本活性的核心啟動子元件、可被外部刺激誘導的元件、介導啟動子活性的元件例如負調控元件和轉錄增強子。本文使用的“調控區”也包括隨轉錄激活的元件，例如調節基因表達的調控元件(如翻譯增強子和轉錄增強子、翻譯抑制子和轉錄抑制子)、上游激活序列以及mRNA穩定性決定子。這后幾種元件中有一些可以位于與編碼區鄰近的位置。在本發明公開的文本中，術語“調控元件”或“調控區”一般是指通常(但并非總是)位于結構基因的編碼序列上游(5，)的DNA序列，它通過識別RNA聚合酶和/或轉錄所需的其它因子來控制所述編碼區的表達在特定位點起始。然而，應理解的是位于內含子中或者所述序列的3’端的其他核苷酸序列也可以調節目的編碼區的表達。識別RNA聚合酶或其它轉錄因子以確保在特定位點起始的調控元件的一個實例是啟動子元件。大部分(但并非全部)的真核啟動子元件包含TATA盒，該元件是由腺嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸堿基對組成的保守核酸序列，通常位于轉錄起始位點上游大約25個堿基對的位置。除了改變基因表達的其他調控元件(如上文列出的)之外，啟動子元件還包含負責轉錄起始的啟動子基本元件。有幾種類型的調控區，包括受發育調節的、誘導型的或組成型的。受發育調節的調控區或者對受其控制的基因的差異表達進行控制的調控區在特定器官或器官的組織中并且在該器官或組織發育過程中的特定時間被激活。然而，有些受發育調節的調控區可以優先在某些器官或組織的特定發育階段有活性，而在所述植物的其他器官或組織中，它們也可以以發育調節的方式出現活性或者有基礎水平的活性。組織特異性調控區的實例(例如見具體的(see-specific)調控區)包括napin啟動子和十字花科蛋白啟動子(cruciferinpromoter)(Rasketal.,1998,J.PlantPhysiol.152:595-599；Bilodeauetal.,1994，PlantCell14:125-130)。誘導型調控區是針對誘導物能夠直接地或間接地激活一個或多個DNA序列或基因的轉錄的調控區。在不存在誘導物時，所述DNA序列或基因將不被轉錄。特異性結合誘導型調控區以激活轉錄的蛋白因子一般以無活性的形式存在，然后所述誘導物可以直接或間接地將它們轉換成有活性的形式。然而，也可能不存在所述蛋白因子。所述誘導物可以是例如蛋白、代謝產物、生長調節因子、除草劑或酚化合物的化學試劑；或者是由熱、冷、鹽或毒性元素直接產生的生理脅迫；或者是通過病毒等病原體或疾病因素的作用間接產生的生理脅迫。可以通過將誘導物外部施予(例如通過噴霧、灑水、加熱或類似的方法)至包含誘導型調控區的細胞或植物從而使所述植物細胞暴露于所述誘導物。誘導型調控元件可以來源于植物基因或非植物基因(如Gatz，C.andLenk，I.R.P.,1998,TrendsPlantSci.3,352-358;該文獻被通過引用的方式納入本文)。潛在的誘導型啟動子的實例包括但不限于四環素誘導型啟動子(Gatz,C,1997,Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48,89-108;該文獻被通過引用的方式納入本文)、類固醇誘導型啟動子(Aoyama,T.andChua,N.H.，1997，PlantJ.2，397-404;該文獻通過引用的方式被納入本文)和乙醇誘導型啟動子(Salter,M.G.,etal,1998，PlantJournal16，127-132；Caddick,Μ.X.,etal,1998，NatureBiotech.16，177-180;這些文獻被通過引用的方式納入本文)、細胞分裂素誘導型IB6和CKIl基因(Brandstatter,I.andKieber,J.J.，1998，PlantCelllO,1009-1019；Kakimoto，T.，1996，Science274,982-985;這些文獻被通過引用的方式納入本文)和生長素誘導型元件DR5(Ulmasov，T.，etal.，1997，PlantCell9，1963-1971;該文獻被通過引用的方式納入本文)。組成型調控區指導基因在各個植物部分并且整個植物發育過程中連續表達。已知的組成型調控元件的實例包括與以下基因相關的啟動子CaMV35S轉錄物(Ode11etal.,1985,Nature,313:810-812)、稻肌動蛋白I(Zhangetal,1991,PlantCell,3:1155-1165)、肌動蛋白2(Anetal.，1996，PlantJ.，10:107-121)或tms2(U.S.5，428，147，它被通過引用的方式納入本文)、以及磷酸丙糖異構酶I基因(Xuet.al.，1994,PlantPhysiol.106:459-467)、玉米泛素I基因(Cornejoetal,1993,PlantMol.Biol.29:637-646)、擬南芥(Arabidopsis)的泛素I基因和泛素6基因(Holtorfetal,1995，PlantMol.Biol.29:637-646)和煙草翻譯起始因子4A基因(Mandeletal,1995PlantMol.Biol.29:995-1004)。本文使用的術語“組成型的”不一定表示受組成型調控區控制的基因在所有細胞類型中表達相同的水平，而是表示所述基因在寬范圍的細胞類型中表達，即使經常會出現豐度的變化。本發明的一個或多個核苷酸序列可以在用本發明的核苷酸序列、構建體或載體轉化的任何合適的植物宿主中表達。合適宿主的實例包括但不限于農作物，所述農作物包括苜蓿、蕓苔、蕓苔屬的多個種、玉米、煙草、苜蓿、馬鈴薯、人參、豌豆、燕麥、稻、大豆、小麥、大麥、向日葵和棉花。因此，本發明還提供了包含以下核苷酸序列的植物、植物細胞或種子編碼Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶、與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接的核苷酸序列。此外，所述植物、植物細胞或種子可以包含與一個或多個在所述植物中有活性的第二調控區可操作地連接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列編碼下述一種或多種蛋白質差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶。本發明還提供了包含一個或多個第一核苷酸序列和編碼目的蛋白的第二核苷酸序列的植物、植物細胞或種子，所述第一核苷酸序列編碼Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向異構酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac運載蛋白、半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶，并且所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列與一個或多個在所述植物中有活性的調控區可操作地連接。本發明的一種或多種嵌合遺傳構建體還可以包含3’非翻譯區。3’非翻譯區是指這樣的基因部分，它包含一段含有多腺苷酸化信號和能夠影響mRNA加工或基因表達的任何其他調控信號的DNA片段。所述多腺苷酸化信號的特征通常在于影響多聚腺苷酸在mRNA前體3’端的添加。多腺苷酸化信號通常被存在的經典形式的5’AATAAA-3’(雖然偶爾會有所變化)同源物識別。本發明的一種或多種嵌合遺傳構建體還可以另外包含增強子(翻譯增強子或轉錄增強子)，它可能是需要的。這些增強子區域是本領域技術人員公知的，并且可以包括ATG起始密碼子及鄰近序列。所述起始密碼子必須在所述編碼序列的閱讀框內，以保證所述整條序列的翻譯。合適的3’區的非限制性實例是以下基因的包含多腺苷酸化信號的3’轉錄的非翻譯區例如胭脂堿合成酶(基因Nos)的農桿菌瘤誘導(Ti)質粒基因，以及例如大豆貯藏蛋白基因和1，5_二磷酸核酮糖羧化酶(ssRUBISCO)小亞基基因的植物基因。為了有助于鑒定轉化的植物細胞，可以進一步處理本發明的構建體以使其包含植物的選擇性標記。有用的選擇性標記包括提供化學劑抗性的酶，所述化學劑例如慶大霉素、潮霉素、卡那霉素等抗生素或者草胺磷(phosphinothrycin)、草甘膦、氯磺隆等除草劑。類似地，可以使用能產生可通過顏色變化來辨別的化合物(例如GUS(i3-葡萄糖苷酸酶))或化學發光(例如螢光酶素和GFP)的酶。本發明還考慮到的部分為包含本發明的嵌合基因構建體的轉基因植物、植物細胞或種子。從植物細胞再生整個植物的方法也是本領域已知的。一般而言，轉化的植物細胞被培養在合適的培養基中，所述培養基可以包含抗生素等選擇劑，其中選擇性標記被用于幫助對轉化的植物細胞進行鑒定。一旦形成愈傷組織，可以根據已知方法通過使用合適的植物激素促進芽形成，將所述芽轉移至生根培養基中以再生植物。然后，通過種子或者使用無性繁殖技術，所述植物可以被用于建立重復的代。不通過組織培養也可以產生轉基因植物。為了在一系列易于轉化或瞬時表達的宿主生物體中表達，本發明的調控元件也可以與目的編碼區連接。這樣的生物體包括但不限于植物(單子葉植物和雙子葉植物)例如但不限于玉米、谷類植物、小麥、大麥、燕麥、煙草、蕓苔(Brassica)、大豆、菜豆、豌豆、苜蓿、馬鈴薯、番茄、人參和擬南芥。用于這些生物體的瞬時表達、轉化和再生的方法已經在本領域中建立并為本領域技術人員已知。獲得轉化植物和再生植物的方法對本發明來說不是關鍵性的。“轉化”是指基因型顯性的遺傳信息、表型顯性的遺傳信息或者兩者同時在種間的轉移。從嵌合構建體轉移至宿主的種間轉移的遺傳信息可以是可遺傳的，則所述遺傳信息的轉移被認為是穩定的；或者所述轉移可以是瞬時的，則所述遺傳信息的轉移是不可遺傳的。本發明還包括合適的載體，所述載體含有適合于用在穩定的表達系統或瞬時的表達系統中的嵌合基因構建體。可以使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電穿孔等技術將本發明的構建體導入植物細胞。這些技術的綜述參見例如WeissbachandWeissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademyPress,NewYorkVIII,pp.421-463(1988)；GeiersonandCorey,PlantMolecularBiology,第2版·(1988);以及MikiandIyer,FundamentalsofGeneTransferinPlants.InPlantMetabolism,2ndEd.DT.Dennis,DHTurpin,DDLefebrve,DBLayzell(eds),Addisonffesly,LangmansLtd.London,pp.561-579(1997)。其他的方法包括直接DNA吸收、應用脂質體、電穿孔(例如使用原生質體)、顯微注射、微彈或晶須(microprojectilesorwhiskers)以及真空滲入。例如，參見Bilang，etal.(Gene100:247-250(1991)，Scheidetal.(Mol.Gen.Genet.228:104-112，1991)、Guercheetal.(PlantScience52:111-116,1987)、Neuhauseetal.(Theor.ApplGenet.75:30-36,1987)、Kleinetal.,Nature32770-73(1987)、Howelletal.(Science208:1265，1980)、Horschetal.(Science2271229-1231,1985)、DeBlocketal.,PlantPhysiology91:694-701,1989)、MethodsforPlantMolecularBiology(ffeissbachandffeissbach,eds.,AcademicPressInc.,1988)>MethodsinPlantMolecularBiology(SchulerandZielinski,eds.,AcademicPressInc.,1989)、LiuandLomonossoff(JVirolMeth,105:343-348,2002,);美國專利4，945，050,5,036，006和5，100，792;美國專利申請08/438，666(1995年5月10日提交)和07/951，715(1992年9月25日提交)，(所有這些文獻、出版物和專利通過引用的方式納入本文)。如下文所述，可以使用瞬時表達的方法來表達本發明的構建體(見LiuandLomonossoff,2002,JournalofVirologicalMethods,105:343-348;該文獻通過引用的方式納入本文)。這些方法可以包括例如但不限于農桿菌接種或農桿菌浸潤的方法，然而如上文所述，也可以使用其他的瞬時方法。通過農桿菌接種或農桿菌浸潤，包含所需核酸的農桿菌混合物進入到組織例如葉的胞間隙中、植物的地上部分(包括莖、葉和花)中、植物的其他部分(莖、根、花)中或全植株中。在通過表皮后，所述農桿菌將t-DNA拷貝轉染并轉移至細胞中。所述t-DNA以附加體的形式轉錄并且其mRNA被翻譯，使得在感染的細胞中產生目的蛋白，然而，t-DNA在核內的傳代是瞬時的。“目的基因”、“目的核苷酸序列”或“目的編碼區”是指任何在宿主生物體例如植物中表達的基因、核苷酸序列或編碼區。這些術語可以互換使用。這樣的目的核苷酸序列可以包括但不限于產物是用于飼料、食物或飼料和食物兩者中的工業用酶、蛋白添加劑、營養制劑、附加值產物或者它們的片段的基因或編碼區。目的核苷酸序列或編碼區也可以包括編碼有藥物活性的蛋白的基因，所述蛋白例如生長因子、生長調節劑、抗體、抗原以及它們的片段，或者它們的用于免疫或疫苗等的衍生物。這樣的蛋白包括但不限于白細胞介素(例如IL-I至IL-24、IL-26和IL-27中一種或多種)、細胞因子類(紅細胞生成素(EPO)、胰島素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或它們的組合)、干擾素類(例如干擾素α、干擾素β、干擾素Y、)、凝血因子(例如因子VIII、因子IX或tPAhGH)、受體、受體激動劑、抗體、神經多肽、胰島素、疫苗、生長因子(例如但不限于表皮生長因子、角質化細胞生長因子、轉化生長因子)、生長調節劑、抗原、自身抗原、它們的片段或它們的組合。如果目的基因編碼對植物有直接毒性或間接毒性的產物，那么通過以下的方式并使用本發明的方法可以減少整個植物中的該毒性在適當的組織或者在植物發育的適當階段選擇性地表達目的基因。目的編碼區或目的核苷酸序列可以在任何合適的植物宿主中表達，所述植物宿主包含本發明的核苷酸序列、核酸分子、遺傳構建體或質粒或者是被上述核酸轉化的。合適的宿主的實例包括但不限于擬南芥、農作物(包括例如蕓苔、蕓苔屬的多個種、玉米、煙草、苜蓿、馬鈴薯、人參、豌豆、燕麥、稻、大豆、小麥、大麥、向日葵和棉花)。通過表達重組Neu5Ac裂合酶或Neu5Ac合酶，在植物中證實了唾液酸例如Neu5Ac的合成。來自大腸桿菌(E.coli)的Neu5Ac裂合酶和來自空腸彎曲菌(C.jejuni)的NeuB2每個都在煙草BY2細胞的胞質中表達，在農桿菌介導轉化的苜蓿植株中表達，或者在植物細胞中瞬時表達。沒有觀察到所述重組蛋白的降解說明這些酶在該區室中是穩定的。在BY2細胞中表達的Neu5Ac裂合酶能夠在可逆反應中催化Neu5Ac裂解成D-ManNAc和丙酮酸。存在丙酮酸和ManNAc時也觀察到了Neu5Ac的合成。Neu5Ac裂合酶在pH7和25-37°C的范圍內有生物活性，這與植物胞質pH和多數重要作物的溫度是一致的。此外，存在外源Neu5Ac時進行的飼喂實驗證明所述酶在植物中是有功能的。當在煙草BY2細胞中表達來自空腸彎曲菌的Neu5Ac合酶(NeuB2)的時候，存在D-ManNAc和PEP的情況下觀察到了Neu5Ac的合成。NeuB2在苜蓿植物中的表達也形成功能性酶的累積。因此，微生物Neu5Ac裂合酶或Neu5Ac合酶在植物中的表達可導致在胞質中產生能合成Neu5Ac的酶。為了給Neu5Ac裂合酶或Neu5Ac合酶補充適當的氨基糖底物，在植物中共表達了一種能夠將內源GlcNAc轉換成ManNAc的差向異構酶。在這方面，功能性CMP_Neu5Ac合酶和CMP-Neu5Ac轉運蛋白在煙草BY2細胞中的表達已經有報道(Misakietal.，2006)。CMP-Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac轉運蛋白或者CMP_Neu5Ac合酶和CMP_Neu5Ac轉運蛋白兩者與NeuB2的共表達可以增加Neu5Ac的產量。N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)在植物中的合成可以通過多種方法實現。例如，ManNAc的合成可以通過在植物中表達UDP-GlcNAc2-差向異構酶(例如細菌UDP-GlcNAc2-差向異構酶)來實現，該酶在非可逆反應中將UDP-GlcNAc轉換成ManNAc。UDP-GlcNAc存在于胞質中，這是因為它為N-聚糖合成通路提供原料。ManNAc合成也可以通過表達其他來源的GlcNAc-2差向異構酶來實現。或者，ManNAc-6-磷酸可以在(轉基因植物中)用磷酸酶水解之后形成。利用這種方法，可在植物中表達GlcNAc-6-磷酸2-差向異構酶(例如細菌GlcNAc-6-磷酸2-差向異構酶)或哺乳動物UDP-GlcNAc2-差向異構酶/ManNAc激酶。為了確保來自胞質的N-聚糖的唾液酸化，可以在植物中共表達細菌CMP-Neu5Ac合酶或哺乳動物CMP-Neu5Ac合酶、哺乳動物CMP-Neu5Ac轉運蛋白、哺乳動物半乳糖轉移酶和哺乳動物唾液酸轉移酶(Misaki,R.，et.Al.2006)。以下的實施例將對本發明進行進一步說明。實施例方法在Eurogentec(Seraing,Belgium)用兔制備抗合成的FLAG序列多肽(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；SEQIDNO:1)的多克隆抗體。C18Bond-Elut固相萃取柱來自Varian(SugarIand,TX)。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5-α和根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404分別被用于煙草細胞或紫花苜猜(M.sativa)的克隆實驗和轉化中。普通煙草(Nicotianatabacum)栽培變種BrightYellow2(BY-2)細胞的培養如Gomordetal.(1998)所述。Neu5Ac裂合酶基因和neuB2基因的克隆以及植物表達載體的構建通過PCR擴增Neu5Ac裂合酶基因和neuB2基因。通過PCR從大腸桿菌Kl基因組DNA擴增Neu5Ac裂合酶基因，使用引物如下裂合酶-Pl5'-AATAGGCCATTACGGCCATGGCAACGAATTTACGTGG-3'(SEQIDNO6)和裂合酶-P25'-AATAGGCCGAGCGGCCTCACCCGCGCTCTTGCAT-3/(SEQIDNO:7)。對于neuB2基因，使用以下的引物獲得DNA片段neuB2-Pl5'-AATAGGCCATTACGGCCATGAAAAAAACTTTAATC-3'(SEQIDNO:8)和neuB2_P2:5'-AATAGGCCGAGGCGGCCTTACTCACGGATAAGCTC-3'(SEQIDNO:9)。將上述擴增的DNA分別被置于質粒載體pDNR-LIB中的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子控制之下(對于Neu5Ac裂合酶基因)和二元質粒載體pCAMBIA2300中(對于neuB2基因)的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子控制之下。將含有CaMV35S啟動子、Neu5Ac裂合酶和胭脂堿合酶(Nos)終止子的表達盒導入具有卡那霉素抗性基因的植物表達載體pBLTI121(Pagnyetal.,2000)中。為了產生pBLTINeu5Ac裂合酶-FLAG質粒和pBLTIneuB2_FLAG質粒，使用了為擴增在蛋白C-末端編碼有FLAG肽的基因而設計的4種下述引物裂合酶-FLAG-PI:5'-CGGGGTACCAGAGAGATGGCAACGAATTTACGTGGC-3'(SEQIDNO2),裂合酶-FLAG-P2:5'GCCGAGCTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCATCCCGCGCTCTTGCATCAACTG-3/(SEQIDNO3)，neuB2_FLAG_PI5'-CGGGGTACCAGAGAGATGAAAAAAACTTTAATCATCGC-3'(SEQIDNO:4)和neuB2-FLAG-P25'-GCCGAGCTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCATCTCACGGATAAGCTCATCTTC-3/(SEQIDNO5),通過PCR用30個循環的以下程序產生這些擴增的序列94°C變性I分鐘，58°C退火I分鐘以及72°C聚合3分鐘。將PCR產物克隆進pCR-BLUNTΙΙ-Τ0Ρ0(Invitrogen)。在植物細胞中表達重組蛋白之前，我們通過測序確認了所有經修飾的cDNA構建體。然后，用KpnI和SacI消化所述插入物，然后將其克隆進經KpnI-SacI消化的pBLTI121中。通過熱休克轉化將每種載體(pBLTI121或pCAMBIA2300)導入根瘤農桿菌株LBA4404中。在BY2細胞中表達將煙草BY2細胞在MurashigeandSkoog(1962)培養基中培養并用于轉化。將來源于pBLTI121的構建體轉化至農桿菌(LBA4404)中(HofgenandWillmitzer,1988)。在含IOOyg/mL卡那霉素的YEB培養基上選擇轉基因的農桿菌細胞，并用于轉化懸浮培養的煙草細胞(如Gomordetal.(1998)中所述)。在含抗生素(100μg/mL卡那霉素和250μg/mL噻孢霉素)的MS培養基中選擇并培養轉化體。從每種轉化體制備基因組DNA和mRNA，并且通過PCR和RT-PCR確認目標基因已插入到煙草的懸浮培養細胞中并在所述細胞中表達。進行免疫篩選后，產生重組蛋白的微愈傷組織被用于啟動轉基因細胞的懸浮培養(Gomordetal.，1998)。在苜蓿植物中表達苜蓿的轉化基本上按Tianetal.(Tianetal.,2002)的描述進行，并進行了如下的改動。使用根瘤農桿菌AGLl轉化苜蓿基因型R2336。用O.8-10D未稀釋的培養物進行共培養步驟，以及在Sh2K培養基中用3%的蔗糖代替I.5%的蔗糖。制備用于Neu5Ac裂合酶和neuB2活性測試的細胞提取物收集I克的BY2轉化體細胞懸浮培養4天的培養物或600mg的新鮮紫花苜蓿葉，并且在含蛋白酶抑制劑(Iμg/mL的胃蛋白酶抑制劑(pepstatine),Iμg/mL的E64和ImM的PMSF，Sigma)的溶液A(IOOmM的Tris-HCl緩沖液(pH=7.4))中破碎。然后在4°C下以IOOOOg離心細胞提取物10分鐘并用硫酸銨(終濃度80%)沉淀蛋白，然后用Spectra/Por膜(截留分子量10000道爾頓)相對于溶液B(IOOmMTris-HCl緩沖液，pH=7.4(用于Neu5Ac裂合酶測試)或者pH=8.5(用于NeuB2測試)和IOmM的MgCl2)透析。然后，將蛋白用于酶測試或免疫檢測。Neu5Ac裂合酶-FLAG和neuB2_FLAG的免疫檢測將蛋白溶解于變性緩沖液(20mMTris-HCl(pH6.8),0.3%β-巰基乙醇，5%(ν/ν)甘油和1%(w/v)SDS)中，煮沸5分鐘并通過SDS-PAGE在15%的聚丙烯酰胺凝膠中分離。然后將蛋白轉移至醋酸纖維素膜上。對于免疫檢測，用抗所述FLAG表位的兔抗血清與膜雜交。通過以下方式檢測蛋白用偶聯有辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體孵育，之后使用4-氯萘酹(4-chloronaphtol)或者用化學發光反應進行顯示。Neu5Ac裂合酶和合酶的測試通過將細胞提取物與4mMPEP、4mMNADH、20mMNaHCOjPIOmMDTE孵育來測試可溶性酶的活性。在10分鐘后，通過340nm下光吸收度的減少測定NADH的氧化。通過在轉化細胞提取物與Neu5Ac孵育后測定ManNAc的形成測試Neu5Ac裂合酶的裂合酶活性。在包含蛋白酶抑制劑(Iμg/mL胃蛋白酶抑制劑、Iμg/mLE64和ImMPMSF)和40mMNeu5Ac的溶液B(100mMTris-HCl緩沖液(pH=7.4)和IOmMMgCl2)中于37°C下孵育細胞提取物2小時。通過在轉化細胞提取物與ManNAc和丙酮酸孵育后測定Neu5Ac的形成來測試Neu5Ac裂合酶的合酶活性。在包含蛋白酶抑制劑(Iμg/mL胃蛋白酶抑制劑、Iμg/mLE64和ImMPMSF)以及20mMManNAc和40mM丙酮酸的溶液B(IOOmMTris-HCl緩沖液(pH=7.4)和IOmMMgCl2)中于37°C下孵育細胞提取物2小時。通過在轉化細胞提取物與ManNAc和PEP孵育后測定Neu5Ac的形成測試NeuB2的合酶活性。在包含蛋白酶抑制劑(Iμg/mL胃蛋白酶抑制劑、Iμg/mLE64和ImMPMSF)以及IOmMManNAc和IOmMPEP的溶液B(IOOmMTris-HCl緩沖液(pH=7.4)和IOmMMgCl2)中于37°C下孵育細胞提取物2小時。在80°C下加熱5分鐘終止所述反應，并且通過在C18Bond-Elut固相萃取柱上連續用水洗脫進行純化，冷凍干燥并用于GC-EI-MS分析。飼喂實驗4天的煙草BY2細胞與IOmMNeu5Ac或30mMManNAc在BY2培養基中于37°C下孵育2天，分別用于在體內測試Neu5Ac裂合酶或Neu5Ac合酶的活性。在2天后,用不含Neu5Ac或ManNAc的BY2培養基洗滌并收集BY2細胞。在70%的乙醇中將所述細胞加熱至70°C維持15分鐘以使酶失活,然后在波特勻衆器(potterhomogenizer)中研磨。在70°C將所述勻漿液用70%的乙醇洗滌兩次。剩下的沉淀和上清液被認為分別代表了細胞壁和胞質中游離的單糖。然后通過氣相色譜對上清液部分的單糖進行分析。GC分析對于酶測試，首先將所述反應混合液經過C18Seppack柱進行純化步驟。用100%的水洗脫單糖。在冷凍干燥后，用500yL2M無水(dry)甲醇鹽酸鹽在80°C將所述樣品進行16小時的甲醇分解。在將甲醇蒸發后，通過加入20μL的無水乙酸酐和20μL的吡啶將所述樣品再乙酰化。形成的N-乙酰甲基糖苷(甲酯)被干燥，然后被轉換成其TMS-衍生物并通過氣相色譜(GC)分離。所述氣相色譜儀配備有火焰電離檢測器、WCOT熔融二氧化硅毛細管柱(長25米，內直徑O.25毫米)，使用CP-Sil5CP作為固定相，氦氣作為氣體載體。爐溫程序為120°C下2分鐘，每分鐘升高10°C至160°C，每分鐘升高I.5°C至220°C，然后每分鐘升高20°C至280°C。通過峰積分對糖進行定量測定，并且使用由標準單糖建立的反應因子確定對應的摩爾值。在植物中的瞬時表達農桿菌的培養。在2mL含有25μg/mL羧芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的YEB或LB培養基中，于28°C下將包含含有上述目的DNA構建體的二元載體的農桿菌克隆培養24小時。用10μL的上述培養物作為起始接種物，用于產生25mL的YEB誘導培養基(YEB培養基，IOmM的2(N嗎啉代)乙磺酸(MES)，pH調整至5.6，25mg/L的羧芐青霉素，50mg/L的卡那霉素，20μM的乙酰丁香酮)的培養物。將后者在搖床(220rpm)培養箱中于28°C下培養18小時，或者培養至600nm的吸光度(0D600)達到O.8_1。非轉基因煙草的栽培。在溫室中，在基于泥炭的基質(AgroMix)上通過種子栽培本生煙草(Nicotianabenthamiana)和普通煙草(Nicotianatabacum)植物。幼苗起初被種植于苗圃中，然后被轉移至盆中。每天灌溉植物兩次，每次施以ISOppm的氮。溫室的條件是保持在白天25°C且晚上21°C，在長日照周期下(16小時光照/8小時黑暗的循環)使用20瓦特/平方米水平的人工光照照射植物。可以在不同的生長階段使用植物，但優選5周-8周的植物。構建體在煙草中的瞬時表達。在本發明中使用兩種瞬時表達的方法農桿菌接種或農桿菌浸潤。在兩種方法中，用外力使含有目的轉化-DNA(t-DNA)的兩種或三種農桿菌培養物的混合物進入葉的胞間隙中。在通過表皮的物理屏障后，所述農桿菌將感染鄰近細胞，將t-DNA拷貝轉移至所述植物細胞中。利用這些方法，t-DNA進入核是瞬時的，存在于所述t-DNA上的基因以附加體的形式轉錄并且其mRNA被翻譯，導致在轉化細胞中產生目的蛋白。農桿菌接種技術使用注射器產生的壓力將農桿菌混合物輸入至植物組織中，而農桿菌浸潤使用的是受控的真空條件。將按前文所述制備的農桿菌培養物在IOOOOg下離心8分鐘，重新懸浮于相同體積的接種培養液中(IOmM的MgC12，IOmM的MES，調整至pH5.6并且添加100μM的乙酰丁香酮)，并且在接種前在室溫下(RT，23°C)保持I小時。或者，在接種前可以將所述懸浮物在4°C保持24小時。本生煙草和普通煙草的瞬時轉化基本上按照Liu和LomonossofT(2002，JournalofVirologicalMethods,105:343-348)的描述進行，有如下的改動。對于上述的構建體的表達，接種兩種農桿菌菌株的混合物。第一種菌株包含上述克隆中的一種，第二種菌株包含來自于馬鈴薯病毒Y的受35S啟動子控制的沉默抑制子HcPro。在接種以后，將所述植物培養在溫室中。溫度保持為白天最低23°C和晚上21°C。每天灌溉植物兩次，每次施以180ppm的氮。在4-8天后進行生物量(biomass)的收集。從轉化的生物量制備可溶性蛋白提取物。在葉收集后直接進行分析或者在_80°C將所述生物量冷凍后對葉進行分析。稱取約O.I-Ig生物量的農桿菌接種葉或農桿菌浸潤葉，用于產生總蛋白液體提取物。使用下述幾種提取方法產生總蛋白提取物通過用研缽和杵研磨植物組織，通過使用polytron,或者通過在Retsch的MixerMill300(MM300)中將它研磨碎。將O.I-Ig的植物生物量轉移至干凈并預冷的研缽中。以I:3(w/v)的比例加入預冷的提取緩沖液(50mM的Tris，150mM的NaCl且pH7.4的緩沖液，并含有2mM的CaCl2和4%的丁醇)，還加入終濃度為ImM的PMSF和終濃度為10μM的胰凝乳蛋白酶抑制劑。用杵研磨葉，直至形成均勻的制品。然后將所述植物提取物轉移至I.5mL的微型管中，并且在4°C以20，OOOg離心20分鐘。或者，將O.Ig的植物組織和O.3mL的提取緩沖液加入到非滅菌的I.5mL微型管中。在每個管中加入鎢株。將管經過以3分鐘為周期的30Hz的攪動。重復所述周期2次。然后按上文的描述將所述植物提取物離心。或者，使用polytron將Ig的生物量在3mL的提取緩沖液中研磨碎。在離心之后將所述上清液轉移至干凈的微型管中并放置在冰上。最后，通過Bradford法使用BSA作為參照蛋白測定每份蛋白提取物的總蛋白含量。實施例I大腸桿菌Neu5Ac裂合酶在煙草BY2細胞中的表達將編碼來自大腸桿菌Kl(登錄號D00067)的Neu5Ac裂合酶的基因導入煙草BY2細胞。在使用含有大腸桿菌Kl的Neu5Ac裂合酶基因的質粒pBLTI121進行農桿菌介導的轉化后，產生轉基因的BY2愈傷組織。另外一個構建體在C-末端被FLAG表位標記，以使得可以對轉化體中的重組蛋白進行免疫檢測。通過RT-PCR分析經卡那霉素抗性選擇的轉化體的mRNA水平。得到了以下的結果48個轉化體中有36個表達Neu5Ac裂合酶轉錄物，50個轉化體中有30個表達Neu5Ac裂合酶-FLAG轉錄物。將含有最高mRNA表達水平的愈傷組織轉移至懸浮培養物中用于鑒定Neu5Ac裂合酶活性。通過蛋白印跡分析確定轉化的BY2細胞的蛋白胞質提取物中存在的Neu5Ac裂合酶-FLAG。使用抗FLAG抗體，在所述轉化細胞中特異性地免疫檢測到了表觀分子量為32kDa的單條蛋白帶(圖Ia)。對來自表達Neu5Ac裂合酶和Neu5Ac裂合酶-FLAG的懸浮培養的BY2細胞的可溶性蛋白提取物進行了酶測試。兩種提取物都顯示有裂合酶活性。還對從表達未標記裂合酶的細胞分離的蛋白提取物進行了分析。首先，在存在Neu5Ac的情況下孵育這些提取物以研究它們的裂解酶活性。圖Ib和Ic顯示不存在Neu5Ac(圖Ib)或存在Neu5Ac(圖Ic)的情況下，在37°C和pH7下孵育Neu5Ac裂合酶蛋白提取物形成的終產物的GC譜。當所述提取物與Neu5Ac孵育時，清晰地檢測到三個信號(峰I是內源性信號的肩峰)。這些信號洗脫的保留時間近似于標準品ManNAc的吡喃糖形式(峰I)和呋喃糖形式(峰2和3)的保留時間。通過對所述樣品進行的電子碰撞質譜偶聯氣相色譜(GC-EIMS)確認了這些信號為ManNAcp(圖Ie)和ManNAcf(圖If)的1_0_甲基全甲硅烷基衍生物。m/z=173和186的特征離子為包含氮原子(通常出現在氨基糖中)的片段。將來自野生型煙草BY2細胞的胞質蛋白提取物與Neu5Ac在類似的條件下孵育沒有導致任何ManNAc的形成(數據未顯示)，因此證明在植物中沒有內源性裂解酶的活性。這些數據表明，以大腸桿菌Neu5Ac裂合酶基因轉化的BY2細胞表達了能夠將Neu5Ac切割成D-ManNAc的功能性酶。基于在4-10pH范圍內對測試中所產生的D-ManNAc進行的GC定量(數據未顯示)，所述重組酶的最適PH被確定為約7。此外，所述重組酶表現出了溫度依賴的活性，在25-37°C的范圍內觀察到高的裂解酶活性。在pH7和37°C，來自轉化細胞的可溶性蛋白提取物I小時可由10微摩的Neu5Ac生成O.5微摩的ManNAc。低于15°C時，僅檢測到了剩余活性。通過將轉化煙草BY2細胞的蛋白提取物在pH7和37°C下與D-ManNAc和丙酮酸孵育，測定了重組Neu5Ac裂合酶合成Neu5Ac的能力。圖2a和2b分別顯示不存在或存在底物的情況下孵育后的終產物的GC譜。與對照譜(圖2a)相比，存在D-ManNAc和丙酮酸的情況下進行的反應的GC譜顯示的信號在保留時間上預計為Neu5Ac(圖2b中的框)。該信號的電子碰撞質譜(EMS)(圖2c)顯示，Neu5Ac片段特異性地具有m/z=298和420的特征離子，也具有被指定為含氮片段的m/z=186的離子。這些數據表明，所述重組裂合酶能夠在存在D-ManNAc和丙酮酸的情況下合成Neu5Ac。通過用IOmMNeu5Ac培養煙草BY2細胞確定了所述Neu5Ac裂合酶在植物中的活性。也研究了Neu5Ac對煙草BY2細胞的毒性，通過使用碘化丙啶和二乙酸熒光素的細胞活力測試，在48小時的時間內沒有出現毒性效應。在23°C-37°C的溫度范圍內，在48小時以后通過用GC分析胞質單糖確定D-ManNAc的形成。對所有的處理都檢測了D-ManNAc(圖Id)。用GC對D-ManNAc的定量顯示在37°C時該氨基糖的含量比23°C時增加25倍。這些體內實驗可證明，所述Neu5Ac裂合酶在植物中是有生物活性的，并且能夠作用于外源提供的底物。空腸彎曲桿菌NeuB2在煙草BY2和苜蓿植物中的表達來自空腸彎曲桿菌(登錄號NC002163)的Neu5Ac合酶(NeuB2)催化ManNAc和PEP縮合形成Neu5Ac。在使用含有neuB2cDNA的質粒pBLTI121進行農桿菌介導的轉化后，產生轉基因的BY2的愈傷組織。為了免疫檢測所述蛋白，另外一個構建體在C-末端被FLAG表位標記。通過RT-PCR分析經卡那霉素抗性選擇的轉化體的mRNA水平。將含有最高mRNA表達水平的愈傷組織轉移至懸浮培養物中用于分析。然后，通過對由NeuB2-FLAG序列轉化的BY2細胞分離的可溶蛋白提取物進行的蛋白印跡分析，確定了NeuB在轉化的BY2細胞中的累積。如圖3a所示，抗FLAG抗體特異性識別分子量為37kDa的單條蛋白帶，該分子量與所述合酶的預期分子量一致。還通過農桿菌介導的轉化將neuB2導入苜蓿植物，并且在體外再生植物(Tianetal.，2002)。34株轉化的植物中有29株被證明表達neuB2轉錄物。在對表達所述細菌Neu5Ac合酶的轉化細胞或植物進行分析之前，研究了內源性Neu5Ac合酶活性的出現。將來自野生型煙草BY2細胞和苜蓿植物的可溶蛋白提取物與D-ManNAc和PEP—起孵育。在所述測試中形成的單糖經GC分離并通過GC-EIMS進行特征確定。沒有檢測到被指定為Neu5Ac的峰或EIMS特征離子，這表明植物不表達能夠將PEP縮合到D-ManNAc上形成Neu5Ac的內源性的酶。通過將D-ManNAc和PEP與從轉化有neuB2基因的煙草BY2細胞或苜蓿植物中分離的可溶蛋白提取物進行孵育，確定了在植物中表達的重組NeuB2的合酶活性。圖3b和3c顯示在沒有D-ManNAc和PEP(圖3b)或有D-ManNAc和PEP(圖3c)的情況下，在pH=8和37°C下孵育轉化的苜蓿提取物得到的GC譜。在與所述合酶的底物孵育之后，特異地檢測到在Neu5Ac的預期保留時間洗脫得到的峰。該峰的EIMS表現出的裂解譜類似于標準品Neu5Ac的裂解譜，具有m/z=298和420的特征離子。在不存在D-ManNAc的條件下孵育后，在GC譜的相應區域的EI-MS譜圖中沒有檢測到這些離子(圖3b)。對表達NeuB2或NeuB2_FLAG序列的煙草BY2細胞的分析得到相同的結果。因此，neuB2在煙草BY2細胞和苜蓿植物中的表達都導致功能性Neu5Ac合酶的產生。參考文獻Angatta,T.andVarki,A.(2002)Chemicaldiversityinthesialicacidsandrelateda—ketoacidsanevolutionaryperspertive.ChemRev.,102,439-469.Bakker,H.,Bardor,M.,Molhoff,J.,Gomord,V.,Elbers,I.,Stevens,L.,Jordi,ff.,Lommen,A.,Faye,L.,Lerouge,P.andBoschD.(2001)Humanizedglycansonantibodiesproducedbytransgenicplants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98,2899-2904.BardorM,FaveeuwC,FitchetteA_C,GilbertD,GalasL,TrotteinF,FayeLandLerougeP.(2003)Immureactivityinmammalsoftwotypicalplantglyco-epitopes,core-aIpha(l,3)-fucoseandcore-xylose.Glycobiology,13,427-434.Bravo,I.G.,Garcia-Vallve,S.,Romeu,A.andReglero,A.(2004)Prokaryoticoriginofcytidyltransferasesand□-ketoacidsynthases.TrendsinMicrobiol.,12,120-128.Busse,U.，Levee,V.，Trepanier,S.andVezina,L.(2001)Productionofantibodiesinalfalfa(Medicagesativa).InMolecularFarmingofplantsandanimalforhumanandveterinarymedicine.(Erickson,L.,ed),pp199-219.J.Wileyandsons,NewYork.DelmasF,PetitJ,JoubesJ,SevenoM,PaccaletT,HernouldM,LerougeP,MourasAandChevalierC.(2003)Thegeneexpressionandenzymeactivityofplant3-deoxy-D-manno-2-octulosonicacid-8-phosphatesynthasearepreferentiallyassociatedwithcelldivisioninacellcycle-dependentmanner.PlantPhysiol.,133,348-360.Gomord,V.,Fitchette-LaineiA.-C.，Denmat，L_A.,Michaud,D.,andFaye,L(1998)Productionofforeignproteinsintobaccocellsuspensionculture.InMethodsinBiotechnology,C.C.CunninghamandA.J.R.Porter，eds.Totowa,NJ,HumanaPress，pp.155-164.Hofgen,R.andWillmitzerL.(1988)StorageofcompetentcellsforAgrobacteriumtransformation.NucleicAcidsRes16,9877.Kelm,S.AndSchauer,R.(1997)Sialicacidsinmolecularandcellularinteractions.Int.Rev.Cytol.175，137-240.Ko,K.，Tekoah,Y.，Rudd,P.M.，Harvey,D.J.，Dwek，R.A.，Spitsin，S.，Hanlon，C.A.，RupprechtC.，Dietzschold，B.，Golovkin，M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